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문제 정의
- 한편, 주름 미더덕은 크기에 따라 작은 것은 비교적 상품 가치가 떨어져서 이의 기능성을 규명하여 산업적 활용을 향상시킬 필요가 있다. 이에 본 연구에서는 주름 미더덕의 채취시기인 8～12월 사이의 기간 중 매 1개월마다 채취한 주름 미더덕을 크기별로 구분하여 4가지(메탄올, 에탄올, 아세톤, 물) 용매로 추출한 후 항산화능, 항유전 독성능과 항고혈압능을 분석하여 기능성 소재로 활용될 때의 최적조건을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 각 추출물의 항산화 활성과 항고혈압 활성을 DPPH 라디칼 소거능과 환원력, 그리고 ACE 저해능으로 분석하였다.
- 1, 5 그리고 10 mg/mL 농도로 희석한 주름 미더덕의 물 추출물 50 μL에 ACE 조효소액 50 μL를 가한 37℃에서 10분간 예비 반응시킨 후, 25 mM HHL 100 μL를 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시켰다.
- 20 μL/mL 농도의 EtBr로 핵을 염색하여 덮개 유리로 덮은 뒤 형광현미경(Leica Camera, Solms, Germany) 상에서 관찰하였다.
- CCD 카메라(Nikon Co., Tokyo, Japan)를 통해 보내진 각각의 세포핵 영상은 Komet 5.0 comet image analyzing system(Kinetic Imaging Ltd., Nottingham, UK)이 설치된 컴퓨터에서 분석하였다.
- 건조한 주름 미더덕을 다시 분쇄기(Mixer HR 2870, Philips Electronics)를 이용하여 분말로 만들어 27 mesh의 체로 걸러 분말의 크기를 일정하게 하였다. 각각의 시료 50 g에 1 L의 용매(메탄올, 에탄올, 아세톤, 증류수)를 각각 가하여 진탕배양기(HB-201s, Hanback Co., Seoul, Korea)에서 25℃, 100 rpm의 조건으로 24시간 동안 추출하였다. 각각의 추출 시료는 여과지(Whatman No.
- 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 미더덕 추출물에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA % 함량을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- , Seoul, Korea)로 건조하였다. 건조한 주름 미더덕을 다시 분쇄기(Mixer HR 2870, Philips Electronics)를 이용하여 분말로 만들어 27 mesh의 체로 걸러 분말의 크기를 일정하게 하였다. 각각의 시료 50 g에 1 L의 용매(메탄올, 에탄올, 아세톤, 증류수)를 각각 가하여 진탕배양기(HB-201s, Hanback Co.
- 구입한 주름 미더덕은 이물질을 제거하고 물로 깨끗이 여러 번 씻어 물기를 제거한 후, 크기별로 큰 것(9.82～11.66 g)과 작은 것(0.93～2.21 g)으로 나눈 뒤 각각을 분쇄기(HR2870, Philips Electronics, Eindhoven, Netherlands)로 분쇄하였다. -70℃에서 동결한 후 동결건조기(FD 5512, Ilshin Lab Co.
- 대조구로서는 추출물 대신 추출용매 50 μL를 가해 실험하였으며, ACE 저해활성 효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.
- , Nottingham, UK)이 설치된 컴퓨터에서 분석하였다. 백혈구의 H2O2에 의한 DNA 손상 및 미더덕 추출물에 의한 손상억제 정도는 핵으로부터 이동해서 꼬리 부분으로 떨어져 나간 꼬리 부분 내 DNA % 함량을 측정하여 나타내었다. 각각의 처리구에서 2개의 슬라이드를 만들어 각각 100개 세포의 DNA 손상 정도를 측정하고 각 처리구는 최소 3회 반복 실험하였다.
- Lysis가 끝난 후, 슬라이드를 전기영동 탱크에 배열하고 4℃의 차가운 전기영동 buffer(300 mM NaOH, 10 mM Na2EDTA, pH>13)를 채워 20분 동안 unwinding시켜 DNA의 alkali labile sites가 드러나게 한 후 25 V/300±3 mA의 전압을 걸어 20분간 전기영동을 실시하였다. 빛에 의해 DNA가 부가적으로 손상되는 것을 방지하기 위해 위의 과정은 전기영동 탱크를 어두운 천으로 덮은 채 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 0.
- 양성 대조구를 위해 주름 미더덕 시료 대신 용매인 DMSO를 처리한 후 200 μM H2O2를 처리하였고, 음성 대조구 세포에는 H2O2를 처리하지 않았다.
