우리나라에서 자생하고 있는 천년초는 새로운 생리활성 물질을 생산할 수 있는 소재로 각광받고 있으며, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 세포는 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 천년초 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성, 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 collagen 합성에 대한 영향을 검토하고 세포사의 주요 인자인 ROS 에 미치는 영향에 대해 검토하였다. 각 추출물의 수율은 껍질 열수 추출물이 35.2%로 가장 수율이 높았고, 다음으로 줄기 열수 추출물, 껍질 에탄올 추출물, 씨 열수 추출물, 줄기 에탄올 추출물 순으로 나타났으며, 수율이 가장 낮은 씨 에탄올 추출물은 20.6%였다. 각 추출물의 농도(1, 10 50, $100{\mu}g/ml$)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과, 모든 군에서 대조군과 비교하여 유의적인 증식률을 나타내었으며 특히, $100{\mu}g/ml$ 씨 열수 추출물을 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 가장 높은 120% 정도의 증식률을 나타내었다. 천년초 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 천년초 추출물을 $10\sim50{\mu}g/ml$ 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며 특히, 씨 에탄올 추출물을 $50{\mu}g/ml$ 첨가하였을 때, 130% 이상의 ALP 활성을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 제시 되었다. 천년초 추출물이 조골세포의 collagen 합성에 미치는 실험결과에서는 천년초 씨 열수 추출물과 씨 에탄올 추출물의 $50\sim100{\mu}g/ml$ 농도에서 높은 합성능을 나타내었으며 그 중 씨 열수 추출물 $100{\mu}g/ml$ 농도에서 가장 높은 collagen 합성능을 보였다. 천년초 추출물이 세포내 ROS생성에 미치는 영향을 실험한 결과에서는 모든 천년초 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 감소하는 경향을 보였으며 특히, 씨 열수 추출물의 $100{\mu}g/ml$ 경우, 대조군에 비해 54% 정도 ROS가 감소되어 천년초씨 추출물이 세포 내에서 높은 항산화력이 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 천년초 추출물이 조골세포의 증식, ALP 활성, collagen 합성 및 ROS 생성 저해를 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 추출 용매와 관계없이 씨 추출물이 가장 높은 활성을 나타내었다. 천년초 씨 중의 활성 성분 구명을 위해 향후 구체적 기작 연구와 in vivo 연구가 병행된다면, 골다공증 예방과 관련된 기능성 식품의 천연소재 개발이 가능할 것이라 사료된다.
우리나라에서 자생하고 있는 천년초는 새로운 생리활성 물질을 생산할 수 있는 소재로 각광받고 있으며, mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 세포는 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어 왔다. 따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 천년초 추출물이 세포 증식에 미치는 영향과 ALP 활성, 조골세포의 골 형성을 위한 필수 인자인 collagen 합성에 대한 영향을 검토하고 세포사의 주요 인자인 ROS 에 미치는 영향에 대해 검토하였다. 각 추출물의 수율은 껍질 열수 추출물이 35.2%로 가장 수율이 높았고, 다음으로 줄기 열수 추출물, 껍질 에탄올 추출물, 씨 열수 추출물, 줄기 에탄올 추출물 순으로 나타났으며, 수율이 가장 낮은 씨 에탄올 추출물은 20.6%였다. 각 추출물의 농도(1, 10 50, $100{\mu}g/ml$)에 따른 조골세포 성장에 미치는 영향을 MTT assay로 분석한 결과, 모든 군에서 대조군과 비교하여 유의적인 증식률을 나타내었으며 특히, $100{\mu}g/ml$ 씨 열수 추출물을 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 가장 높은 120% 정도의 증식률을 나타내었다. 천년초 추출물이 ALP 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, 천년초 추출물을 $10\sim50{\mu}g/ml$ 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였으며 특히, 씨 에탄올 추출물을 $50{\mu}g/ml$ 첨가하였을 때, 130% 이상의 ALP 활성을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성이 제시 되었다. 천년초 추출물이 조골세포의 collagen 합성에 미치는 실험결과에서는 천년초 씨 열수 추출물과 씨 에탄올 추출물의 $50\sim100{\mu}g/ml$ 농도에서 높은 합성능을 나타내었으며 그 중 씨 열수 추출물 $100{\mu}g/ml$ 농도에서 가장 높은 collagen 합성능을 보였다. 천년초 추출물이 세포내 ROS생성에 미치는 영향을 실험한 결과에서는 모든 천년초 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 감소하는 경향을 보였으며 특히, 씨 열수 추출물의 $100{\mu}g/ml$ 경우, 대조군에 비해 54% 정도 ROS가 감소되어 천년초씨 추출물이 세포 내에서 높은 항산화력이 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 천년초 추출물이 조골세포의 증식, ALP 활성, collagen 합성 및 ROS 생성 저해를 촉진하여 골 생성에 영향을 줄 수 있는 것이 확인되었으며, 추출 용매와 관계없이 씨 추출물이 가장 높은 활성을 나타내었다. 천년초 씨 중의 활성 성분 구명을 위해 향후 구체적 기작 연구와 in vivo 연구가 병행된다면, 골다공증 예방과 관련된 기능성 식품의 천연소재 개발이 가능할 것이라 사료된다.
