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문제 정의
- 본 연구에서는 작약 메탄올 추출물과 그 용매별 분획물의 NO 생성 억제 및 소거 활성과 피부 질환과 관련성이 높은 병원성 세균에 대한 항균 활성, 그리고 in vitro 조건의 독성 연구에서 세포독성 측정 방법으로 자주 이용되고 있는 lactate dehydrogenase (LDH) assay를 이용한 세포독성 등을 조사하여 관련 분야에 활용될 수 있는 기초 자료를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- 1% sulfanilamide (in 30% acetic acid) 60 µl를 혼합하고 5분후 다시 0.1% N-(naphtyl) ethylenediamine dihydrochloride (in 60% acetic acid) 60 µl 를 혼합하여 30분간 실온에서 반응시킨 후 520 nm에서 흡 광도를 측정하였으며, 시료액 대신 증류수를 사용한 대조군의 결과를 기준으로 소거능을 계산하였다.
- 1% naphtyl-ethylendiamine dihydrochloride (in H2O)를 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켜 micro-plate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Blank 는 시료액 대신 PBS를 가하여 측정하였으며, 표준물질로 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 동일한 방법으로 측정한 흡광도를 바탕으로 작성한 검량선을 이용하여 NO 생성량을 산출하였다.20)
- Latate dehydrogenase (LDH) assay에 의한 세포독성 측정 − 세포 사멸시 세포막의 손상으로 인해 발생되는 LDH 의 양을 측정하는 LDH cytotoxicity detection kit (TaKaRa, Shiga, Japan)를 사용하여 세포 독성을 확인하였다.
- Nitric oxide 소거능 측정 − Nitric oxide 소거능은 Marcocci 등의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다.
- 상등액 100 µl와 LDH reagent 100 µl를 혼합하여 30분간 암조건에서 반응 시킨 다음 stop solution으로 1N HCl 50 µl 를 가한 후 490 nm에서 흡광도를 측정하여 LDH 방출량을 비교하였다.
- 작약의 병원성 세균에 대한 항균활성과 항염증 활성과 관련 활성을 확인하기 위해 methanol 추출물과 그 용매별분획물을 대상으로 disc diffusion assay에 의한 항균활성, NO 생성 억제 및 소거 효과 등을 조사하였다. S.
- 추출 및 분획 − 작약 시료 500 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 메탄올 10 l를 추출 용매로 하여 상온에서 48시간씩 3회 반복하여 추출을 실시하였다.
- 추출 및 분획 − 작약 시료 500 g을 blender를 사용하여 마쇄한 후 메탄올 10 l를 추출 용매로 하여 상온에서 48시간씩 3회 반복하여 추출을 실시하였다. 추출액은 여과와 농축 및 동결건조를 실시하여 추출물 106 g (수율 21.20%)을 얻었으며, 이 중 60 g을 증류수 1 l에 분산시킨 후 동량의 chloroform, ethylacetate, butanol을 사용하여 순차적으로 3회 반복하여 용매분획을 실시하였다. 분획된 시료는 여과와 농축 및 동결건조 후 추출물과 함께 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였는데, chloroform, ethylacetate, nbutanol 및 aqueous 분획의 수율은 각각 5.
- 항균시험용 평판배지는 계대 배양된 각 균주를 멸균 면봉을 이용하여 100 µl씩 도말하여 준비하였고, 시료를 disc당 0.25-0.5-1.0 mg이 되도록 paper disc(직경 6 mm)에 천천히 흡수시킨 뒤 건조과정을 거쳐 용매를 휘발시킨 후 평판배지 위에 밀착시킨 상태로 37℃에서 24시간 배양한후 disc 주변에 생성된 저해환(clear zone, mm)을 측정하여 항균활성을 비교하였다.
대상 데이터
- 사용 균주 및 세포주 − 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주인 Staphylococcus epidermidis (KCTC 1917), Staphylococcus aureus (KCTC 3881), Pseudomonas aeruginosa (KCTC 2004)와 세포독성 실험에 사용된 동물세포주인 RAW 264.7은 한국생명공학연구원 생명자원센터 (BRC)에서 분양 받은 것을 사용하였다.
- 실험 재료 − 본 실험에 사용한 작약은 2011년 6월 전라 남도 화순의 생약농업협동조합에서 구입한 것으로 4℃ 이하로 냉장보관하면서 실험에 사용하였다.
- 항균 활성 − 본 연구의 항균활성 실험에 사용된 미생물 균주는 그람양성 세균인 Staphylococcus epidermidis와 Staphylococcus aureus, 그리고 그람음성 세균인 Pseudomonas aeruginosa로 일반적으로 인간의 피부나 대기 등 환경 중에 존재하는 것을 알려져 있는 병원성 세균이다.
데이터처리
- Different superscript letters in the same concentration show significant differences at p<0.05 by one-way ANOVA.
- 각 군 간의 측정치 비교는 one-way analysis of variance (ANOVA)를 시행하였으며, 유의성은 신뢰구간 p<0.05에서 의미를 부여하였다.