- 주름 미더덕(Styela plicata)을 8월부터 12월까지 매월 1회 채취하여 크기에 따라 큰 것(9.82～11.66 g)과 작은 것(0.93～2.21 g)으로 분류한 후 네 가지 용매(메탄올, 에탄올, 아세톤, 물)로 각각 추출ㆍ농축하여 추출물을 제조하였다.
대상 데이터
- (Siheung, Korea)에서 구입하였으며, 추출에 이용된 용매는 모두 1급 이상의 등급을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 주름 미더덕은 미더덕 영업조합법인(Changwon, Korea)에서 2009년 8월부터 12월까지 월별로 구입하였다.
- 혈액 내 백혈구 세포 분리: 신선한 전혈 5 mL을 Histopaque 1077(Sigma-Aldrich Co.)를 이용해 백혈구만을 분리해 낸 후 본 실험에 사용하였다.
데이터처리
- DPPH 라디칼 소거능, 환원력, 그리고 ACE 저해 활성에 대한 데이터의 통계처리는 각 시료 당 3회 반복으로 행해졌으며, SAS(Statistical Analysis System)를 이용하여 평균과 표준오차, Student-Newman-Keul's multiple range tests로 평균값들에 대해 유의성을 검정하였다(20).
- 각 시료처리에 따른 DNA 손상 정도는 ANOVA를 시행한 후 Duncan' multiple range test를 통해 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- ACE 저해 활성 측정은 Cushman과 Cheung(19)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, 50 mM sodium borate buffer(pH 8.
- DPPH 라디칼 소거능은 Jeong 등의 방법(17)에 준하여 시료 0.1 mL에 4.1×10-5 M의 DPPH 용액 0.9 mL를 가한 후 상온에서 30분간 반응시켜 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 그 후 Singh 등(25)에 의해 보다 민감하게 DNA 손상을 감지할 수 있도록 변경되었으며 이는 in vitro, in vivo 연구뿐 아니라 분자 역학적인 분야에서 다양하게 활용되고 있다. 본 연구에서는 Singh 등(25)의 방법대로 comet assay를 수행하여 다양한 주름 미더덕 추출물의 DNA 손상 억제 효과를 확인하였다(Table 5). 채취시기에 따른 DNA 손상 억제 효과의 차이는 큰 주름 미더덕의 아세톤과 에탄올 추출물에서 현저한 반면, 작은 주름 미더덕의 경우 모든 용매 추출물에서 그 차이가 미미했으며 특히 작은 주름 미더덕의 물 추출물은 채취시기에 따른 차이가 전혀 나타나지 않았다.
- 환원력은 Oyaizu의 방법(18)에 따라 측정하였다. 즉, 1 mL의 인산염 완충 용액(0.
성능/효과
- DPPH 라디칼 소거능은 11월에 채취된 큰 주름 미더덕의 아세톤 추출물이 가장 높았고, 환원력은 11월의 작은 미더덕의 아세톤 추출물이 가장 높았다.
- DPPH 라디칼 소거능의 경우와 비슷하게 11월에 채취된 주름 미더덕의 아세톤 추출물에서 가장 높은 환원력을 보였는데, 큰 것은 1.097, 작은 것은 1.724로 작은 것이 더 좋은 활성을 나타내었다.
- 11월과 12월에 채취한 주름 미더덕의 아세톤 추출물이 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였으며, 그중에서도 11월의 크기가 큰 주름 미더덕의 아세톤 추출물이 44.59%로 가장 높았으며, 큰 미더덕의 12월과 8월의 아세톤과 물 추출물이 40.93%와 40.01%로 뒤를 이었다.
- DPPH 라디칼 소거능과 환원력의 상관관계를 분석하였을 때 큰 주름 미더덕은 r2=0.633(p<0.05)의 상관계수를 보였으며, 작은 것은 r2=0.284(p<0.05)의 상관계수로 큰 것보다 낮았다.
- 또한 8월 또는 9월 채취한 큰 주름 미더덕의 DNA 손상 억제효과는 월등하였으며 특히 9월에 채취한 것의 물, 메탄올, 에탄올 추출물은 인위적으로 산화적 스트레스를 유도한 양성 대조구에 대한 DNA 손상저해율이 각각 56.54, 55.83, 48.63%로 나타나 항유전 독성효과가 큼을 알 수 있었다.
