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문제 정의
- 최근에는 이러한 장점으로 재조합 단백질 생산을 위한 생체반응장치(Bioreactor)로 누에를 이용하는 연구가 진행되고 있다. 본 실험은 형질전환 누에를 이용하여 인체에 유용한 재조합 단백질을 생산하기 위한 연구의 일환으로, 초파리 형질전환에 널리 사용되는 piggyBac 전이벡터에 초파리 유래의 promoter인 Drosophila heat shock protein 70 (dHsp70) promoter와 3xP3 promoter를 사용하여 누에형질전환 전이벡터와 형질전환 누에를 제작하였다. dHsp70 promoter는 이미 누에에서 열충격에 의해 재조합단백질의 발현을 조절할 수 있다고 알려져 있다[13].
제안 방법
- 반응 후 TBS-T로 상온에서 10분간 5회 세척한 후, 3M Paper에서 PVDF membrane에 남아 있는 물기를 제거하였다. ECL Plus Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences., USA)를 사용하여 PVDF membrane을 상온에서 5분간 반응시킨 후, X-ray film에 노출시킨 후 현상하여 확인하였다.
- Inverse PCR을 이용하여 형질전환체의 게놈에 전이벡터가 삽입되어 있는지를 분석하였고, 3' junction 영역에서 2개의 서열을 확인 할 수 있었다(Table 2).
- 형질선환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. hSCF 유전자의 발현조절에는 초파리의 Heat shock 70 promoter (dHsp70 promoter)를 사용하였으며[13], 이러한 과정을 통해 형질전환 전이벡터인 pG-3xP3-EGFP-dHsp70-hSCF 를 제작하였다(Fig. 1A).
- hSCF 재조합 단백질이 발현되는 형질전환 누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질선환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다.
- hSCF 재조합단백질이 발현되는 형질전환 누에는 piggyBac 벡터를 이용하여 제작하였다. hSCF 유전자는 다음의 primer를 이용하여 PCR 증폭을 통해 확보하였다.
- piggyBac 전이벡터가 형질전환누에의 genomic DNA에 삽입되었는지 확인하기 위해서 선발된 형질전환누에에서 genomic DNA를 분리 및 정제하였다. 분리된 genomic DNA는 제한효소 Sau3AI으로 처리한 후, T4 DNA ligase를 사용하여 16℃에서 12시간 동안 ligation하였다.
- sense primer는 번역 개시코돈인 ATG 및 Not I 제한효소 인식서열을 포함하여 5'-GCGGCCGCGTTATGAAGAAGACACAAACT-3'(29 mer)를 사용하였고 antisense primer는 6xHis-taq protein 발현을 위하여 종결코돈 앞에 6개의 Histidine과 Not I 제한효소 인식서열을 포함하여 5'-GCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGT GGTGCCGCACTTCTTGAAACTCTCT-3'(47 mer)를 사용하여 PCR 반응을 하였다.
- 누에형질전환체 제작을 위한 누에 초기배로의 microinjection은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 injection 하였고, 총 1,020개의 누에알을 microinjection 하였다. 그 결과 241 (23.
- 따라서, 본 실험에서는 인간유래의 Stem Cell factor (hSCF) 재조합 단백질 대량생산을 위해서 누에형질전환 시스템을 이용하였고, Western blot, inverse PCR 등을 이용하여 분석하였다.
- 누에 초기배로의 microinjection은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사하였는데, 그 과정은 다음과 같이 실시하였다. 먼저 텅스텐 침으로 누에알의 난간에 작은 구멍을 뚫고, 이 구멍에 DNA 용액이 들어있는 microcapillary 의 끝을 삽입 후, microinjector의 공기압을 이용하여 DNA 용액을 알 속으로 주입하였다. 이때 각 배아에 주입된 DNA 용액의 양은 10-15 nl가 사용되었고, 난간에 생긴 구멍은 Cyanocrylate 접착제를 사용하여 막았다.