In this study, the effect of the Opuntiahumifusa extracts on proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, collagen synthesis and ROS level of a cell was investigated using an osteoblast. Opuntiahumifusawas separated intoOpuntiahumifusapeel (OH-P), seed (OH-Se) and stem (OH-St).These were subj...
In this study, the effect of the Opuntiahumifusa extracts on proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, collagen synthesis and ROS level of a cell was investigated using an osteoblast. Opuntiahumifusawas separated intoOpuntiahumifusapeel (OH-P), seed (OH-Se) and stem (OH-St).These were subjected to extraction by using hot water and ethanol. The proliferation of the MC3T3-E1 osteoblastic cells that were treated with OH-Se water extract were increased by approximately 120%. Regarding the effects of OH-Se on ALP activity, the $50{\mu}g/ml$ ethanol extract group showed the highest activity. The synthesis of collagen increased significantly in response to treatment with OH-Se water extract. The ROS scavenging effects of Opuntiahumifusawere investigated for involvement of oxidativedamage, cell culture and staining. Also, when OH-Se water extract $100{\mu}g/ml$ was added, the ROS level decreased by 54%. These results indicate that Opuntiahumifusa extracts have an anabolic effect on bone through the promotion of osteoblastic differentiation, suggesting that it could be used for the treatment of common metabolic bone diseases.
In this study, the effect of the Opuntiahumifusa extracts on proliferation, alkaline phosphatase (ALP) activity, collagen synthesis and ROS level of a cell was investigated using an osteoblast. Opuntiahumifusawas separated intoOpuntiahumifusapeel (OH-P), seed (OH-Se) and stem (OH-St).These were subjected to extraction by using hot water and ethanol. The proliferation of the MC3T3-E1 osteoblastic cells that were treated with OH-Se water extract were increased by approximately 120%. Regarding the effects of OH-Se on ALP activity, the $50{\mu}g/ml$ ethanol extract group showed the highest activity. The synthesis of collagen increased significantly in response to treatment with OH-Se water extract. The ROS scavenging effects of Opuntiahumifusawere investigated for involvement of oxidativedamage, cell culture and staining. Also, when OH-Se water extract $100{\mu}g/ml$ was added, the ROS level decreased by 54%. These results indicate that Opuntiahumifusa extracts have an anabolic effect on bone through the promotion of osteoblastic differentiation, suggesting that it could be used for the treatment of common metabolic bone diseases.
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문제 정의
이상의 결과로 황금 추출물[35], 아보카도 과피 및 씨 추출물[18]에서 조골세포의 ALP 활성을 증가시켰다는 보고와 유사하게 천년초 추출물에서도 ALP 활성을 가짐을 확인하였다. ALP는 조골세포의 분화에 발현되는 분화 표식인자이므로 이러한 결과는 조골세포의 ALP 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시했다. 따라서 천년초 씨, 껍질 및 줄기 추출물은 조골세포 증식을 촉진 할 뿐만 아니라 ALP 활성을 높이는 소재로 생각 할 수 있다.
따라서 본 연구에서는 MC3T3-E1 세포를 이용하여 천년초 추출물이 조골세포의 증식에 미치는 영향, 조골세포의 활성과 분화 인자인 ALP 활성, 골 형성을 위한 필수 인자인 collagen 합성에 미치는 영향 및 조골세포 세포사의 주요 인자인 ROS에 미치는 영향에 대해 검토하였다.
염기성 인산분해 효소(Alkaline phosphatase; ALP)는 거의 모든 조직에 존재하며 특히 골조직에 존재하는 ALP는 골 성장이 활발히 일어날 때 그 활성이 증가한다[12]. 따라서 조골세포 활성을 나타내는 biomaker로써[10], MC3T3-E1 조골세포에서의 ALP 활성을 측정하여 천년초 추출물이 조골세포의 골 성장 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 조골세포의 ALP 활성은 천년초 추출물을 10~50 μg/ml 첨가하였을 때, 열수 및 에탄올 추출물 모두 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(Fig.
