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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 Raw 264.7 세포와 B16F10 세포에 대한 chloroform과 ethyl acetate 분획의 세포독성을 감안하여 100 µg/ml 이하의 농도에서 melanin 생성 억제 활성 실험을 진행하였다.
- 2,13) 한편, 일반적으로 피부 미백 효과와 항산화 활성은 연관성이 높은 것으로 알려져 있는데, 작약에 대한 항산화 활성이 일부 연구에서 보고되고 있어 피부 미백 활성에 대한 가능성이 높을 것으로 판단된다14-16). 따라서 본 연구에서는 작약 메탄올 추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성을 비롯한 tyrosinase 저해 및 melanin 생성 억제 활성 등을 조사하여 피부 미백 관련 기능성 소재로서의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 본 연구에서는 피부 미백과 관련된 작약의 활성을 탐색하기 위해 methanol 추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성, tyrosinase 저해 활성, melanin 생성 억제 활성, 세포독성 등을 조사하였다. 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 polyphenol 함량이 514.
가설 설정
- 3)Values are mean±SD (n=6).
제안 방법
- DPPH radical 소거능 − 작약 methanol 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 실시한 DPPH radical 소거능 측정 결과를 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 시료농도를 나타내는 SC50으로 Table II에 나타내었다.
- DPPH radical 소거능 측정 − 작약 추출물과 분획물의 항산화활성을 비교하기 위해 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 사용하여 radical 소거능을 측정하였다.
- Melanin 생성 억제 활성 측정 − B16F10 세포를 48-well plate에 1×104 cells/well의 농도로 분주하여 24시간 배양하여 부착 및 안정화시킨 후, 농도별로 희석한 시료와 αmelanocyte stimulating hormone (a-MSH)를 처리하여 72시간 동안 배양한 후 생성된 melanin양을 405 nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.
- PBS에 5 mg/ml의 농도로 용해시켜 제조한 MTT용액을 각 well에 10 µl씩 가하고, 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간 동안 반응시켜 MTT가 환원되도록 하였다.
- Tyrosinase 저해 활성 측정 − Tyrosinase의 작용 결과 생성되는 DOPA chrome을 비색법에 의해 측정하는 방법을 변형하여 측정하였다.
- 배지를 제거한 후, 각 well에 100 µl의 DMSO를 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시켜 540nm에서 흡광도를 측정하였으며, 시료액 대신 PBS를 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 세포 생존율 산출하였다.
- 18) Methanol에 농도별로 용해시킨 각 시료액 20 µl와 200 µM DPPH 용액 180 µl를 혼합하여 15분간 암실에서 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료액 대신 methanol을 사용한 blank의 흡광도를 기준으로 소거능을 산출하였으며, 50%의 DPPH radical을 소거하는데 필요한 농도 (SC50)를 추가적으로 계산하였다. Positive control로 ascorbic acid (vitamin C)를 사용하였다.
- 추출 및 분획 − 작약 시료 500 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 메탄올 10 l를 추출 용매로 하여 상온에서 48시간씩 3회 반복하여 추출을 실시하였다.
- 추출 및 분획 − 작약 시료 500 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 메탄올 10 l를 추출 용매로 하여 상온에서 48시간씩 3회 반복하여 추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 추출물 106 g (수율 21.20%)을 얻었으며, 이 중 60 g을 증류수 1 l에 분산시킨 후 동량의 chloroform, ethylacetate, butanol을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4°C 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였는데, chloroform, ethylacetate, butanol 및 aqueous 분획의 수율은 각각 5.
- 표준물질로 tannic acid를 0~500 µg/ml의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 표준 검량선을 작성하고 페놀성 화합물의 함량을 mg/g tannic acid로 나타내었다.
대상 데이터
- 7 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다. B16F10 세포는 동일한 조건에서 phenol-red가 포함되지 않은 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.