- )에 transfer하였다. 비특이적인 반응을 막기 위해 5% skim milk로 2시간 동안 blocking 한 후, TBS-T 완충액(10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)으로 5분간 2회 세척(washing)하였다. 세척 후 blocking 용액에 1차 항체 (primary antibody)를 적정량 희석해서 넣어주고 상온에서 5시간 동안 반응시켰다.
- 선발된 G2세대의 5령 기잠 누에에 lysis buffer [100 mM sodium citrate, pH 8.0, 100 mM KCl, 2 mM EDTA, 2 mMdithiothreitol (DTT), 20 mg/l phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)]를 첨가하고 Homogenizer를 이용하여 누에를 파쇄하였다. 그리고 4℃에서 10,000x g의 속도로 15분간 원심 분리 후 상층액만을 분리하여 2x protein sample buffer [Tricine sample buffer ; 0.
- 1%)가 성충이 되었다. 성충이 된 나방들은 서로 교배시켜 G1세대를 얻은 후, 형질전환체의 선발을 위해 시기별로 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 누에알은 산란 후 5일 째에 눈과 신경조직에서 형광이 관찰되었고, 유충과 번데기, 성충은 눈에서 형광이 각각 관찰되었다(Fig.
- 2000년에 접어들면서 일본의 Tamura 등은 piggyBac유전자를 이용하여 누에 형질전환에 성공하였다[10]. 이 실험은 BmA3 프로모터에 표지유전자인 GFP로 제작한 전이벡터와 transposase를 발현시키는 helper 플라스미드를 제작하여 누에 초기배에 미세주사 하였고 부화유충과 차세대 개체의 GFP 발현 유무로 형질전환체를 검정하였다. 그 결과 G1세대에서 GFP 발현을 확인할 수 있었고, Southern blot 분석으로 유전자 전이를 분석한 결과에서 누에 염색체 내에 1-3 copy의 GFP 유전자가 확인되었다.
- 또한 1995년 Mori 등은 AcNPV를 이용하여 형질전환 실험을 하였는데, 초파리의 열충격단백질 유전자(hsp70)의 프로모터와 반딧불이의 luciferase 유전자를 이용하여 재조합바이러스를 제작하였다. 이 재조합 베큘로바이러스(baculovirus)를 5령 초기 누에에 접종하고 유충과 번데기 및 차세대 유충에서 표지유전자 발현을 검정하였다. 그 결과, 차세대 부화 유충과 G3 세대에서 luciferase 발현과 바이러스 유래 유전자의 존재를 확인함으로서 AcNPV를 누에 형질전환에 이용할 수 있다는 가능성을 제시하였다[5].
- sense primer는 번역 개시코돈인 ATG 및 Not I 제한효소 인식서열을 포함하여 5'-GCGGCCGCGTTATGAAGAAGACACAAACT-3'(29 mer)를 사용하였고 antisense primer는 6xHis-taq protein 발현을 위하여 종결코돈 앞에 6개의 Histidine과 Not I 제한효소 인식서열을 포함하여 5'-GCGGCCGCGTGGTGGTGGTGGT GGTGCCGCACTTCTTGAAACTCTCT-3'(47 mer)를 사용하여 PCR 반응을 하였다. 이렇게 증폭된 hSCF cDNA는 pGEM-T easy벡터(Promega Co.)에 클로닝하여 pGEMT-hSCF를 구축하였고 pGEMT-hSCF의 Not I/Not I 사이에 있는 hSCF ORF 절편을 piggyBac 벡터의 Not I/Not I 위치에 재클로닝하여 형질전환 전이벡터인 pG-3xP3-EGFP-dHsp70-hSCF를 제작하였다.
