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문제 정의
- 일반적으로 MTT는 빛에 민감하게 반응하는 것으로 알려져 있고(5,18), 본 연구에서도 ZnPP 미처리 세포에서 생성된 MTT formazan이 자연광에 노출되었을 때 서서히 탈색이 진행되는 것으로 나타났다. 따라서 ZnPP 존재 하에 가속화되는 MTT formazan의 분해에 있어서 빛의 유무에 따른 영향을 조사하였다. MTT formazan은 빛에 노출되었을 때, 8시간까지 서서히 분해되어 50%이상이 탈색되었으며 그 이후에는 24시간까지 거의 탈색반응이 진행되지 않는 것으로 나타났다(Fig.
- 세포에 의한 MTT formazan의 형성은 세포 내 미토콘드리아의 탈수소효소에 의해 MTT tetrazolium이 환원되는 반응이다(1,2). 따라서 ZnPP나 MB에 의한 formazan dye의 탈색에 감광체에 의한 산화촉진 반응이 관여할 것으로 예상하고, formazan dye의 변화에 미치는 각종 항산화제의 영향을 조사하였다. 항산화제의 기작 중 가장 보편적인 것이 유리라디칼 소거 작용으로서 주로 BHT와 같은 페놀성 화합물들의 주 항산화 기작으로 보고된 바 있다(23,24).
- 2C). 따라서 이후에 진행된 실험은 세포에 의해 환원된 MTT formazan에 대하여 직접적인 ZnPP의 영향 및 관련 영향요인들을 조사하였다.
- 본 연구는 세포의 사멸 및 성장변화 등의 평가에 널리 이용되는 MTT assay에서 생성된 formazan dye에 미치는 ZnPP의 영향을 조사하였다. ZnPP는 생체 내에 자연적으로 생성되거나 다양한 관련 실험에 인위적으로 첨가해주는 물질로서, MTT formazan dye의 빛에 의한 탈색을 가속화시키는 것으로 밝혀졌다.
- Tetrazolium assay가 다양한 식이성분의 생리활성을 포함한 세포활성 평가에 광범위하게 이용되고 있으나, 그럼에도 불구하고 MTT formazan의 환원과 발색도에 영향을 미치는 요인으로 세포의 부유상태, 불용성 formazan의 용해에 사용되는 유기용매, 세포 내 처리 물질, 사용배지 등에 대한 일부의 보고가 있을 뿐(2,16,17), 관련 연구는 활발하게 진행되지 않는 실정이다. 본 연구에서는 세포에 의해 자연적으로 생성되거나 또는 다양한 세포실험에 이용되는 ZnPP를 처리한 세포에서 MTT formazan의 발색도에 급격한 변화가 발생하는 것을 파악하고, formazan의 생성과 formazan dye의 안정성에 미치는 ZnPP의 영향 및 관련 기작을 분석하여 MTT assay에 미치는 영향요인에 대한 기본정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- INT 407 또는 RAW264.7세포를 10 cm dish에 분주하여 37℃,5% CO2 조건의 배양기에서 약 80-90% confluency에 도달할 때까지 배양한 후, 0.5 mg/mL MTT 용액을 처리하여 37℃에서 약 2시간 동안 세포에 의한 MTT formazan 생성을 유도하였다. 이후 세포 외 MTT 용액을 완전히 제거하고 세포 내에 생성된 보라색 MTT formazan을 4 mL의 DMSO에 용해시켜 추출하였다.
- 7은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 각각 분양 받았다. INT 407과 RAW264.7세포는 10% FBS와 100 unit/mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin이 포함된 MEM 및 RPMI 배지에서 각각 배양하였고, MEM 배지에는 추가로 1% non-essential amino acid를 첨가하였다. 세포주는 약 80% confluency에 도달하였을 때 계대배양하였고, 온도 37℃, 습도 95% 및 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다.
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험군별 유의차 분석은 Student’s t-test 또는 one-way ANOVA와 Tukey’s HSD test를 실시하여 95와 99%의 유의수준에서 검정하였다. MTT formazan의 반감기 값은 각 처리조건에서의 550 nm 흡광도 감소 결과로부터 직선부위에 대한 선형회귀식을 구하고 50%가 감소되는 시간을 계산하였다.