- 세포주 배양 − 세포독성 실험에 사용된 Raw 264.7 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin을 혼합한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 실험 재료 − 본 실험에 사용한 작약은 2011년 6월 전라남도 화순의 생약농업협동조합에서 구입한 것으로 4°C 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Different superscript letters in the same concentration without gentamycin show significant differences at p<0.05 by one-way ANOVA.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.
- 통계분석 − 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차 (mean±SD)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- MTT assay에 의한 세포독성 측정 − 작약 추출물 및 분획물의 세포에 대한 독성은 MTT assay 방법에 의해 측정하였다.
- 총 polyphenol 함량 측정 − Folin-Denis법을 이용하여 열수 추출물 및 분획물의 페놀성 화합물 함량을 측정하였다.
성능/효과
- 1) 물론 tyrosinase-related protein-1 (TRP-1)과 tyrosinase-related protein-2 (TRP-2) 등도 melanin 생합성 경로에 일부 관여하는 것으로 알려져 있으나 tyrosinase가 필수적이면서도 다양한 과정에 작용한다는 점에서 피부 미백활성을 측정하는데 효과적인 것으로 알려져 있다.2) Fig. 1에 나타낸 바와 같이 실험이 실시된 농도에서 ethyl acetate 분획의 tyrosinase 저해 활성이 높은 수준임이 확인되었다. 특히, positive control로 사용된 arbutin의 활성과 비교해서 100 µg/ml에서는 각각 22.
- 50 µg/ml 농도에서 ethyl acetate 분획의 melanin 생성 억제율은 99.99%로서 positive control로 사용된 arbutin의 동일한 농도에서의 생성 억제율인 59.32% 뿐만 아니라 100 µg/ml 농도에서의 생성 억제율인 76.11% 보다도 높은 활성을 나타내었다.
- Tyrosinase 저해 활성에서도 ethyl acetate 분획의 저해 활성이 가장 높은 수준으로 확인되었으며, positive control로 사용된 arbutin에 비해서도 농도에 따라서 동등 이상의 저해활성을 나타내었다. B16F10 세포를 대상으로 실시한 melanin생성 억제 활성 측정에서, 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위에서 ethyl acetate 분획이 positive control로 사용된 arbutin보다도 높은 생성 억제 활성을 나타내었다. 결과적으로 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획이 항산화 및 tyrosinase 저해활성, melanin 생성 억제 활성이 뛰어난 것으로 나타나 피부 미백과 관련된 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다.
- 50 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였으며, DPPH radical 소거능 측정 결과에서도 ethyl acetate 분획의 활성이 positive control로 사용된 ascorbic acid보다도 높은 수준임을 확인할 수 있었다. Tyrosinase 저해 활성에서도 ethyl acetate 분획의 저해 활성이 가장 높은 수준으로 확인되었으며, positive control로 사용된 arbutin에 비해서도 농도에 따라서 동등 이상의 저해활성을 나타내었다. B16F10 세포를 대상으로 실시한 melanin생성 억제 활성 측정에서, 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위에서 ethyl acetate 분획이 positive control로 사용된 arbutin보다도 높은 생성 억제 활성을 나타내었다.
- 가장 소거능이 높게 나타난 시료는 ethyl acetate 분획으로 3.86 µg/ml의 SC50으로 positive control로 사용된 ascorbic acid의 활성보다도 높게 나타났다.
- B16F10 세포를 대상으로 실시한 melanin생성 억제 활성 측정에서, 세포독성을 나타내지 않는 농도 범위에서 ethyl acetate 분획이 positive control로 사용된 arbutin보다도 높은 생성 억제 활성을 나타내었다. 결과적으로 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획이 항산화 및 tyrosinase 저해활성, melanin 생성 억제 활성이 뛰어난 것으로 나타나 피부 미백과 관련된 기능성 소재로서의 가능성을 확인하였다.
