Bubble column bioreactor에서 형질전환된 담배세포의 성장양상 및 β-Glucuronidase의 생산 The Growth of Transgenic Tobacco′s Suspension Culture and the Production of β-Glucuronidase in Bubble Column Bioreactor원문보기
$\beta$-glucuronidase 유전자를 형질전환한 담배에서 여러 조직중에서 가장 activity가 높은 줄기에서 현탁세포를 유도하여 생장 및 발현 양상을 조사하였다. Flask culture와 2.5 L bubble column culture시 세포의 성장에는 큰 차이가 없었지만 $\beta$-glucuronidase의 발현은 bubble column culture시 약 2850 U/mg으로 95배 향상되는 결과를 나타내었다. 하지만 두 경우 모두 $\beta$-glucuronidase의 생산량이 증가와 감소를 반복하는 양상을 나타내었다. 이것은 외래 단백질의 생산과 파괴가 반복적으로 일어나는 것으로 추정이 된다. 또한 bubble column culture의 생산성을 향상시키기 위해 중요한 영양분인 sucrose을 30 g/L로 두 번 첨가한 경우, 다른 영양분의 고갈로 인하여 세포의 최종 생산량은 향상되지가 않았고 $\beta$-glucuronidase는 안정적으로 생산되었지만 최종 생산량은 향상되지가 않았다. 하지만 세포의 크기가 감소하여 배양기 운전이 쉬워지는 장점이 있었고 이것은 세포의 고농도 배양을 통한 재조합 단백질 생산성을 향상시키는 유리하게 작용할 것이다.
$\beta$-glucuronidase 유전자를 형질전환한 담배에서 여러 조직중에서 가장 activity가 높은 줄기에서 현탁세포를 유도하여 생장 및 발현 양상을 조사하였다. Flask culture와 2.5 L bubble column culture시 세포의 성장에는 큰 차이가 없었지만 $\beta$-glucuronidase의 발현은 bubble column culture시 약 2850 U/mg으로 95배 향상되는 결과를 나타내었다. 하지만 두 경우 모두 $\beta$-glucuronidase의 생산량이 증가와 감소를 반복하는 양상을 나타내었다. 이것은 외래 단백질의 생산과 파괴가 반복적으로 일어나는 것으로 추정이 된다. 또한 bubble column culture의 생산성을 향상시키기 위해 중요한 영양분인 sucrose을 30 g/L로 두 번 첨가한 경우, 다른 영양분의 고갈로 인하여 세포의 최종 생산량은 향상되지가 않았고 $\beta$-glucuronidase는 안정적으로 생산되었지만 최종 생산량은 향상되지가 않았다. 하지만 세포의 크기가 감소하여 배양기 운전이 쉬워지는 장점이 있었고 이것은 세포의 고농도 배양을 통한 재조합 단백질 생산성을 향상시키는 유리하게 작용할 것이다.
The growth kinetics and the production of $\beta$-glucuronidase from transgenic tobacco's suspension culture was investigated in the flask culture and a 2.5 L bubble column reactor. The growth of bubble column reactor was similar to that of flask culture. However, in the bubble column rea...
The growth kinetics and the production of $\beta$-glucuronidase from transgenic tobacco's suspension culture was investigated in the flask culture and a 2.5 L bubble column reactor. The growth of bubble column reactor was similar to that of flask culture. However, in the bubble column reactor, the production of $\beta$ -glucuronidase reached 2850 U/mg (85-fold higher than that of flask culture). In both case, the production level of $\beta$ -glucuronidase was fluctuated, which was resulted from periodical degradation of the protein. Sucrose is important component in plant culture medium. Twice addition of sucrose in bubble column reactor could not improve cell growth, since other components in a medium were already depleted. However, the addition of sugar decreased cell size, which facilitated the operation of bioreactor. The production of $\beta$ -glucuronidase was continuously increased, however final concentration of $\beta$ -glucuronidase was similar to that without sucrose addition.
The growth kinetics and the production of $\beta$-glucuronidase from transgenic tobacco's suspension culture was investigated in the flask culture and a 2.5 L bubble column reactor. The growth of bubble column reactor was similar to that of flask culture. However, in the bubble column reactor, the production of $\beta$ -glucuronidase reached 2850 U/mg (85-fold higher than that of flask culture). In both case, the production level of $\beta$ -glucuronidase was fluctuated, which was resulted from periodical degradation of the protein. Sucrose is important component in plant culture medium. Twice addition of sucrose in bubble column reactor could not improve cell growth, since other components in a medium were already depleted. However, the addition of sugar decreased cell size, which facilitated the operation of bioreactor. The production of $\beta$ -glucuronidase was continuously increased, however final concentration of $\beta$ -glucuronidase was similar to that without sucrose addition.