- MTT formazan의 발색도에 미치는 ZnPP의 단계별 영향평가를 위하여, ZnPP를 24시간 처리한 INT 407세포에 MTT 시약을 처리한 경우, INT 407세포를 24시간 배양한 뒤 ZnPP를 MTT 발색 단계에 함께 처리한 경우 및 생성된 formazan을 DMSO로 용해하는 과정에 ZnPP를 함께 첨가하는 경우와 같이 ZnPP의 처리시점을 달리한 3종류의 세포에 의해 생성된 formazan dye의 흡광도 변화를 측정하였다. MTT formazan의 안정성에 미치는 ZnPP의 영향을 평가하기 위해 96 well plate에 well당 control DMSO나 ZnPP 또는 MB DMSO solution을 40 µL 가하고, 실험에 따라 항산화제를 DMSO에 녹여 40 µL 첨가하였다.
- MTT formazan의 안정성에 미치는 ZnPP의 영향을 평가하기 위해 96 well plate에 well당 control DMSO나 ZnPP 또는 MB DMSO solution을 40 µL 가하고, 실험에 따라 항산화제를 DMSO에 녹여 40 µL 첨가하였다.
- ZnPP 처리세포에 나타나는 MTT formazan의 급속한 탈색 반응이 ZnPP 물질 자체에 의한 것인지, ZnPP 처리에 의한 세포성분의 변화 또는 ZnPP의 세포 내 대사물 등에 의한 간접적인 원인인지를 파악하기 위해 MTT assay를 위한 세포배양실험 각 단계별로 ZnPP를 처리하여 조사하였다. 그 결과 10 µM ZnPP를 24시간 전처리한 경우와 MTT를 첨가하여 세포에 의해 환원반응이 진행되는 90분간 ZnPP를 같이 처리해 준 두 경우에서 시간경과에 따라 유사한 정도로 탈색이 진행되었다(Fig.
- 한편, DMSO 추출물에 함유된 기타 세포성분의 영향을 가능한 배제하기 위하여, MTT formazan 함유세포에 증류수를 가한 후 3차례 동결과 해동을 거쳐 cell lysates를 만들고 이에 ethyl acetate를 가하여 유기용매 층에 이행된 MTT formazan을 모아 실험을 진행하였다. 두 종류의 세포에서 두 가지 용매 추출방법을 통해 제조된 MTT formazan 이 빛과 ZnPP 등에 대해 각각 유사한 정도의 탈색반응이 진행됨을 확인하였고, 이후에 진행된 실험에서는 INT 407세포 유래의 formazan dye를 DMSO로 추출하여 사용하였다.
- Porphyrin 형태 화합물의 일반적인 특징으로 이들이 감광체(photosensitizer)로 작용하는 것이 알려져 있다(20,21). 따라서 또 다른 감광체 물질인 MB를 첨가하여(22) formazan dye의 탈색여부를 조사하였다. 그 결과, ZnPP와 마찬가지로 MB의 첨가 시에도 신속하게 formazan dye의 탈색이 관찰되었으며 그 효과 역시 처리한 MB 농도에 의존적이었다(Fig.
- 본 연구에서 관찰된 ZnPP에 의한 formazan dye의 탈색현상에 있어서 Zn metal의 영향을 알아보기 위하여 10과 20 µM 의 Zn를 MTT formazan에 첨가한 후 빛에 노출시키거나 암소에서 저장하여 dye 색도의 변화 양상을 측정하였다.
- 우선 세포의 생존율에 미치는 ZnPP의 영향을 인간 장관계 INT 407 세포에 0-16 µM 농도 범위로 24시간 투여하여 조사하였다.
