This study was carried out to evaluate the antiobesity effects of Crataegus fructus in 3T3-L1 adipocytes and mice fed a high fat diet (high fat 45% cal). The inhibitory effect of methanol extract from Crataegus fructus on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes was quantified using Oil red O stainin...
This study was carried out to evaluate the antiobesity effects of Crataegus fructus in 3T3-L1 adipocytes and mice fed a high fat diet (high fat 45% cal). The inhibitory effect of methanol extract from Crataegus fructus on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes was quantified using Oil red O staining. Compared with the control, lipid accumulation was significantly decreased by 10-25% with treatment with Crataegus fructus extract at a concentration of 600-2,000 ug/ml. Three-week old ICR mice (n=24) were randomly divided into four groups (T0: normal diet, T1: high fat diet, T2: high fat diet and 50 ug of Crataegus fructus extract, T3: high fat diet and 100 ug of Crataegus fructus extract) and were fed an experimental diet for 5 weeks. At the end of the experiment, body weight gain in the T1 group (3.9${\pm}$0.24 g) was higher than that in the T0 group (2.56${\pm}$0.14 g), while body weight gain in the T2 (3.02${\pm}$0.25 g) and T3 (2.58${\pm}$0.16 g) groups was significantly reduced as compared with that of the T1 group. Moreover, liver weight in the T1 (4.8${\pm}$0.17 g) and T2 (4.8${\pm}$0.16 g) groups was significantly higher than that of the T0 (4.05${\pm}$0.16 g) and T3 (4.57${\pm}$0.10 g) groups, while kidney weight was significantly lower than that of the T0 and T3 groups (p<0.05). The levels of total cholesterol and triglyceride in serum in the T2 and T3 groups were significantly decreased compared to the T1 group. These results suggest that Crataegus fructus can be used as functional materials in food and medicine.
This study was carried out to evaluate the antiobesity effects of Crataegus fructus in 3T3-L1 adipocytes and mice fed a high fat diet (high fat 45% cal). The inhibitory effect of methanol extract from Crataegus fructus on lipid accumulation in 3T3-L1 adipocytes was quantified using Oil red O staining. Compared with the control, lipid accumulation was significantly decreased by 10-25% with treatment with Crataegus fructus extract at a concentration of 600-2,000 ug/ml. Three-week old ICR mice (n=24) were randomly divided into four groups (T0: normal diet, T1: high fat diet, T2: high fat diet and 50 ug of Crataegus fructus extract, T3: high fat diet and 100 ug of Crataegus fructus extract) and were fed an experimental diet for 5 weeks. At the end of the experiment, body weight gain in the T1 group (3.9${\pm}$0.24 g) was higher than that in the T0 group (2.56${\pm}$0.14 g), while body weight gain in the T2 (3.02${\pm}$0.25 g) and T3 (2.58${\pm}$0.16 g) groups was significantly reduced as compared with that of the T1 group. Moreover, liver weight in the T1 (4.8${\pm}$0.17 g) and T2 (4.8${\pm}$0.16 g) groups was significantly higher than that of the T0 (4.05${\pm}$0.16 g) and T3 (4.57${\pm}$0.10 g) groups, while kidney weight was significantly lower than that of the T0 and T3 groups (p<0.05). The levels of total cholesterol and triglyceride in serum in the T2 and T3 groups were significantly decreased compared to the T1 group. These results suggest that Crataegus fructus can be used as functional materials in food and medicine.
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문제 정의
본 연구에서는 건강기능식품 및 의약품 원료로 사용될 수 있는 식물자원 중 산사자를 메탄올에 추출하여 3T3-L1 지방세포에 대한 산사자 추출물의 세포독성과 산사자 추출물이 지방세포 분화에 미치는 영향을 관찰하고 고지방식이로 비만이 유도된 흰쥐에 산사자 추출물을 급여하여 체중변화와 혈청내 중성지방과 총 콜레스테롤 함량을 확인하였으며 이러한 결과를 바탕으로 산사자 추출물의 항비만 효과를 검증하고자 하였다.