- 통계분석 − 모든 측정값은 3회 이상 반복 실험한 결과의 평균값과 표준편차(mean ± SD)로 표시하였고, 각 실험군간의 통계학적 분석은 windows용 SPSS 12.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하였다.
이론/모형
- Disc diffusion assay에 의한 항균활성 측정 − 시료의 항균활성은 각 균주를 대상으로 disc diffusion assay로 측정 하였다.
- LDH assay에 의한 세포독성 − 작약 methanol 추출물과 분획물의 세포독성은 세포막이 파괴되면서 방출되는 물질로 알려져 있는 lactate dehydrogenase (LDH) 방출량을 기준으로 독성의 수준을 판단하는 LDH assay를 활용하였다.
성능/효과
- 2). Aqueous 분획을 제외한 모든 추출물 및 분획물에서 농도의존적인 소거능을 보였으며, 극성이 낮은 용매 분획이 상대적으로 높은 소거능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과에서 작약 methanol 추출물과 분회물이 NO 생성 자체를 억제할 뿐만 아니라 다양한 원인으로 이미 생성된 NO에 대한 소거 효과를 바탕으로 한 항염증 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 1과 같다. LPS가 미처리된 control에 비해 LPS 만 처리된 실험군에서 현저하게 높은 농도로 생성된 NO에 비해 시료가 처리된 실험군에서 농도에 따라 NO 생성을 억제한 결과를 확인할 수 있었다. 특히 chloroform과 ethyl acetate 분획물의 NO 생성 억제 효과가 강한 것으로 나타났으며, butanol이나 aqueous 분획의 경우는 추출물과 유사하거나 농도에 따라서는 낮은 효과를 보였다.
- 3에 나타내었다. NO 생성 억제 활성을 측정하였던 농도 구간을 대상으로 실시한 LDH 방출량 측정에서 시료를 처리하지 않은 대조군의 LDH 방출량과 비교하여 93.42~99.08% 수준으로 나타나 독성을 나타내는 수준은 아닌 것으로 판단되었다. 다만, ethyl acetate 분획물을 100 µg/ml로 처리한 실험군에서 116.
- 작약의 병원성 세균에 대한 항균활성과 항염증 활성과 관련 활성을 확인하기 위해 methanol 추출물과 그 용매별분획물을 대상으로 disc diffusion assay에 의한 항균활성, NO 생성 억제 및 소거 효과 등을 조사하였다. S. aureus, S. epidermidis 등 일반적인 환경이나 인체에 상재하는 병원성세균에 대한 항균활성 측정 결과, 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 다른 추출물과 분획물보다 높은 수준의 항균 활성을 확인할 수 있었다. 항염증 활성의 탐색에서 중요하게 다뤄지는 NO의 생성 억제 효과에서도 ethyl acetate 분획물에서 상대적으로 높은 활성이 확인되었으나 LDH assay 결과에서 실험이 실시된 가장 높은 농도에서 일부 독성의 가능성이 확인되었다.
- 모든 실험 균주에 대해 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획이 가장 강한 항균활성을 가지는 것으로 확인되었다. 다만, P. aeruginosa에 대해서는 실험이 실시된 농도 중 1 mg/disc에서만 항균력을 가지는 것으로 나타났으며, S. epidermidis에 대한 항균력이 가장 높은 수준으로 확인되었다. 분획물 중 다음으로 chloroform 분획이 높은 항균 활성으로 보였으나 녹농균인 P.
- 다만, ethyl acetate 분획물을 100 µg/ml로 처리한 실험군에서 116.71%의 LDH 방출량을 보임으로써 낮은 수준이기는 하지만 세포의 성장이나 분열을 저해할 수 있음이 확인되었다.
- 항염증 활성의 탐색에서 중요하게 다뤄지는 NO의 생성 억제 효과에서도 ethyl acetate 분획물에서 상대적으로 높은 활성이 확인되었으나 LDH assay 결과에서 실험이 실시된 가장 높은 농도에서 일부 독성의 가능성이 확인되었다. 따라서 추가적으로 실시된 NO 소거능 측정에서 가장 높은 활성을 보였고 세포독성도 없는 것으로 확인되었으며, NO 생성 억제 활성에서 ethyl acetate 분획 다음으로 높은 억제 활성을 나타낸 chloroform 분획이 항염증 활성 소재로서는 더 높은 가능성을 가지는 것으로 판단되었다.
- 작약 methanol 추출물과 용매별 분획물의 항균활성의 결과를 Table I에 나타냈다. 모든 실험 균주에 대해 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획이 가장 강한 항균활성을 가지는 것으로 확인되었다. 다만, P.