- 0 사이에 들도록 formazan DMSO 추출물의 농도를 조절하여 80 µL를 가한 후 550 nm에서 시간별 흡광도 변화를 측정하였다. 이때 동일한 조건에서 2개의 plate에 시료를 제조하여 각 plate를 상온의 명소와 암소에 보관하여 빛의 영향을 비교하였다. 한편 24시간 암소에 보관한 plate를 다시 빛에 노출시킨 후, 이후에 진행되는 발색도의 변화를 시간별로 측정하였다.
- 이어서 초기 흡광도가 0.8-1.0 사이에 들도록 formazan DMSO 추출물의 농도를 조절하여 80 µL를 가한 후 550 nm에서 시간별 흡광도 변화를 측정하였다.
- 세포배양기 내에서 약 90분간 반응시킨 후, 배지는 완전히 제거하고 생성된 MTT formazan을 DMSO에 용해시킨 즉시 microplate reader(Triad LT; Dynex Technologies Inc, Chantilly, VA, USA)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 plate를 자연광 하의 실온에 방치하면서 시간별로 550 nm에서 흡광도를 측정하여 시간에 따른 MTT formazan의 발색도 변화를 측정하였다.
- 이후 처리 물질을 포함한 serum free 배지는 제거하고, MTT의 최종농도가 0.5 mg/mL이 되도록 serum free 배지에 녹여, 각 well당 100 µL씩 첨가하였다.
- 이때 동일한 조건에서 2개의 plate에 시료를 제조하여 각 plate를 상온의 명소와 암소에 보관하여 빛의 영향을 비교하였다. 한편 24시간 암소에 보관한 plate를 다시 빛에 노출시킨 후, 이후에 진행되는 발색도의 변화를 시간별로 측정하였다.
- 0 정도가 되도록 DMSO에 희석하여 사용하였다. 한편, DMSO 추출물에 함유된 기타 세포성분의 영향을 가능한 배제하기 위하여, MTT formazan 함유세포에 증류수를 가한 후 3차례 동결과 해동을 거쳐 cell lysates를 만들고 이에 ethyl acetate를 가하여 유기용매 층에 이행된 MTT formazan을 모아 실험을 진행하였다. 두 종류의 세포에서 두 가지 용매 추출방법을 통해 제조된 MTT formazan 이 빛과 ZnPP 등에 대해 각각 유사한 정도의 탈색반응이 진행됨을 확인하였고, 이후에 진행된 실험에서는 INT 407세포 유래의 formazan dye를 DMSO로 추출하여 사용하였다.
대상 데이터
- (Tokyo, Japan) 및 Duksan Pure Chemical Co.(Gyeonggi, Korea)에서 구입하였다. Buthylated hydroxytoluene(BHT), N-acetylcysteine(NAC), β-carotene, 1,1-diphenyl-2-picrydrazyl(DPPH) 및 그 외에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
- (St Louis, MO, USA)에서, MTT는 Amresco Inc .(Solon, OH, USA)에서 각각 구입하였다. DMSO, zinc sulfate heptahydrate 및 NaOH는 각각 Daejung Chemical & Metals Co.
- Buthylated hydroxytoluene(BHT), N-acetylcysteine(NAC), β-carotene, 1,1-diphenyl-2-picrydrazyl(DPPH) 및 그 외에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다.
- Buthylated hydroxytoluene(BHT), N-acetylcysteine(NAC), β-carotene, 1,1-diphenyl-2-picrydrazyl(DPPH) 및 그 외에 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich에서 구입하여 사용하였다. 세포배양에 사용된 MEM 배지는 Welgene(Daegu, Korea)에서 구입하였으며, fetal bovine serum(FBS)과 100 unit/mL penicillin, 0.1 mg/mL streptomycin은 각각 Sigma-Aldrich와 Hyclone(Logan, UT, USA)에서 구입하였다.
- 인간 형질전환 정상장관계 세포주 INT 407은 고려대학교 김태성 교수 실험실(Korea Univ., Seoul, Korea)에서, 쥐 대식세포인 RAW264.7은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 각각 분양 받았다. INT 407과 RAW264.
데이터처리
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test (in A).
- Different letters indicate a significant difference (p<0.05) based on one-way ANOVA and the Tukey’s HSD test.