- 3' 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5'-TACGCATGATTATCTT TAACGTA-3' (23 mer)을 사용하였고, antisense primer는 5'-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3' (23 mer)을 사용 하였다. 증폭된 DNA 절편은 pGEM-T easy벡터(Promega Co.)에 클로닝하여 ABI Prism 377 DNA sequence (Perkin Elmer Co.)를 이용하여 유전자서열을 분석하였다.
대상 데이터
- 3' 접합부위를 증폭하기 위해서 sense primer는 5'-TACGCATGATTATCTT TAACGTA-3' (23 mer)을 사용하였고, antisense primer는 5'-GGGGTCCGTCAAAACAAAACATC-3' (23 mer)을 사용 하였다.
- 형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori)는 금옥잠(125×140)을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도, 24-27℃; 상대습도, 70-90%)에 준하여 사육하였다. 누에 형질전환에 사용된 전이벡터는 piggyBac 벡터와 helper plasmid 벡터인 pHA3PIG를 사용하였다[3,10].
- 1%) 만이 형질전환체로 선발되었다. 또한 선발된 누에형질전환체에서 hSCF 재조합단백질의 발현은 Western blot을 사용하여 분석하였는데, 분석에 사용 된 누에는 G2세대의 5령 1일째 유충을 이용하였다. 항체는 Anti-His-taq antibody와 Anti-SCF antibody를 사용하였다.
- 1%) 만이 성충이 되었다. 또한 성충들을 서로 교배시켜 G1 세대의 알을 얻었고, 그 중에서 22 bloods (2.1%) 만이 형질전환체로 선발되었다. 또한 선발된 누에형질전환체에서 hSCF 재조합단백질의 발현은 Western blot을 사용하여 분석하였는데, 분석에 사용 된 누에는 G2세대의 5령 1일째 유충을 이용하였다.
- 선발된 형질전환체들은 서로 교배시 G2 세대의 형질전환 체를 얻었고, hSCF 재조합단백질의 발현을 분석하기 위해 Western blot을 하였다. 분석에는 G2세대의 5령 1일째 누에를 사용하였고, 사용된 항체는 Anti-SCF rabbit monoclonal antibody (UK, Abcam)를 사용하였다. 그 결과 hSCF재조합단백질의 예상 위치인 약 30.
- 또한 선발된 누에형질전환체에서 hSCF 재조합단백질의 발현은 Western blot을 사용하여 분석하였는데, 분석에 사용 된 누에는 G2세대의 5령 1일째 유충을 이용하였다. 항체는 Anti-His-taq antibody와 Anti-SCF antibody를 사용하였다. 본 논문에서는 Anti-His-taq antibody를 사용하여 얻은 결과를 보여주지 못했지만 Anti-SCF antibody를 사용한 것과 동일한 30.
- 형광현미경을 사용한 형질전환체 선발은 Leica (USA)사의 MZ16 현미경과 Leica (USA)사의 Microscope MZ FLIII Flourescence Filter GFP2 형광필터를 사용하여, 세대별, 시기별로 관찰하여 선발하였다.
- hSCF 재조합 단백질이 발현되는 형질전환 누에를 제작하기 위해 piggyBac 벡터를 이용하여 전이벡터를 구축하였다. 형질선환체를 선발하기 위한 마커 유전자로는 EGFP를 사용하였고, 이 유전자의 조절 프로모터로는 3xP3 promoter를 사용하였다. hSCF 유전자의 발현조절에는 초파리의 Heat shock 70 promoter (dHsp70 promoter)를 사용하였으며[13], 이러한 과정을 통해 형질전환 전이벡터인 pG-3xP3-EGFP-dHsp70-hSCF 를 제작하였다(Fig.
- 형질전환에 사용된 누에(Bombyx mori)는 금옥잠(125×140)을 사용하였고, 농촌진흥청 농업생물부의 표준 사육 기준(온도, 24-27℃; 상대습도, 70-90%)에 준하여 사육하였다.