제안 방법
12-well plate에서 24시간 동안 배양된 3T3-L1 세포에 산사자 추출물을 0, 200, 400, 600, 800, 1,000, 2,000 ug/ml의 농도로 첨가한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양한 다음 Hank’s balanced salt solution에 용해시킨 50 mg/ml MTT 용액을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.
Louis, MO, USA)를 처리하였고 1,000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음 1×106 cell 씩 12-well plate에 분주하여 배양하였다. 3T3-L1 지방세포의 분화는 10% FBS와 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 0.5 uM dexamethasone, 10 ug/ml insulin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)이 첨가된 DMEM 배지에서 유도하였으며 2일 후에 10% FBS와 10 ug/ml insulin이 포함된 DMEM 배지로 교환하고 다시 10% FBS를 포함한 DMEM 배지에서 3일 동안 배양하여 80% 이상의 세포가 분화되었음을 확인하였다.
중국산 산사자 메탄올 추출물이 중성지방에 미치는 영향은 분화된 3T3-L1 세포에 0, 200, 400, 600, 800, 1,000, 2,000 ug/ml의 중국산 산사자 메탄올 추출물을 처리하여 48시간 동안 배양한 후 PBS로 세척한 다음 Cacodylate buffer (2% formaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, 0.025% calcium chloride, 5% sucrose)로 4℃에서 30분간 고정하여 조사하였다. 고정된 세포는 PBS로 세척한 후 4℃에서 Oil-red O 염색시약 (Sigma Co.
실험동물은 3주령의 수컷 ICR mouse를 효창사이언스(Daegu, Korea)로부터 분양받아 2주일간 정상식이(AIN-93G)로 적응시킨 후 실험구별로 각각 6마리씩 4군으로 나누어 시험하였으며 실험식이의 조성은 Table 1과 같다. 산사자 메탄올 추출물은 500 ug/ml과 1,000 ug/ml의 농도로 물에 희석한 다음 100 ul씩 실험구에 경구투여하였으며 대조구인 high fat 45% cal 고지방식이군은 산사자 메탄올 추출물 대신 물을 100 ul 경구투여하였다. 각 처리구는 T0 (대조구, AIN-93G 정상식이), T1 (대조구, high fat 45% cal 고지방식이와 물 100 ul), T2 (실험구, high fat 45% cal 고지방식이와 500 ug/ml 산사자 메탄올 추출물 100 ul), T3 (실험구, high fat 45% cal 고지방식이와 1,000 ug/ml 산사자 메탄올 추출물 100 ul)로 나누어 5주동안 사육하였다.
식이사료와 물은 자유급식하였으며 사육실의 온도는 23±2℃, 습도는 55±5%로 유지하였고 명암은 12시간 간격으로 조절하였다.
식이사료와 물은 자유급식하였으며 사육실의 온도는 23±2℃, 습도는 55±5%로 유지하였고 명암은 12시간 간격으로 조절하였다. 실험동물의 체중은 일주일에 한 번씩 일정한 시간에 측정하였고 식이 섭취량은 매일 일정한 시간에 식이 급여량과 식이 잔여량의 차이를 계산하여 구하였으며 음수량도 매일 일정한 시간에 식이섭취량과 동일한 방법으로 측정하였다.
실험동물은 12시간 동안 절식시킨 다음 ethyl ether로 마취하였고 채혈은 심장에서 하였으며 혈청은 채혈한 혈액을 실온에서 30분간 방치한 후 3,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 분리하였다. 분리한 혈청의 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 네오딘의학연구소(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 실험동물의 간과 신장은 채혈 후 즉시 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
분리한 혈청의 총 콜레스테롤과 중성지방 농도는 네오딘의학연구소(Seoul, Korea)에 의뢰하여 분석하였다. 실험동물의 간과 신장은 채혈 후 즉시 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
중국산 산사자 메탄올 추출물의 세포독성은 3T3-L1 지방세포에 0-2,000 ug/ml 농도 범위의 중국산 산사자 추출물을 처리한 후 MTT assay를 수행하여 확인하였으며 중국산 산사자 추출물 대신 DMSO를 사용한 대조구의 cell viability에 대한 백분율로 나타내었다(Fig. 1). 3T3-L1 지방세포에 200, 400, 600, 800, 1,000 ug/ml의 중국산 산사자 추출물을 처리한 후 대조구와 비교하였을 때 3T3-L1 지방세포의 cell viability는 각각 99%, 98%, 96%, 95%, 90%였으며 2,000 ug/ml의 중국산 산사자 추출물을 처리하였을 때는 80%의 cell viability를 나타내었다(p<0.