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험군별 유의차 분석은 Student’s t-test 또는 one-way ANOVA와 Tukey’s HSD test를 실시하여 95와 99%의 유의수준에서 검정하였다.
이론/모형
- ZnPP에 의한 세포독성 평가는 MTT colorimetric method를 통해 측정하였다. 상기 조건에서 배양된 INT 407세포를 trypsin-EDTA로 처리하여 단일 세포 현탁액으로 만든 후, 96 well plate에 well당 1.
성능/효과
- 그 결과 10 µM ZnPP를 24시간 전처리한 경우와 MTT를 첨가하여 세포에 의해 환원반응이 진행되는 90분간 ZnPP를 같이 처리해 준 두 경우에서 시간경과에 따라 유사한 정도로 탈색이 진행되었다(Fig. 2C).
- 본 연구에서 관찰된 ZnPP에 의한 formazan dye의 탈색현상에 있어서 Zn metal의 영향을 알아보기 위하여 10과 20 µM 의 Zn를 MTT formazan에 첨가한 후 빛에 노출시키거나 암소에서 저장하여 dye 색도의 변화 양상을 측정하였다. 그 결과 암소 저장 시료는 물론 빛에 노출시켰을 때에도 Zn에 의한 영향은 미비하였으며, 따라서 ZnPP에 의한 formazan dye의 탈색은 Zn와 같은 metal ion의 영향이 아닌 protoporphyrin 구조에 의한 것으로 추정되었다(Fig. 3D).
- 그 결과 최대 농도범위까지 유의적인 세포독성은 나타나지 않았으며 1-8 µM 범위에서 10% 이내로 세포활성을 증가시키는 것으로 나타났다(Fig. 2A).
- 따라서 또 다른 감광체 물질인 MB를 첨가하여(22) formazan dye의 탈색여부를 조사하였다. 그 결과, ZnPP와 마찬가지로 MB의 첨가 시에도 신속하게 formazan dye의 탈색이 관찰되었으며 그 효과 역시 처리한 MB 농도에 의존적이었다(Fig. 4A). 하지만 암소에 보관 시에는 MB 처리 유무에 관계없이 formazan dye의 탈색현상은 관찰되지 않았다(Fig.
- 동일한 조건에서 이들 항산화제 시료에 대한 DPPH 라디칼 소거활성을 측정하였을 때, BHT가 가장 높은 활성을 나타내었으며 β-carotene의 경우는 거의 라디칼 소거활성을 나타내지 않았다(Fig. 5D).
- 이러한 ZnPP와 MB에 의한 formazan dye의 탈색반응은 NAC와 β-carotene에 의해 지연되었으나, BHT에 의한 저해효과는 나타나지 않았다. 본 결과는 세포 중에 존재하는 ZnPP 등의 감광체류가 MTT tetrazolium으로부터 환원된 formazan dye의 빛에 의한 신속한 분해를 유도하며, 관련 실험에서 빛의 차단 등의 조치와 함께 각별히 유의해야함을 시사한다.
- 빛에 노출 시 formazan dye의 분해는 ZnPP 농도 의존적으로 나타났으며, ZnPP 미첨가 시 dye의 반감기가 288.3분인 반면, ZnPP 2.5, 5와 10 µM 첨가 시 반감기는 각각 45.0, 24.2 및 14.7분으로 단축되었다(Fig. 3B).
- 하지만 10 µM ZnPP가 첨가된 formazan은 자연광 하에서 신속하게 분해되어 1시간 이내에 80%이상의 탈색현상을 나타내었다. 암소에 저장 시 formazan dye는 대단히 안정하여 24시간 후에도 탈색현상이 전혀 관찰되지 않았으며, ZnPP 첨가 시에도 24시간 동안 15%정도의 색도 감소 현상만이 나타났다(Fig. 3A). 빛에 노출 시 formazan dye의 분해는 ZnPP 농도 의존적으로 나타났으며, ZnPP 미첨가 시 dye의 반감기가 288.
