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제안 방법
- 분리균의 항생제 감수성 조사는 디스크 확산법을 사용하여 측정하였다. McFarland 0.5관에 맞춘 세균현탁액을 Mueller Hinton II agar (MHA; Becton Dickinson) 배지에 접종한 후 각각의 항생제가 함유된 디스크를 올려놓고 37℃에서 16-18시간 배양한 후 억제대의 직경을 측정하였다. 감수성, 중간내성, 저항성 기준은 CLSI [7] 기준으로 하였으며 매 시험마다 양성 대조 균주로 Staphylococcus aureus ATCC 25923을 사용하였다.
- 독소 유전자와 항생제 내성을 분석하기 위해 사용된 Staphylococcus aureus는 혈액, 객담, 소변과 농에서 분리한 99개 균주를 사용하였다. Oxacillin에 대한 내성과 mecA 유전자의 보유여부를 이용하여 MRSA와 MSSA균주를 확인하였다. MRSA는 75개 균주(혈액과 객담, 각각 20균주; 소변, 19균주;농, 16균주)를 그리고 MSSA는 24개 균주(혈액, 8균주; 객담, 4균주; 소변, 10균주; 농, 2균주)를 사용하였다(Table 1)
- mecA 및 독소 유전자의 검사는 기존에 알려진 primer (Table 2)을 이용하여 multiplex PCR 조건으로 증폭하였다[25]. PCR 반응은 PCR thermal cycler TP 600 (TaKaRa, Japan)를 이용하였으며, PCR 산물은 2% agarose gel에 전기영동한 후 확인하였다.
- 본 연구는 2009년 7월부터 2009년 12월까지 순천 한 병원의 환자 검체로부터 분리된 MRSA와 methicillin 감수성 Staphylococcus aureus (MSSA) 균주을 대상으로 장독소를 비롯하여, 표피박탈성독소, 독성 쇼크 증상 독소 1, leukocidin 유전자들을 분자생물학적 기술인 PCR 기술을 이용하여 검색하였다. 또한 독소 유전자 분포를 통해 이들 균주들 간의 분자생물학적 연관성을 파악하고 독소 유전자와 항생제에 대한 내성과의 관계를 조사하였다.
- 분리된 세균 중 coagulase 및 catalase시험[32]에 양성을 나타내는 균주들을 선별하였다. 선별된 균주들을 Vitek 32 GPI kit (BioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다. 대조균주로는 Staphylococcus aureus ATCC 29213을 사용하였다.
- 순천 소재 1개 병원의 미생물검사실에서 각기 다른 환자들의 검체로부터 분리된 MRSA 75 개 균주와 MSSA 24개 균주의 독소유전자 분포와 항생제에 대한 내성의 빈도를 분석하였다.
- 증폭된 산물이 기존에 알려진 독소 유전자와 동일한 염기서열인지 확인하기 위해 염기서열을 분석하였으며 결정된 독소 유전자 염기서열의 유사도는 Genbank (NCBI)에 등록된 기존의 독소 유전자의 염기서열과 비교하였다.
대상 데이터
- 2009년 7월부터 12월까지 전남 순천 소재 1개 병원의 내원 및 입원환자로부터 채취한 4가지 검체(혈액, 객담, 농, 소변)로부터 세균을 분리하였다(Table 1). 세균의 분리는 혈액한천 (6% 혈액 함유) 배지를 이용하여 37℃에서 16–18시간 배양하여 사용하였다.
- 2개 이상의 독소유전자를 보유한 MRSA 균주는 44개였다. 다른 보고에서도 대부분의 MRSA균주가 2-4개의 독소유전자를 동시에 보유하고 있다는 것과 일치한다[15,18].