산사자 메탄올 추출물은 500 ug/ml과 1,000 ug/ml의 농도로 물에 희석한 다음 100 ul씩 실험구에 경구투여하였으며 대조구인 high fat 45% cal 고지방식이군은 산사자 메탄올 추출물 대신 물을 100 ul 경구투여하였다. 각 처리구는 T0 (대조구, AIN-93G 정상식이), T1 (대조구, high fat 45% cal 고지방식이와 물 100 ul), T2 (실험구, high fat 45% cal 고지방식이와 500 ug/ml 산사자 메탄올 추출물 100 ul), T3 (실험구, high fat 45% cal 고지방식이와 1,000 ug/ml 산사자 메탄올 추출물 100 ul)로 나누어 5주동안 사육하였다. 식이사료와 물은 자유급식하였으며 사육실의 온도는 23±2℃, 습도는 55±5%로 유지하였고 명암은 12시간 간격으로 조절하였다.
대상 데이터
미분화된 3T3-L1 지방세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB 10092)으로부터 분양받아 사용하였고 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO, Rockvile, MD, USA)과 1%의 penicillin-streptomycin (Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, GIBCO) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였으며 2일마다 배양액을 교환하였다.
중국산 산사자(Crataegus fructus)는 서울 경동시장 약재도매상가에서 구입한 다음 분쇄하여 사용하였으며 식물표본은 식물학적 검정을 마친 후 경남과학기술대학교 생물신소재공학실험실 표본실(GNTC-001)에 보관하였다. 산사자 메탄올 추출물(639 g)은 분쇄한 산사자 2 kg을 메탄올 16 l에 넣고 상온에서 3회 반복 추출하여 얻은 추출액을 Watman filter paper(No.
Louis, MO, USA)가 mitochondria 효소에 의해 불용성인 보라색의 formazan으로 변하는 반응을 이용하여 세포수의 변화를 추정하는 방법으로 확인하였다[10]. 중국산 산사자 메탄올 추출물은 DMSO에 녹인 후 200-2,000 ug/ml 농도로 희석한 다음 0.2 um membrane filter (Sartorius, USA)로 여과하여 사용하였다. 12-well plate에서 24시간 동안 배양된 3T3-L1 세포에 산사자 추출물을 0, 200, 400, 600, 800, 1,000, 2,000 ug/ml의 농도로 첨가한 후 24시간 동안 37℃, 5% CO2 조건으로 배양한 다음 Hank’s balanced salt solution에 용해시킨 50 mg/ml MTT 용액을 첨가하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다.
실험동물은 3주령의 수컷 ICR mouse를 효창사이언스(Daegu, Korea)로부터 분양받아 2주일간 정상식이(AIN-93G)로 적응시킨 후 실험구별로 각각 6마리씩 4군으로 나누어 시험하였으며 실험식이의 조성은 Table 1과 같다. 산사자 메탄올 추출물은 500 ug/ml과 1,000 ug/ml의 농도로 물에 희석한 다음 100 ul씩 실험구에 경구투여하였으며 대조구인 high fat 45% cal 고지방식이군은 산사자 메탄올 추출물 대신 물을 100 ul 경구투여하였다.
데이터처리
실험결과의 평균값과 표준오차는 SAS (Statistical analysis system, USA) program을 사용하여 구하였고 Duncan’s 다중검정법으로 5% 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
실험동물의 증체량은 처리구별 개체 체중으로 비교하였으며 사료섭취량은 처리구별 개체 섭취량의 평균값으로 비교하였다. 실험결과의 평균값과 표준오차는 SAS (Statistical analysis system, USA) program을 사용하여 구하였고 Duncan’s 다중검정법으로 5% 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.