- 또한 주름 미더덕은 채취시기, 크기, 추출용매에 상관없이 거의 모든 시료에서 H2O2에 의해 유도된 백혈구의 DNA 손상을 억제하는 것으로 나타났으며 그 효과는 특히 8월 또는 9월에 채취한 큰 주름 미더덕이 월등함을 알 수 있었다.
- 모든 경우에서 주름 미더덕 물 추출물의 농도가 증가할수록 ACE 저해능은 증가하였다.
- 이상의 결과로 주름 미더덕이 채취시기와 크기에 따라 구성물이 달라지면서 항산화 또는 ACE 저해능과 같은 생리활성 기능이 달라짐을 알 수 있었다. 특히 11월에 채취한 주름 미더덕이 다른 시기에 비해 비교적 항산화력과 ACE 저해능이 높았다.
- 주름 미더덕을 생산 시기에서 각 1개월 간격으로 채취하여 크기에 따라 대, 소로 나누어 건조한 후 고형분 함량을 Table 1에 나타내었다. 전체적으로 볼 때 8월을 제외하고는 작은 크기의 주름 미더덕이 큰 것보다 고형분 함량이 높았다. 특히, 9월에는 큰 것과 작은 것 모두 해당 크기에서 가장 고형분 함량이 높았고, 9월의 작은 주름 미더덕이 13.
- 특히 11월에 채취한 주름 미더덕이 다른 시기에 비해 비교적 항산화력과 ACE 저해능이 높았다.
- 전체적으로 볼 때 8월을 제외하고는 작은 크기의 주름 미더덕이 큰 것보다 고형분 함량이 높았다. 특히, 9월에는 큰 것과 작은 것 모두 해당 크기에서 가장 고형분 함량이 높았고, 9월의 작은 주름 미더덕이 13.02%의 가장 높은 값을 보였다. 10월, 11월에 고형분 함량이 감소하다가 12월에 다시 증가하는 현상을 보이는데, 이는 7～9월에 산란하며 10～12월에 성장하는 주름 미더덕의 생활사와 관계가 있는 것으로 보인다.
- 한편 주름 미더덕의 DNA 손상 억제 효과에 있어서 추출 용매에 따른 차이는 11월 채취한 큰 주름 미더덕과 작은 주름 미더덕에서는 유의적인 차이가 없는 등 대체적으로 그 차이가 미미한 것으로 나타났지만 큰 주름 미더덕의 9월 또는 12월, 작은 주름 미더덕의 8월 또는 9월의 물 추출물은 다른 용매 추출물에 비해 DNA 손상 억제효과가 큰 경향을 보이며 특히 12월 채취한 큰 주름 미더덕의 물 추출물은 DNA 손상 저해율이 50.30%로 아세톤 추출물 13.24%에 비해 현저하게 높은 것을 알 수 있었다.
후속연구
- 또한 DNA 손상 억제에 있어서 추출 용매별 차이는 미미한 것으로 나타났으며 오히려 일부 물 추출물은 다른 용매 추출물에 비해 그 효과가 큰 것으로 나타나 끓이기 등의 일상 조리를 통한 주름 미더덕의 유효 성분 섭취를 기대할 수 있겠다.
- 신선한 주름 미더덕의 DPPH 라디칼을 조사하였을 때 아세톤 추출물이 다른 용매에 비해 높았고(1), 주름 미더덕의 아세톤 추출물이 대장암 세포주 HT-29에 대해 높은 세포 독성을 나타낸 것으로 볼 때(9) 앞으로 주름 미더덕의 아세톤 추출물에 대한 추가 연구가 기대된다.
- 이러한 결과는 DPPH 라디칼 소거능 및 환원력이 11～12월 채취한 주름 미더덕이 더 효과적이었던 것과 대조되는 결과로써 ex vivo에서 나타난 항유전독성 결과는 in vitro 라디칼 소거능, 환원력에 기여한 것으로 여겨지는 주름 미더덕 내 β-carotene, β-cryptoxanthin, zeaxanthin 등을 비롯한 carotenoids류 외 다른 잠재적인 성분에서 비롯된 결과로 사료되며 이를 뒷받침할 추후 연구가 필요할 것이다.
- 이상의 결과로 채취시기, 크기, 용매에 따라 항산화, 항유전 독성 및 ACE 저해능의 차이가 있으며, 이는 주름 미더덕을 기능성 소재로 활용할 때 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
- 특히 11월에 채취한 주름 미더덕이 다른 시기에 비해 비교적 항산화력과 ACE 저해능이 높았다. 향후 주름 미더덕의 기능성을 활용할 제품을 개발할 때에는 시기를 잘 선택함이 중요함을 시사한다.
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