- Oxacillin에 대한 내성과 mecA 유전자의 보유여부를 이용하여 MRSA와 MSSA균주를 확인하였다. MRSA는 75개 균주(혈액과 객담, 각각 20균주; 소변, 19균주;농, 16균주)를 그리고 MSSA는 24개 균주(혈액, 8균주; 객담, 4균주; 소변, 10균주; 농, 2균주)를 사용하였다(Table 1)
- Oxacillin에 대한 MIC 판정기준은 4 μg/ml 이상을 사용하였다. MRSA로 판명된 균주 중 mecA가 검출되지 않은 2개 균주를 제외한 75개 균주를 MRSA로 최종 확인하였다. 순수 분리된 세균의 계대 배양은 tryptic soy agar(TSA, Becton Dickinson) 배지를 이용하였다.
- 5관에 맞춘 세균현탁액을 Mueller Hinton II agar (MHA; Becton Dickinson) 배지에 접종한 후 각각의 항생제가 함유된 디스크를 올려놓고 37℃에서 16-18시간 배양한 후 억제대의 직경을 측정하였다. 감수성, 중간내성, 저항성 기준은 CLSI [7] 기준으로 하였으며 매 시험마다 양성 대조 균주로 Staphylococcus aureus ATCC 25923을 사용하였다.
- 선별된 균주들을 Vitek 32 GPI kit (BioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다. 대조균주로는 Staphylococcus aureus ATCC 29213을 사용하였다. 이 때 동일 환자로부터 반복 분리된 균주는 제외하였다.
- 독소 유전자와 항생제 내성을 분석하기 위해 사용된 Staphylococcus aureus는 혈액, 객담, 소변과 농에서 분리한 99개 균주를 사용하였다. Oxacillin에 대한 내성과 mecA 유전자의 보유여부를 이용하여 MRSA와 MSSA균주를 확인하였다.
- 본 연구는 2009년 7월부터 2009년 12월까지 순천 한 병원의 환자 검체로부터 분리된 MRSA와 methicillin 감수성 Staphylococcus aureus (MSSA) 균주을 대상으로 장독소를 비롯하여, 표피박탈성독소, 독성 쇼크 증상 독소 1, leukocidin 유전자들을 분자생물학적 기술인 PCR 기술을 이용하여 검색하였다. 또한 독소 유전자 분포를 통해 이들 균주들 간의 분자생물학적 연관성을 파악하고 독소 유전자와 항생제에 대한 내성과의 관계를 조사하였다.
- 세균의 분리는 혈액한천 (6% 혈액 함유) 배지를 이용하여 37℃에서 16–18시간 배양하여 사용하였다. 분리된 세균 중 coagulase 및 catalase시험[32]에 양성을 나타내는 균주들을 선별하였다. 선별된 균주들을 Vitek 32 GPI kit (BioMerieux, France)를 이용하여 동정하였다.
- MRSA로 판명된 균주 중 mecA가 검출되지 않은 2개 균주를 제외한 75개 균주를 MRSA로 최종 확인하였다. 순수 분리된 세균의 계대 배양은 tryptic soy agar(TSA, Becton Dickinson) 배지를 이용하였다.
이론/모형
- 이 때 동일 환자로부터 반복 분리된 균주는 제외하였다. Methicillin 내성 균주(MRSA)의 판정은 디스크 확산법과 Vitek 2 kit (BioMerieux, France)를 이용한 최소억제 농도(MIC) 판정을 이용하여 실시하였다. 디스크 확산법에서의 판정 기준은 CLSI [7]를 따랐으며, oxacillin (1 μg)에 의한 억제대 직경이 10 mm 이하이면 내성, 13 mm 이상이면 감수성인 균주(MSSA)로 판정하였다.
- TSA 배지에 자란 세균 집락으로부터 Choe 등의 방법[6]을 이용하여 DNA를 추출하였으며 실험에 사용할 때까지 -20℃에 냉동 보관하였다.
- 디스크 확산법에서의 판정 기준은 CLSI [7]를 따랐으며, oxacillin (1 μg)에 의한 억제대 직경이 10 mm 이하이면 내성, 13 mm 이상이면 감수성인 균주(MSSA)로 판정하였다.
- 분리균의 항생제 감수성 조사는 디스크 확산법을 사용하여 측정하였다. McFarland 0.
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