- 50 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. 다음으로는 butanol 분획에서 116.08 mg/g로 나타나 ethyl acetate 분획과 butanol 분획이 추출물보다 polyphenol 함량이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 특히, ethyl acetate 분획의 polyphenol 함량은 산벚나무 등 기존 연구에서 polyphenol 함량이 높다고 알려진 식물 추출물 분획의 함량보다도 높게 나타나 관련된 활성을 기대할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 이와 같은 DPPH radical 소거능은 positive control로 사용된 ascorbic acid의 SC50인 6.15 µg/ml를 100.00%로 하여 환산한 relative activity에서 ethyl acetate와 butanol 분획이 각각 159.33%와 11.94%에 해당하는 항산화 활성을 보이는 것으로 평가할 수 있었다.
- 본 연구에서는 피부 미백과 관련된 작약의 활성을 탐색하기 위해 methanol 추출물과 그 용매별 분획물의 항산화 활성, tyrosinase 저해 활성, melanin 생성 억제 활성, 세포독성 등을 조사하였다. 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 polyphenol 함량이 514.50 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였으며, DPPH radical 소거능 측정 결과에서도 ethyl acetate 분획의 활성이 positive control로 사용된 ascorbic acid보다도 높은 수준임을 확인할 수 있었다. Tyrosinase 저해 활성에서도 ethyl acetate 분획의 저해 활성이 가장 높은 수준으로 확인되었으며, positive control로 사용된 arbutin에 비해서도 농도에 따라서 동등 이상의 저해활성을 나타내었다.
- 21,22) 작약 methanol 추출물과 분획물의 총 polyphenol 함량 측정 결과를 Table I에 나타내었다. 추출물의 polyphenol 함량이 73.45 mg/g으로 측정되었으며, 분획물 중에서는 ethyl acetate 분획의 polyphenol 함량이 514.50 mg/g으로 나타나 가장 높은 함량을 보였다. 다음으로는 butanol 분획에서 116.
- 11% 보다도 높은 활성을 나타내었다. 특히 MTT assay에 의한 B16F10 세포 생존율에서 세포독성을 나타내지 않은 농도에서의 melanin 생성 억제율임으로 ethyl acetate 분획물이 melanin 생합성 과정을 억제시켜 생성량을 감소시키는 것으로 판단할 수 있었다. Fig.
- 특히, positive control로 사용된 arbutin의 활성과 비교해서 100 µg/ml에서는 각각 22.49%와 24.61%로 동일한 수준이었으며, 500 µg/ml에서는 arbutin의 저해율인 64.57% 보다도 높은 85.49%의 저해율을 나타냄으로써 tyrosinase 저해제로서 가능성이 높음을 알 수 있었다.
후속연구
- 특히 MTT assay에 의한 B16F10 세포 생존율에서 세포독성을 나타내지 않은 농도에서의 melanin 생성 억제율임으로 ethyl acetate 분획물이 melanin 생합성 과정을 억제시켜 생성량을 감소시키는 것으로 판단할 수 있었다. Fig. 1의 tyrosinase 저해활성 결과와 연관시켜 보면 melanin 생합성 과정 중 단순히 tyrosinase만을 저해하는 것이 아니라 TRP-1이나 TRP-2 등 다른 요소에도 작용하는 등 보다 복합적일 것으로 추측되며, 이는 실험이 실시된 농도보다 낮은 조건에서의 활성 등을 포함한 추가적인 연구를 통해 구체적인 규명이 필요할 것으로 판단된다.
- 08 mg/g로 나타나 ethyl acetate 분획과 butanol 분획이 추출물보다 polyphenol 함량이 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 특히, ethyl acetate 분획의 polyphenol 함량은 산벚나무 등 기존 연구에서 polyphenol 함량이 높다고 알려진 식물 추출물 분획의 함량보다도 높게 나타나 관련된 활성을 기대할 수 있을 것으로 판단되었다.5,6)
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