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제안 방법
- ESBL유전자와 qnr의 여러 유전자형을 검사하기 위해 기존에 알려진 primer를 이용(Table 1)하여 PCR로 증폭하였다. PCR 반응액은 dNTP (각 2.
- MacConkey agar (Becton Dickinson, USA)에서 37°C, 16-18시간 배양 된 집락을 사용하였으며 MacFarland 0.6으로 탁도를 맞춘 균액을 64개의 well로 구성된 card에 넣고, 3°C 조건에서 4-15시간 배양 후 항생제의 최소 억제농도를 판독하였다.
- Mueller-Hinton II agar (MHA; Becton Dickinson, USA)에 MacFarland 0.5 탁도의 균액을 고르게 접종한 후, 배지의 중앙에는 amoxicillin-clavulanic acid (Oxoid, 30 μg), 주위에는 ceftazidime (Oxoid, 30 μg), cefotaxim (Oxoid, 30 μg)와 aztreonam (Oxoid, 30 μg) 디스크를 놓았다.
- PCR 반응액은 dNTP (각 2.5 mM), MgCl2 2 mM, primer 각 20p mol, Taq DNA polymerase (Bioneer, Korea) 0.5 U, genomic DNA 100 ng과 반응완충용액(10mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 1.5mM MgCl2)에 총 부피가 50 μl가 되도록 증류수를 첨가하였다.
- PCR 반응은 PTC-150 MiniCycler TM (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며 PCR 반응 조건은 94°C에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 94°C에서 30 초, 55°C에서 30 초, 72°C에서 40 초씩 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 10분 동안 더 신장반응을 시켰다.
- PCR 반응은 PTC-150 MiniCycler TM (TaKaRa, Japan)을 이용하였으며 PCR 반응 조건은 94°C에서 5분간 초기 열처리를 한 후, 94°C에서 30 초, 55°C에서 30 초, 72°C에서 40 초씩 30회 반복하고 마지막으로 72°C에서 10분 동안 더 신장반응을 시켰다. PCR 산물은 1% agarose gel에 전기 영동하여 확인하였다.
- 각 항생제에 대한 최소억제농도를 Vitek GNS-433 card(bioMeriex, France)로 측정 하였다. MacConkey agar (Becton Dickinson, USA)에서 37°C, 16-18시간 배양 된 집락을 사용하였으며 MacFarland 0.
- coli 균주를 수집하였다. 그리고 ESBL 생성 균주들의 ESBL 유전자와 qnr 유전자의 보유율을 조사하였으며, 항균제 내성 양상을 파악하였다.
- 중앙과 주변 디스크의 가장자리는 15 mm 간격이 되게 하였으며, 37°C에서 16-18시간 배양 후 결과를 판독하였다. 두 디스크 사이에서 상승효과가 관찰되면 양성으로 판정하였다 (Fig. 1).
대상 데이터
- 2011년 5월부터 2012년 2월까지 전남 순천의 2개 병원의 임상검체로부터 분리된 E. coli 274주를 이용하였다. 균주의 동정은 BBL Crystal E/NF System (Becton Dickinson, USA)을 이용하였다.
- SHV 유전자와 CTX-M-2과 CTX-M-8은 검출되지 않았다. ESBL 유전자를 2개 이상 보유한 균주는 11 개였으며, 그 구성은 TEM / CTX-M-1 (7균주), TEM / CTX-M-9 (3균주), CTX-M-1 / CTX-M-9 (1균주)였다.
- 4%)에서 검출되었으며 qnrA는 검출되지 않았다. ESBL 유전자와 qnr 유전자를 동시에 보유한 균주는 5개 였으며, 그 구성은 qnrB1 / CTX-M-1 (2균주), qnrS / TEM / CTX-M-1(1균주), qnrB4 / TEM / CTX-M-1 (1균주) 그리고 qnrB4 / CTX-M-9 (1균주)였다(Table 3).
- DDST를 통해 확인된 ESBL 양성 균주들 중 7개의 균주들에서는 ESBL 유전자가 검출되지 않았다. 본 연구에서 유전자 검출에 사용한 primer들은 국내에서 발견되는 유전자형을 참고하여 사용된 것들이다. 따라서 국내에서 검출되지 않았거나 혹은 매우 낮은 검출율을 보인 PER, VEB, GES, IBC, TLA 등[11] 다양한 class A ESBL 유전자형에 특이적인 primer를 사용해야 할 필요가 있다는 것을 알 수 있었다.
- 본 연구에서는 2011년 5월부터 2012년 2월까지 전남 순천의 2개 병원의 검체에서 분리된 E. coli 균주들을 대상으로 double disk synergy test를 실시하여 ESBL 생성 E. coli 균주를 수집하였다. 그리고 ESBL 생성 균주들의 ESBL 유전자와 qnr 유전자의 보유율을 조사하였으며, 항균제 내성 양상을 파악하였다.
이론/모형
- ESBL 생성 여부는 double-disk synergy test (DDST) 법을 사용하였다[20]. Mueller-Hinton II agar (MHA; Becton Dickinson, USA)에 MacFarland 0.
- coli 274주를 이용하였다. 균주의 동정은 BBL Crystal E/NF System (Becton Dickinson, USA)을 이용하였다.
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