- aeruginosa에 대해서는 측정 농도에서 항균력을 나타내지 못했다. 이와 같은 항균 활성은 흰민들레 ethanol 추출물 및 ethyl acetate 분획 물의 항균 활성보다는 다소 낮은 것으로 판단할 수 있었으나 복분자 부위별 시료의 methanol 추출물을 대상으로 한 항균활성이나 산벚나무 수피 추출물 및 분획물의 항균활성과 비교해서는 유사하거나 더 높은 수준인 것으로 항균효과를 가지는 소재로서 작약의 이용 가능성을 확인하였다.4,5,21)한편, 기존 연구에서 보고한 작약의 항균활성으로 식품 변 패와 관련된 미생물과 어병 원인 세균 등에 대한 것이 있었으며, 특히 대장균 등의 식품 변패 원인균에 대한 항균 활성에서 ethyl acetate 분획이 가장 강한 항균력을 나타냈다는 보고는 본 연구의 결과와도 동일한 것이었다.
- 이와 같은 결과에서 작약 methanol 추출물과 분회물이 NO 생성 자체를 억제할 뿐만 아니라 다양한 원인으로 이미 생성된 NO에 대한 소거 효과를 바탕으로 한 항염증 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다. 최근 작약과 함께 다른 약재의 NO 생성 억해 활성을 추출물 수준에서 비교한 국내의 연구보고에 나타난 작약 추출물의 활성과 본 연구의 결과 중 추출물의 활성이 유사한 수준으로 나타난 것으로 확인되었다.11) 이러한 작약의 NO 생성 억제 활성이 추출물 중 ethyl acetate와 chloroform 분획에서 더 높은 것으로 나타남으로써 관련된 활성의 연구나 소재 개발 등에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- LPS가 미처리된 control에 비해 LPS 만 처리된 실험군에서 현저하게 높은 농도로 생성된 NO에 비해 시료가 처리된 실험군에서 농도에 따라 NO 생성을 억제한 결과를 확인할 수 있었다. 특히 chloroform과 ethyl acetate 분획물의 NO 생성 억제 효과가 강한 것으로 나타났으며, butanol이나 aqueous 분획의 경우는 추출물과 유사하거나 농도에 따라서는 낮은 효과를 보였다.
- 한편, 이미 생성된 NO를 소거할 수 있는 활성의 정도를 확인하기 위해 실시한 NO 소거능 측정에서 작약 methanol 추출물의 chloroform 분획물이 다른 분획에 비해 높은 소거 능을 가지는 것으로 나타났다(Fig. 2). Aqueous 분획을 제외한 모든 추출물 및 분획물에서 농도의존적인 소거능을 보였으며, 극성이 낮은 용매 분획이 상대적으로 높은 소거능을 가지는 것을 확인할 수 있었다.
- epidermidis 등 일반적인 환경이나 인체에 상재하는 병원성세균에 대한 항균활성 측정 결과, 작약 methanol 추출물의 ethyl acetate 분획에서 다른 추출물과 분획물보다 높은 수준의 항균 활성을 확인할 수 있었다. 항염증 활성의 탐색에서 중요하게 다뤄지는 NO의 생성 억제 효과에서도 ethyl acetate 분획물에서 상대적으로 높은 활성이 확인되었으나 LDH assay 결과에서 실험이 실시된 가장 높은 농도에서 일부 독성의 가능성이 확인되었다. 따라서 추가적으로 실시된 NO 소거능 측정에서 가장 높은 활성을 보였고 세포독성도 없는 것으로 확인되었으며, NO 생성 억제 활성에서 ethyl acetate 분획 다음으로 높은 억제 활성을 나타낸 chloroform 분획이 항염증 활성 소재로서는 더 높은 가능성을 가지는 것으로 판단되었다.
후속연구
- 최근 작약과 함께 다른 약재의 NO 생성 억해 활성을 추출물 수준에서 비교한 국내의 연구보고에 나타난 작약 추출물의 활성과 본 연구의 결과 중 추출물의 활성이 유사한 수준으로 나타난 것으로 확인되었다.11) 이러한 작약의 NO 생성 억제 활성이 추출물 중 ethyl acetate와 chloroform 분획에서 더 높은 것으로 나타남으로써 관련된 활성의 연구나 소재 개발 등에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
- 22-25) 활성이 확인된 분획에 대해서는 추가적인 분리·정제 과정을 통하여 구체적인 항균 물질 분리의 규명이 필요할 것으로 판단되었다.
- Aqueous 분획을 제외한 모든 추출물 및 분획물에서 농도의존적인 소거능을 보였으며, 극성이 낮은 용매 분획이 상대적으로 높은 소거능을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과에서 작약 methanol 추출물과 분회물이 NO 생성 자체를 억제할 뿐만 아니라 다양한 원인으로 이미 생성된 NO에 대한 소거 효과를 바탕으로 한 항염증 효과를 기대할 수 있을 것으로 판단되었다. 최근 작약과 함께 다른 약재의 NO 생성 억해 활성을 추출물 수준에서 비교한 국내의 연구보고에 나타난 작약 추출물의 활성과 본 연구의 결과 중 추출물의 활성이 유사한 수준으로 나타난 것으로 확인되었다.
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