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문제 정의
- 돼지 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 연구는 극소수의 연구자들에 의하여 연구가 수행되고 있으며, 특히 돼지 중간엽줄기세포에 대한 동결보호제에 관한 연구는 아주 미비한 실정이다. 본 연구에서는 돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포를 분리하여 서로 다른 동결보호제; 10% DMSO, 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG를 이용하여 동결 및 해동 후, 동결 전후 세포의 생존률, 세포의 증식률, apoptosis률을 조사하였으며, 특히 동결을 전 후한 줄기세포 유지능을 확인하기 위하여 줄기세포 관련 전사인자의 발현 분석 및 조직특이세포로의 분화 관련 유전자들의 발현 양상을 비교함으로써 돼지 골수 유래 줄기세포의 동결보호제를 개발을 위한 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 75M EG 군으로 동결하여, 일주일간 액체 질소에 보관한 후 급속 해동하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM에 14일간 배양하여 각 그룹별 colony 형성과 AP 염색을 확인하였다. 동결에 따른 중간엽 줄기세포의 AP 활성도를 측정한 결과, 미동결 신선한 중간엽 줄기세포에서는 강하게 AP 염색되었으며(Fig.
- 2개월된 돼지의 femur와 tibia로부터 골수를 채취하고, Ficoll-Paque-Plus를 이용하여 세포를 분리하였다. 채취한 골수를 1:1로 Balanced salt solution과 섞고, Ficoll 용액을 천천히 기울여 넣어 층을 만든 후, 원심 분리기를 이용하여 단핵 세포만을 분리하였다.
- 지방분화 유도 배지는 DMEM 배양액에 10% FBS, 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin, 1μM dexamethasone, 100μM indomethacin, 10 μM insulin, 500 μM 3-isobutyl-1-methylzanthine(IBMX)를 첨가한 배지로 3일에 한번씩 배양액을 교환하며 지방분화를 유도하였다. 3주 후, 지방 분화 여부를 확인하기 위해 0.5% Oil Red-O 염색을 하였다. 간단히 설명하면, 60% isopropanol 10 ml에 0.
- Apoptosis와 관련된 유전자 발현을 보기 위해 Bax를, 줄기세포 표지인자로 Sox-2와 Nanog을, 분화 관련 유전자 발현으로 ap2, PPARα, Collagen type ΧΙ와 Osteonectin 을 조사하였다.
- 총 20 μl 반응량 중 1 μl cDNA를 이용하여 Premix(Maxim PCR premix kit i-star Taq, Korea)를 이용하여 93℃에서 3분, 93℃에서 40초, primer에 따라 annealing 온도를 52～62℃, 72℃에서 50초, 72℃에서 5분간 35～37 cycle 조건으로 PCR을 실시하였다. PCR로 증폭된 산물을 사이즈 marker와 함께 1% 아가로스 겔과 1X TAE 용액을 사용하여 100 volt에서 30분 동안 전기영동한 후, Gel Doc(Bio Rad, USA)으로 관찰하였다. 컨트롤 유전자로 GAPDH을 사용하였다.
- 5% Oil Red-O 염색을 하였다. 간단히 설명하면, 60% isopropanol 10 ml에 0.05 g의 Oil Red-O 염색약을 넣고 혼합한 후 지방 분화가 유도된 세포에 15～20분간 염색시킨 후, 광학 현미경으로 관찰하였다.
- 간단히 설명하면, 세포에 염색약을 넣고 20분간 실온에서 염색시킨 후 PBS로 2～3회 세척하고, 4% paraformaldehyde를 넣어 20분간 고정시켰다. 광학 현미경을 이용하여 colony의 생성 정도를 확인하였다.
- 중간엽 줄기세포는 일반적인 배양 조건에서도 시간이 지남에 따라 자연적으로 분화 유도가 일어난다. 그래서 동결이 줄기세포의 분화를 유도하는지 확인하기 위하여 동결 후 분화 관련 유전자의 발현을 보았다. 지방 분화와 관련 유전자인 fatty acid-binding proteins(FABP)는 세포질내 지방산 샤페론으로, 그 이성질체인 ap2는 비만과 글루코오스 대사에 중요한 역할을 한다(Makowski et al.
- , 2005). 그래서 본 실험에서는 2개의 다른 동결보호제; DMSO와 EG를 단독으로 사용하거나 2개를 조합하여 돼지 중간엽 줄기세포 동결하고, 세포의 생존률, apoptosis률, 세포 증식률, 유전자 발현에 대해 조사하였다. 동결 전, 돼지로부터 직접 분리해낸 세포를 중간엽 줄기세포임을 확인하기 위하여, colony 형성과 AP 활성, 중배엽 유래 지방세포로의 분화를 실험하였다.