- 형질전환에 사용된 누에알은 산란 후 4시간 이내의 것만 사용하였다. 전이벡터와 Helper 벡터의 농도비는 1:1의 비율로 사용하였고, microinjection용 완충용액(5 mM KCl, 0.
이론/모형
- 그리고, 이 프로모터의 사용으로 부화 후 5일째 되는 초기배 단계에서 형질전환체를 선발할 수 있었다. 누에알에 전이벡터를 주입하는 것은 2000년 Tamura 등이 사용한 microinjection 법을 참고하여 실험하였는데, 누에 초기배로의 microinjection은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 주사됨으로써 형질전환 효율을 향상시킬 수 있었다. 또한, 형질전환에 사용된 누에 품종인 금옥잠은 잠125와 잠140의 교잡종으로서 일반 원종에 비해 누에알이 크고, 인공사료에 의한 연중 사육이 가능하며, 월년 종의 특징인 염산처리에 의해 부화된다.
- 선발된 형질전환체들은 서로 교배시 G2 세대의 형질전환 체를 얻었고, hSCF 재조합단백질의 발현을 분석하기 위해 Western blot을 하였다. 분석에는 G2세대의 5령 1일째 누에를 사용하였고, 사용된 항체는 Anti-SCF rabbit monoclonal antibody (UK, Abcam)를 사용하였다.
성능/효과
- 누에형질전환체 제작을 위한 누에 초기배로의 microinjection은 배아의 주공과 후부 사이의 가운데 배면 부분에 injection 하였고, 총 1,020개의 누에알을 microinjection 하였다. 그 결과 241 (23.6%) 마리의 유충이 부화되었고, 그 중 124마리(12.1%)가 성충이 되었다. 성충이 된 나방들은 서로 교배시켜 G1세대를 얻은 후, 형질전환체의 선발을 위해 시기별로 형광현미경으로 관찰하였다.
- 이 실험은 BmA3 프로모터에 표지유전자인 GFP로 제작한 전이벡터와 transposase를 발현시키는 helper 플라스미드를 제작하여 누에 초기배에 미세주사 하였고 부화유충과 차세대 개체의 GFP 발현 유무로 형질전환체를 검정하였다. 그 결과 G1세대에서 GFP 발현을 확인할 수 있었고, Southern blot 분석으로 유전자 전이를 분석한 결과에서 누에 염색체 내에 1-3 copy의 GFP 유전자가 확인되었다. 또한, Inverse PCR 분석으로 염색체 내에 전이벡터 유래의 말단 역배열 염기인 TTAA 서열이 확인됨에 따라 piggyBac에 의한 유전자 전이가 일어났음이 확인되었다.
- 분석에는 G2세대의 5령 1일째 누에를 사용하였고, 사용된 항체는 Anti-SCF rabbit monoclonal antibody (UK, Abcam)를 사용하였다. 그 결과 hSCF재조합단백질의 예상 위치인 약 30.9 kDa 에서 밴드를 확인할 수 있었다(Fig. 3B)
- 성충이 된 나방들은 서로 교배시켜 G1세대를 얻은 후, 형질전환체의 선발을 위해 시기별로 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과, 누에알은 산란 후 5일 째에 눈과 신경조직에서 형광이 관찰되었고, 유충과 번데기, 성충은 눈에서 형광이 각각 관찰되었다(Fig. 2). 이런 과정을 통해 G1세대에서 22 개체의 형질전환체를 선발할 수 있었다 (Table 1).