2)Values are expressed as mean±SD (n=6), Values with different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Values are expressed as mean±SD (n=3), Values with different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
Values are expressed as mean±SD (n=6), Values with different superscript letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.
이론/모형
The 3T3-L1 adipocytes were incubated for 24 hr in DMEM media with different concentration of methanol extract form Crataegus fructus. The cell viability was determined using MTT assay. Values are expressed as mean±SD (n=3), Values with different superscript letters are significantly different at p<0.
중국산 산사자 메탄올 추출물이 지방세포의 중성지방에 미치는 영향은 중성지방만을 붉은색으로 염색하는 Oil-red O 염색법으로 중성지방 함량을 측정하여 확인하였으며 대조구의 중성지방 함량에 대한 백분율로 나타내었다(Fig. 2). 3T3-L1지방세포에 중국산 산사자 메탄올 추출물을 0-2,000 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 3T3-L1 지방세포의 중성지방 함량은 200 ug/ml과 400 ug/ml의 농도에서는 대조구와 큰 차이를 나타내지 않았으나 600-2,000 ug/ml의 농도범위에서는 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.
성능/효과
3T3-L1지방세포에 중국산 산사자 메탄올 추출물을 0-2,000 ug/ml의 농도로 처리하였을 때 3T3-L1 지방세포의 중성지방 함량은 200 ug/ml과 400 ug/ml의 농도에서는 대조구와 큰 차이를 나타내지 않았으나 600-2,000 ug/ml의 농도범위에서는 대조구에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
3T3-L1 지방세포에 200, 400, 600, 800, 1,000 ug/ml의 중국산 산사자 추출물을 처리한 후 대조구와 비교하였을 때 3T3-L1 지방세포의 cell viability는 각각 99%, 98%, 96%, 95%, 90%였으며 2,000 ug/ml의 중국산 산사자 추출물을 처리하였을 때는 80%의 cell viability를 나타내었다(p<0.05).
실험식이 급여 전 체중은 실험구별로 큰 차이를 나타내지 않았으나 급여 2주 후부터는 T0 (AIN-93G 정상식이)군보다 T1 (high fat 45% cal 고지방식이와 물 100 ul)군의 체중이 유의적으로 증가하기 시작하였으며 T2 (high fat 45% cal 고지방식이와 500 ug/ml 중국산 산사자 메탄올 추출물 100 ul)군과 T3 (high fat 45% cal 고지방식이와 1,000 ug/ml 중국산 산사자 메탄올 추출물 100 ul)군의 체중은 유의적으로 감소하였다(p<0.05).
고지방식이와 중국산 산사자 메탄올 추출물을 급여한 T3군(143 mg/dl)의 혈청 내 총 콜레스테롤 함량은 고지방식이만을 급여한 T1군(164 mg/dl)보다 24.47% 감소하였으며(p<0.05) 이것은 중국산 산사자 메탄올 추출물의 농도가 높을수록 혈청 내 총 콜레스테롤 함량은 감소한다는 것을 나타낸 결과이다.
실험동물의 간 무게는 T0군보다 T1군과 T2군에서 높게 나타났으나 T3군에서는 유의적으로 감소하였으며(p<0.05) T1과 T2의 신장 무게는 T0보다 낮게 나타났으나 T3군의 신장 무게는 T0군과 유사하게 나타났다(p<0.05).
05). 특히 T3군은 T0군과 유사한 증체량을 나타내었으며 고지방식이로 비만이 유도된 실험동물을 대상으로 중국산 산사자 추출물을 급여할 경우 체중 증가가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 실험동물의 식이섭취량은 모든 실험구에서 유사한 경향을 나타내었다(p<0.