- 동결 시 동결보호제가 세포의 생존율에 미치는 영향을 알아 보기 위해 동결 후 일주일간 액체질소에 보관하여 해동한 세포를 Vybrant® Apoptosis assay kit로 염색한 후 FACs를 이용하여 실험하였다(Fig. 3).
- 동결 전 배양한 돼지 중간엽 줄기세포를 0.25% Trypsin-EDTA를 첨가하여 분리한 다음, PBS로 세척하고, 원심 분리한 후 RNA를 추출하였다. 서로 다른 동결 보호제를 이용하여 동결 한 중간엽 줄기세포는 일주일간 액체질소에 저장 후 해동하고, 각 그룹 별로 5시간, 10시간 배양한 다음, 각 세포를 모아 RNA를 추출하였다.
- 동결 전 중간엽 줄기세포와 각 그룹별 동결 세포를 24-well 배양 용기에 5×103/㎠로 접종한 후, 48시간마다 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다.
- 그래서 본 실험에서는 2개의 다른 동결보호제; DMSO와 EG를 단독으로 사용하거나 2개를 조합하여 돼지 중간엽 줄기세포 동결하고, 세포의 생존률, apoptosis률, 세포 증식률, 유전자 발현에 대해 조사하였다. 동결 전, 돼지로부터 직접 분리해낸 세포를 중간엽 줄기세포임을 확인하기 위하여, colony 형성과 AP 활성, 중배엽 유래 지방세포로의 분화를 실험하였다. 실험 결과, 형태학적으로 분리한 돼지 중간엽 줄기세포는 섬유아세포 및 방추사 모양이며, 배양 시 균형적인 colony 형성을 보였다.
- 동결보호제가 세포에 미치는 영향을 알아보기 위해 Vybrant® Apoptosis assay kit #3(Molecular Probes, Inc.)를 이용하여 TUNNEL 염색을 하였다.
- 동결이 줄기세포 능에 미치는 영향을 확인하기 위해 동결 전 세포와 동결 보호제로 동결시킨 세포를 일주일간 액체 질소에 저장한 다음, 해동시켜 5시간, 10시간 배양하고 줄기세포 표지인자인 Sox-2와 Nanog, apoptosis 표지 인자인 Bax의 발현 정도를 확인하였다. 또한, 동결이 세포분화 유도에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 분화 관련 유전자인 ap2, PPAR α, Collagen type XI, Osteonectin을 RT-PCR로 알아보았다(Table 2).
- 동결이 줄기세포 능에 영향을 미치는지 확인하기 위해 Nanog과 Sox-2 유전자의 발현을 조사하였다. Nanog은 인간배아줄기 세포의 전분화 능을 유지하는 기능을 가진 homeodomain 유전자이다(Mitsui et al.
- 돼지 중간엽 줄기세포를 동결하기 위해 10% DMSO, 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG 군으로 동결하여, 일주일간 액체 질소에 보관한 후 급속 해동하였다. 10% FBS가 첨가된 DMEM에 14일간 배양하여 각 그룹별 colony 형성과 AP 염색을 확인하였다.
- 돼지 중간엽 줄기세포를 커버글라스가 들어가 있는 6-well에 5×103/well개씩 접종한 후 2주 동안 배양하였고, 배양액은 3일에 한 번씩 교환해 주었다.
- 돼지의 femur와 tibia로부터 분리한 줄기세포의 형태와, 14일간 배양하여 형성된 colony를 확인하기 위해 AP 염색을 하였다. 실험 결과, 돼지로부터 채취한 줄기세포는 배양용기에 부착 할 수 있는 능력을 가졌고, 그 형태 또한 섬유아세포와 비슷한 모양을 가지며, 다각형 또는 방추 모양을 보였다(Fig.
- 또한, 동결이 세포분화 유도에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 분화 관련 유전자인 ap2, PPAR α, Collagen type XI, Osteonectin을 RT-PCR로 알아보았다(Table 2).
- 배양 용기의 80～90% 정도로 자란 2～3번째 계대 배양의 중간엽 줄기세포를 0.25% Trypsin-EDTA를 이용하여 떼어낸 후, 10% DMSO, 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG이 첨가된 DMEM에 1×106/ml의 농도로 cryovial에 넣은 후, Cryo-container를 이용하여 25℃에서 －80℃로 분당 －1℃씩 떨어뜨려 동결하였다.
- 25% Trypsin-EDTA를 첨가하여 분리한 다음, PBS로 세척하고, 원심 분리한 후 RNA를 추출하였다. 서로 다른 동결 보호제를 이용하여 동결 한 중간엽 줄기세포는 일주일간 액체질소에 저장 후 해동하고, 각 그룹 별로 5시간, 10시간 배양한 다음, 각 세포를 모아 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA의 농도를 측정한 후, 1 ㎍의 RNA, superscript™ Ⅲ RT(Invitrogen Coporation,USA)와 oligo-dT primer로 cDNA를 합성하였다.