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문제 정의
본 연구에서는 의약품과 같은 유용 단백질을 생산하는 벡터를 식물세포 내 삽입하여 형질 전환된 식물세포의 배양을 통해 이러한 물질들을 대량생산하기 위한 기초자료를 얻고자 reporter gene으로 널리 알려진 -glucuronidase (GUS) 유전자로 형질 전환된 담배세포를 유도하여 bioreactor 내에서 현탁배양시 회분식배양과 유가식배양을 하여 세포 생장 및 당 이온들의 변화추이, GUS activity 등을 측정하였다.
제안 방법
Bioreactor는 회분식 배양과 배양시작후 5, 11일째에 30g/L의 sucrose를 첨가한 유가식 배양을 수행하였고 거품의 형성을 막기 위해 antifoam A emulsion (Sigma)을희석하여 배양시 간헐적으로 첨가하였다.
GUS 유전자로 형질전환된 담배세포를 2 L bubble column bioreactor (Fig. 1)내에서 회분식 배양과 유가식 배양으로 나누어 세포의 생장 (Fig. 5), 당농도 (Fig. 6), GUS activity (Fig. 7), 이온농도의 변화 (Fig. 8) 등을 관찰하였다. 세포생장변화는 flask와 유사하였으나 초기세포생장이 flask에서 보다는 조금 느리고 최대세포농도도 더 작았다.
volume)의 측정을 통해 관찰하였다. 세포 생체중량은 Btichner funnel을 이용하여 배양액을 Whatman No.l 여과지로 거른 후 증류수로 수회 세척후 다시 여과하여 얻은 세포를 측정한 중량을 사용하였으며 이러한 생체중량 측정 과정을 거친 세포를 60°C로 유지된 dry oven에 넣어 시간에 따른 무게변화가 없을 때까지 건조시켜 측정한 중량은 세포 건조중량으로 사용하였다. SCV는 시료를 1시간 동안 매스실린더에서 세포를 가라앉힌 후 세포부피 : 총시료 부피로 나타내었다.
세포의 증식은 세포 생체중량(fresh cell weight, FCW), 세포 건조중량(dry cell weight, DCW)과 SCV (sedimented cell volume)의 측정을 통해 관찰하였다. 세포 생체중량은 Btichner funnel을 이용하여 배양액을 Whatman No.
2 M N^CQ)를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이때 MUG가 GUS에 의해 4-methylumbelliferone (MU)로 전환시 나타나는 fluorescence를 Hdefei사의 TKO100 fluorometer를 이용하여 측정하였다,
lmg/L thiamine-HCl) 에서 callus를 유도하고 이를 다시 50 mg/L의 benzylaminopurine (BAP) 가첨가된 MS 배지에서 식물체로 재분화를 유도하였다. 이렇게 유도된 식물체를 부위별로 나누어 GUS activity를 측정한 후 가장 높은 부위에서 다시 0.5 mg/L 2, 4-dichloro phenoxy acetic acid (2, 4-D)가 첨가된 MS 배지에서 callus 유도 후 동일 배지하에서 현탁세포를 유도하였고 25°C, 120 rpm, 명조건으로 유지하면서 7일 간격으로 계대배양 하면서 유지하고 실험 재료로 사용하였다.
총당분석은 Waters사의 refractometry index detector와 carbohydrate column (4.6 x 250 mm) 로 이루워진 HPLC를 사용하였고 이때 유속은 1.3 ml/min 이였다.
형질전환된 담배세포를 bubble-column bioreactor 내에서 유가식배양을 통해 세포의 생장, GUS activity, 당 농도 및 이온농도의 변화를 살펴보았다. 먼저 세포생장의 경우 당의 고갈을 막아주었는데도 회분식배양에 세포증식과 최대 세포 농도가 커다란 증가를 보이지 않았다 (Fig.
성능/효과
세포를 2.5 g (DCW)/L의 농도로 세포를 접종하여 실험한 결과, Fig. 3에서 보듯이 GUS 유전자로 형질전환된 식물체와 형질전환되지 않은 식물체의 생장추이가 거의 유사함을 볼 수 있으며 최대 15 g (DCW)/L에 도달하였다. 따라서 식물체 내로 외래 유전자 삽입에 의한 단백질의 생산은 식물세포 생장에 별다른 영향을 주지 않는 것으로 여겨진다.
8) 등을 관찰하였다. 세포생장변화는 flask와 유사하였으나 초기세포생장이 flask에서 보다는 조금 느리고 최대세포농도도 더 작았다. 이것은 bioreactor의 경우 초기 접종량이 flask culture 시보다 적고, 교반상의 차이나 산소전달방법의 차에 의해 유발되어지는 것으로 볼 수 있다.
식물체 내에 GUS의 발현 유무 및 부위별 발현량을 알아 본 결과 실험에 사용되어진 모든 clone에서 GUS activity 가 관찰되었으며 부위별로는 아랫쪽 잎보다는 위쪽 잎, 위쪽 잎보다는 줄기에서 더 높은 activity를 보여 (Fig. 2) 줄기에서 유도된 callus를 현탁세포로 유도하였다.
참고문헌 (13)
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