Rhee 등[24]은 일반적으로 과도한 지방섭취는 간에서 지질대사의 이상을 초래하여 지질의 침착이 일어나고 이로인해 간 무게가 증가하고 간에서의 지질과 콜레스테롤 함량이 증가한다고 보고하였으며 녹차를 급여할 경우 녹차의 catechin에 의해 간에서 지방합성이 억제되어 항비만 효과를 나타낸다고 보고하였다. 본 실험에서도 정상식이군에 비해 고지방식이군의 간 무게가 증가한 경향을 나타내었으며 중국산 산사자 추출물을 급여한 처리구에서는 간 무게가 감소하는 경향을 나타내었다.
05). 따라서 중국산 산사자 추출물은 고지방식이로 비만이 유도된 실험동물의 혈청 내 총 콜레스테롤과 중성지방 함량을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과는 일반적으로 포화지방산이 많이 함유된 동물성지방의 섭취로 혈중 콜레스테롤 농도가 증가된다는 Kim 등[25]의 연구결과와 일치하며 Rhee 등[24]은 녹차를 급여할 경우 혈중 콜레스테롤 농도가 감소하는데 이는 녹차의 catechin에 의해 micelle의 용해도가 감소하여 소장에서의 콜레스테롤 흡수가 부분적으로 억제되기 때문이라고 보고하였다.
후속연구
05). 따라서 중국산 산사자 메탄올 추출물은 3T3-L1 지방세포에 대한 세포독성이 낮을 뿐만 아니라 지방세포의 중성지방 생성을 억제할 수 있기 때문에 중국산 산사자는 항비만 효과를 나타내는 기능성 식품 및 의약품 개발을 위한 천연 식물 자원으로 이용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비만은 무엇인가?
비만은 지방세포(adipocyte) 내 중성지방 크기가 증대하거나 지방세포 수가 증가한 것이며 지방세포 내 중성지방의 크기가 증대하게 되면 운동이나 식이를 통하여 축적된 중성지방을 분해할 수 있지만 지방세포 수가 증가하여 비만이 유발된 경우에는 생성된 지방세포를 파괴해야 하므로 치료에 많은 어려움이 있다. 일반적으로 비만치료를 위해서는 식이, 운동, 행동요법을 통한 생활습관의 개선이 필요하지만 대부분이 약물처방이나 외과적 수술요법을 병행하여 비만을 예방, 치료하고 있다[2].
비만치료를 위해 사용되고 있는 비만 치료제는 무슨 부작용을 가지고 있는가?
일반적으로 비만치료를 위해서는 식이, 운동, 행동요법을 통한 생활습관의 개선이 필요하지만 대부분이 약물처방이나 외과적 수술요법을 병행하여 비만을 예방, 치료하고 있다[2]. 비만 치료제는 여러 작용기전에 따라 개발되고 있지만 현재 시판되고 있는 비만 치료제는 중추신경계에 작용하여 식욕을 억제시키거나 지방의 소화를 억제하여 체외로 배출하는 약물이며 위장장애, 복부팽만, 구갈, 불면증, 두통, 혈압상승 등의 부작용을 야기한다고 보고되고 있으며[11] 일부는 항정신성 의약품으로 분류되어 있다. 이와 같은 합성 의약품 유래 비만 치료제의 문제점에도 불구하고 비만인구의 증가와 함께 비만치료제의 수요는 급격하게 증가하고 있는 실정이다.
비만은 무슨 질병을 유발하는가?
비만은 신체활동과 성장에 필요한 에너지보다 칼로리 섭취가 초과되어 과잉섭취된 에너지가 중성지방의 형태로 지방조직에 축적된 열량 불균형상태를 말하며[29] 선진국으로 갈수록 증가하는 경향을 보이고 있다. 최근 우리나라에서도 식단의 서구화로 각종 동물성 가공 식품의 섭취량이 증가하여 비만 인구가 급속히 증가하였으며 비만은 심혈관계질환, 당뇨, 고혈압, 고지혈증, 담석증 등의 질병을 유발할 뿐만 아니라 정신건강에도 영향을 미칠 수 있으므로 이에 대한 대책마련이 필요하다[1,18,31].
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