제안 방법
MC3T3-E1 세포를 0.4% tryphan blue 염색법을 이용하여 세포 수를 1×105cell/ml로 조정하여 96 well plate에 platting 한 후, 농도 별로 준비된 천년초 추출물을 20 μl씩 첨가하여 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
동결 건조하여 얻은 천년초 추출물 분말을 각각 에탄올로 용해하여 1, 10, 50, 100 μg/ml농도로 조절하여 0.2 μm membrane filter로 여과한 후 실험에 사용하였다.
배양 후 배지를 제거하고 DMSO (dimethyl sulfoxide)를 100 μl 씩 첨가하여 생성된 불용성의 formazan 결정을 용해시킨 뒤 ELISA reader로 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 세포 증식률은 천년초 추출물의 흡광도를 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 나타내었다.
분화유도를 위해 5 mM β-glycerol phosphate (Sigma Chem. Co., St. Louis. MO., USA)와 50 mg/ml의 vitamin C (Sigma)를 첨가하여 분화유도 배지로 사용하였으며, 3일마다 배지를 교환하였다.
1 N NaOH로 반응을 정지하고 200 μl 를 취해 405 nm에서 흡광도를 측정하여 ALP 효소에 의해 p-nitrophenol로 전환된 양을 산출하였다. 세포수의 차이가 ALP 활성도에 영향을 미칠 수 있으므로 총 단백질 양을 측정하여 나누어 줌으로써 단위 세포 수에 대한 ALP 활성도를 계산하였다.
이에 최종농도가 5 μM이 되도록 DCF-DA를 첨가하여 형광발광을 막기 위해 conical tube로 감싼 후 37℃에서 2시간 shaking incubation하고 원심분리를 하여 HBSS를 제거한 후 PBS로 2회 세척하였다.
천년초 추출물을 첨가하여 배양한 MC3T3-E1 세포를 PBS로 2회 세척한 후 Bouin's fluid (saturated picric acid:35% formaldehyde:glacial acetic acid=15:5:1)로 1시간 고정하였다.
대상 데이터
본 실험에서 사용한 천년초(Opuntia humifusa, OH)의 열매와 줄기는2010년 10월 전남 여수시 돌산읍 라파엘 농장에서 구입하여 물로 4～5회 씻어 가시와 불순물을 제거하였다. 세척된 천년초는 열매와 줄기 부분을 분리 한 뒤 동결 건조하여 열매는 다시 씨와 껍질로 분리 하였다.
본 실험에서는 경희대학교 의과대학 내분비 연구실에서 분양 받은 mouse calvaria osteoblast cell 인 MC3T3-E1 세포를 사용하였다. 세포는 10% FBS (Gibco)와 1% penicillin (Gibco)를 첨가한 α-MEM 배지(Gibco BRL, Grand islane, N.
세척된 천년초는 열매와 줄기 부분을 분리 한 뒤 동결 건조하여 열매는 다시 씨와 껍질로 분리 하였다. 분리된 천년초의 껍질, 씨 그리고 줄기는 분쇄하여 실험에 사용하였으며 추출용매의 극성을 달리하기 위하여 물과 70% 에탄올을 추출용매로 사용하였다(Table 1). 100 g의 건조된 시료에 물과 70% 에탄올 2 l를 각각 가해 80℃에서 4시간 추출하여 농축하고 건조하여 분말화하였다.
세포는 10% FBS (Gibco)와 1% penicillin (Gibco)를 첨가한 α-MEM 배지(Gibco BRL, Grand islane, N.Y., USA)로 2-3일 마다 교환하면서 37℃, 5%의 CO2 incubator에서 배양하여 사용하였다.
데이터처리
사후검증은 Tukey 를 적용하였고 α<0.05수준에서 유의수준을 검증하였다.
연구결과 얻어진 자료를 SPSS 통계 프로그램을 사용하여 하위그룹 각각의 기술 통계치(mean, SD)를 산출하였다. 사후검증은 Tukey 를 적용하였고 α<0.
이론/모형
시료의 농도 별 처리에 따른 조골세포의 세포 증식은 Green 등의 방법에 따라 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, sigma) 시약의 환원 정도를 측정하는 MTT assay 방법을 사용하여 측정하였다. MC3T3-E1 세포를 0.
성능/효과
0.3 mM H2O2 투여 후의 조골세포 내의 ROS 생성 수준은 천년초 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 형광 강도가 감소하는 경향을 보였으며, 특히 씨 열수 추출물의 50 μg/ml 및 100 μg/ml 경우는 대조군에 비해 50% 정도 ROS가 생성된 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4).
MC3T3-E1 세포에 천년초 열수 또는 에탄올 추출물 10 μg/ml 이상 첨가한 모든 군에서 대조군과 비교하여 유의적인 증식률을 나타내었다.