- 이로부터 ZnPP 처리세포에서 세포생존율의 지표인 청자색 MTT formazan의 신속한 탈색이 진행됨을 발견하였고, 시간별 탈색도를 측정한 결과 10 µM ZnPP를 처리한 세포에서 30분 이내에 50% 이상 흡광도가 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 2B).
- 3C). 이상의 결과는 ZnPP에 의한 formazan dye의 파괴는 빛의 유무에 절대적으로 좌우되며, 빛에 노출 시 신속하게 dye의 분해가 일어나는 것을 나타낸다. 한편, MTT formazan이 암소에서 대단히 안정한 것으로 보아 관련 실험에 있어서 빛의 통제가 중요한 요소로서 고려되어야 할 것으로 보인다.
- 이상의 결과는 다양한 생리활성 성분에 의한 세포활성변화 측정에 널리 응용되는 MTT assay 실험에 있어서 생체 내에 존재하는 물질 및 세포실험 시 첨가되는 물질들이 생성된 MTT formazan dye의 발색과 안정성에 크게 영향을 미칠 수 있다는 것을 보여주며, 특히 porphyrin 등의 감광체류 물질들이 존재할 경우 formazan dye가 빛에 의한 신속한 탈색반응이 일어남에 각별히 유의해야 함을 시사한다.
- 2C). 하지만 모든 발색과정 이후 DMSO로 세포 내 MTT formazan을 용해하는 과정에 ZnPP를 첨가한 시료에서 현저히 빠른 탈색현상이 나타났는데, 이상의 결과로 보아 MTT formazan의 탈색은 ZnPP의 대사물이나 ZnPP 처리에 의해 변화된 세포환경에 의한 것이 아니라, 이미 생성된 MTT formazan의 탈색에 ZnPP가 직접적으로 관여하는 것을 알 수 있었다(Fig. 2C). 따라서 이후에 진행된 실험은 세포에 의해 환원된 MTT formazan에 대하여 직접적인 ZnPP의 영향 및 관련 영향요인들을 조사하였다.
- 3B). 한편, 24시간 암소에 저장한 MTT formazan을 빛에 노출시켰을 때, 즉시 노출시킨 경우와 유사한 속도로 dye의 분해가 진행되어 흡광도가 감소하였으며 여전히 ZnPP 농도의존적인 양상을 나타내었다(Fig. 3C). 이상의 결과는 ZnPP에 의한 formazan dye의 파괴는 빛의 유무에 절대적으로 좌우되며, 빛에 노출 시 신속하게 dye의 분해가 일어나는 것을 나타낸다.
- 한편, NAC 또는 β-carotene의 첨가는 ZnPP와 MB에 의한 formazan dye의 탈색을 유의적으로 지연시켰는데(Fig. 5B and C), 특히 NAC에 의한 억제효과가 가장 큰 것으로 나타났다.
후속연구
- 4B). 본 연구결과는 MTT formazan dye의 파괴가 porphyrin류나 MB와 같은 감광체 존재 시에 매우 신속하게 일어날 수 있음을 나타내며, 해당 물질들에 대한 영향 및 관련 기작이 향후 면밀히 조사되어야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과는 ZnPP에 의한 formazan dye의 파괴는 빛의 유무에 절대적으로 좌우되며, 빛에 노출 시 신속하게 dye의 분해가 일어나는 것을 나타낸다. 한편, MTT formazan이 암소에서 대단히 안정한 것으로 보아 관련 실험에 있어서 빛의 통제가 중요한 요소로서 고려되어야 할 것으로 보인다.
- 한편, β-carotene은 유리라디칼에 대한 효과보다는 일중항산소에 대한 quenching 작용을 하는 것으로 알려졌는데(25,26), 감광체에 의한 산화반응 중 중요한 역할을 하는 일중항산소의 제거가 formazan dye의 탈색억제에 중요한 기작으로 작용하는 것으로 사료된다. 향후 탈색된 dye의 화학적 본체, 탈색반응의 가역적 또는 비가역적인 성질 여부, 상세한 산화반응 기작 등을 밝히기 위한 연구가 지속적으로 진행되어야 할 것으로 보인다.
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