- Inverse PCR을 이용하여 형질전환체의 게놈에 전이벡터가 삽입되어 있는지를 분석하였고, 3' junction 영역에서 2개의 서열을 확인 할 수 있었다(Table 2). 그 중 1개의 서열은 silkworm genome research program (http://sgp.dna.affrc.go.jp) 분석에서 Chromosome 15 (14175331- 14175380)에 삽입되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 16%로 상당히 낮지만 누에에 있어서 최초의 유전자 표적 형질전환이었다. 그리고 F3 세대간의 교잡을 통해 형질전환 된 GFP 유전자의 유전양식과 분리비를 조사한 결과에서 1:1의 분리비를 확인함으로서 멘델의 법칙에 따라 GFP 유전자가 유전하며 염색체에 안정적으로 존재하고 있음을 확인하였다[14]. 2000년에 접어들면서 일본의 Tamura 등은 piggyBac유전자를 이용하여 누에 형질전환에 성공하였다[10].
- dHsp70 promoter는 이미 누에에서 열충격에 의해 재조합단백질의 발현을 조절할 수 있다고 알려져 있다[13]. 따라서 dHsp70 promoter에 의해 hSCF재조합단백질의 발현이 조절됨으로써, 열충격의 유무에 따라 누에 생육에 미치는 영향을 최소화 시키거나 재조합단백질의 발현을 최대화 할 수 있도록 하였다. 또한 EGFP marker의 발현 조절을 위해 사용된 3xP3 promoter는 초파리의 눈과 신경조직에서 작용하는 것으로 알려져 있는데, 누에의 초기배 단계에서도 눈과 신경조직에서 작용하고, 유충과 번데기, 성충에서는 눈에서 작용한다고 알려져 있다[11].
- 그 결과 G1세대에서 GFP 발현을 확인할 수 있었고, Southern blot 분석으로 유전자 전이를 분석한 결과에서 누에 염색체 내에 1-3 copy의 GFP 유전자가 확인되었다. 또한, Inverse PCR 분석으로 염색체 내에 전이벡터 유래의 말단 역배열 염기인 TTAA 서열이 확인됨에 따라 piggyBac에 의한 유전자 전이가 일어났음이 확인되었다. 이러한 Tamura의 실험 이후 많은 누에 형질전환 실험에서 piggyBac이 사용되었는데, 2002년 Uhlirova 등은 piggyBac 벡터에 초파리 열충격단백질(hsp70) 프로모터을 사용하여 살아있는 누에에서 hsp70 프로모터가 기능적임을 확인하였고[13], 2002년 Thomas 등은 초파리의 눈과 신경조직에 특이적인 3xP3 프로모터와 EGFP 마커를 사용하여 차세대 개체의 알과 G1 세대 성체의 눈에서 형광을 관찰함으로써 누에 형질전환체의 선발을 쉽게 했다[11].
- 항체는 Anti-His-taq antibody와 Anti-SCF antibody를 사용하였다. 본 논문에서는 Anti-His-taq antibody를 사용하여 얻은 결과를 보여주지 못했지만 Anti-SCF antibody를 사용한 것과 동일한 30.9kDa에서 밴드를 확인 할 수 있었다. 또한 Fig.
- 그러므로 선발된 누에형질전환체를 장기간 보관 할 수 있으며, 일반농가에도 보급하여 대량사육을 할 수 있는 장점을 가지고 있다. 본 연구에서 형질전환 효율은 1020 개의 누에알에 microinjection하여 241(23.6%)마리의 유충이 부화되었고, 그 중에서 124마리 (12.1%) 만이 성충이 되었다. 또한 성충들을 서로 교배시켜 G1 세대의 알을 얻었고, 그 중에서 22 bloods (2.
- 비록 5’영역의 서열을 얻을 수는 없었지만, 서열분석을 통해서 누에게놈의 Chromosome 15 (14175331-14175380)번 위치에 전이벡터가 삽입된 것을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 비록 5’영역의 서열을 얻을 수는 없었지만, 서열분석을 통해서 누에게놈의 Chromosome 15 (14175331-14175380)번 위치에 전이벡터가 삽입된 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에서 hSCF재조합단백질을 생산하는 누에형질전환체가 성공적으로 제작 되었음을 확인할 수 있었고, 이러한 결과는 재조합 단백질 대량생산 연구에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
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