4). 따라서 천년초 씨 추출물이 세포 내에서 높은 항산화력을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
조골세포 증식과 관련한 천연 식물의 연구에서 전[11]에 의하면 해조류인 톳 분획물의 경우 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였고, 특히 butanol 분획물에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 본 연구에서는 천년초 추출물을 사용하였으나, 톳 분획물과 거의 유사한 활성을 나타내어 골 형성 소재로써 활용 가능성이 충분히 있음을 확인하였다.
천년초의 성분을 분석한 결과 flavonoid 계열 중 flavanone 계통의 taxifolin [19] 등과 다량의 vitamin C가 함유되어 있다[39]는 보고가 있는데 이들 성분들이 조골세포의 분화에 영향을 미치는 것으로 보인다. 이상의 결과로 황금 추출물[35], 아보카도 과피 및 씨 추출물[18]에서 조골세포의 ALP 활성을 증가시켰다는 보고와 유사하게 천년초 추출물에서도 ALP 활성을 가짐을 확인하였다. ALP는 조골세포의 분화에 발현되는 분화 표식인자이므로 이러한 결과는 조골세포의 ALP 발현을 증가시켜 조골세포의 분화에 영향을 줄 가능성을 제시했다.
조골세포의 ALP 활성은 천년초 추출물을 10~50 μg/ml 첨가하였을 때, 열수 및 에탄올 추출물 모두 대조군과 비교하여 유의적으로 증가하였다(Fig. 2).
천년초 추출물을 10~100 μg/ml 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 유의적으로 증가된 collagen 합성능을 보였다.
특히, 100 μg/ml 씨 열수 추출물을 첨가하였을 때, 대조군과 비교하여 가장 높은 120% 정도의 증식률을 나타내었다.
특히, 씨 열수 추출물과 씨 에탄올 추출물의 50~100 μg/ml 농도에서 높은 합성능을 나타내었으며 그 중 씨 열수 추출물 100 μg/ml가 collagen 합성에 가장 효율적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
후속연구
활성산소(ROS)는 생체세포를 공격하여 DNA, RNA를 파괴하는 등 암을 발생시키고 노화를 촉진시키지만 한편으로는 병원체나 이물질을 제거하기 위한 생체 방어 과정에서 O2, H2O2와 같은 활성산소가 대량 발생하여 이들의 강한 살균작용을 통해 병원체로부터 인체를 보호하는 양면성을 가지므로[16] 이의 상관관계에 따른 추가적인 연구가 필요하다고 사료 된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
본 연구에서 조골세포 연구에 사용하는 MC3T3-E1의 특징과 활용 분야는 무엇인가?
골세포의 배양법은 골의 대사, 골세포의 생성 및 분화 등의 연구와 골 대사에 미치는 효과, 식품유래 천연물질의 골 대사 조절물질을 검색하는데 비교적 간편하면서 유용한 방법으로 알려져 있다[6,32]. 본 연구에 사용한 mouse calvaria 유래의 MC3T3-E1 세포는 in vivo 골 형성 과정에서 나타나는 세포의 증식, 분화, 석회화 등 골아세포와 유사한 대사적 특징을 가지고 있으므로, 골세포의 세포 활성과 관련된 연구에서 유용하게 이용되어 왔다[14].
신 작물로 개발이 유망되는 천년초 선인장의 특성은?
본 연구에 사용된 천년초 선인장(일명 손바닥 선인장)은 우리나라에서 자생하는 ‘Opuntia'속 선인장 중 제주도 등지에서 생존하는 다년생 현화식물이다[38]. 천년초 선인장은 줄기의 길이가 30∼40 cm, 영하 20℃의 혹한에서도 자체수분을 절반 이하로 감소시켜 얼어 죽지 않고 생명력을 유지하는 특성을 갖고 있어 지역특화산업을 위한 신 작물로의 개발이 유망 시 되고 있다. 예로부터 본초강목과 중앙대사전에 의하면, 선인장 즙을 마시면 변비치료, 이뇨효과, 장 운동의 활성화 및 식욕 증진 효능이 있고, 피부질환 및 화상치료에도 사용되어 왔다고 한다[22].
조골세포란?
조골세포는 골조직의 세포 외 기질을 합성하고, 기질의 침착과 석회화를 조절하는 골격계의 주된 세포이며[29], 연골세포(contracts), 간엽줄기 분화세포(myocytes) 및 지방세포(adipocytes)로 분화가 가능한 골 기질 합성과 석회화에 관여하는 세포이다[13]. 세포막에는 당단백 효소인 alkaline phosphatase (ALP)가 존재하고 있으며, 이는 기질 특이성과 염기성 pH에서 최적의 활성을 나타내고 세포의 외막과 석회화 조직의 기질 소포에서 높은 농도로 존재한다[6].
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