- 실온, 암실에서 15분간 반응시키고 1X annexin-binding용액을 400 μl 넣어 총 500 μl가 되게 만든 후, Fluorescence activated cell sorter(FACs)를 이용하여 측정한다.
- 해동을 위해 vial을 37℃ water bath에서 녹인 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM을 첨가하였다. 이를 원심 분리 하여 상층액을 제거하고, 해동 후 각 그룹 별세포증식률을 확인하기 위하여, 14일간 이틀에 한번씩 hematocytomter를 이용하여 세포 수를 측정하였다.
- 지방분화 유도 배지는 DMEM 배양액에 10% FBS, 100 unit/ml의 penicillin-streptomycin, 1μM dexamethasone, 100μM indomethacin, 10 μM insulin, 500 μM 3-isobutyl-1-methylzanthine(IBMX)를 첨가한 배지로 3일에 한번씩 배양액을 교환하며 지방분화를 유도하였다.
- 총 20 μl 반응량 중 1 μl cDNA를 이용하여 Premix(Maxim PCR premix kit i-star Taq, Korea)를 이용하여 93℃에서 3분, 93℃에서 40초, primer에 따라 annealing 온도를 52～62℃, 72℃에서 50초, 72℃에서 5분간 35～37 cycle 조건으로 PCR을 실시하였다.
- 추출한 RNA의 농도를 측정한 후, 1 ㎍의 RNA, superscript™ Ⅲ RT(Invitrogen Coporation,USA)와 oligo-dT primer로 cDNA를 합성하였다.
- 동결한 vial은 액체 질소로 옮겨 일주일간 냉동 보존하였다. 해동을 위해 vial을 37℃ water bath에서 녹인 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM을 첨가하였다. 이를 원심 분리 하여 상층액을 제거하고, 해동 후 각 그룹 별세포증식률을 확인하기 위하여, 14일간 이틀에 한번씩 hematocytomter를 이용하여 세포 수를 측정하였다.
대상 데이터
- PCR로 증폭된 산물을 사이즈 marker와 함께 1% 아가로스 겔과 1X TAE 용액을 사용하여 100 volt에서 30분 동안 전기영동한 후, Gel Doc(Bio Rad, USA)으로 관찰하였다. 컨트롤 유전자로 GAPDH을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균값±표준오차(means±SEM)로 제시하였다.
- 시험 처리군 간의 평균값 비교는 one-way ANOVA와 Duncan's and Turkey's multiple comparisons test에 의해서 이루어졌으며, 유의적 차이는 p<0.05의 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- Apoptosis 율에서는 동결 전 세포(5.7±0.7)와 10% DMSO(3.4±0.6), 1.5M EG(3.5±0.9), 5% DMSO/0.75M EG(3.4±0.8)에서 유의적인 차이가 없음을 알 수 있었고, Necrosis 율에서는 동결 전 세포(2.0±0.9)가 10% DMSO(8.8±0.3), 1.5M EG(9.3±0.7), 5% DMSO/0.75M EG(9.4±0.6)보다 유의적으로 낮음을 확인할 수 있었다(Table 1).
- 75M EG) 간의 생존률과 증식률, apoptosis률 간에 차이가 없었으며, 동결 후 모든 처리 군에서 colony가 형성되고 AP 염색에 positive 함을 알 수 있었다. Apoptosis, 줄기세포 분화와 관련된 유전자의 발현에 있어서 10% DMSO와 1.5M EG 처리군 간에 차이가 없었으나, 동결 전후 줄기세포 전사인자와 관련된 유전자 발현의 경우 시간이 지남에 따라 약간 발현량이 증가하여 나타났다. 하지만 동결 처리군 간에는 유의적인 차이가 없었다.
- 10% FBS가 첨가된 DMEM에 14일간 배양하여 각 그룹별 colony 형성과 AP 염색을 확인하였다. 동결에 따른 중간엽 줄기세포의 AP 활성도를 측정한 결과, 미동결 신선한 중간엽 줄기세포에서는 강하게 AP 염색되었으며(Fig. 2B-a), 10% DMSO, 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG 동결 세포군에서의 AP 염색 또한 양성으로 나타났다. Fig.
- 돼지 중간엽 줄기세포로부터 지방세포로의 분화를 유도한 결과, 약 7일째부터 세포질 내에 지질 방울이 형성됨을 보였고, 15일째가 되었을 때 세포 내 풍부한 지질방울이 형성되어 붉게 염색됨을 확인할 수 있었다(Fig. 1A-c, d).
- 요약적으로 본 연구에서 돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포는 높은 성장률과 다양한 계통으로 분화되는 능력을 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한 동결 처리군(10% DMSO, 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG) 간의 생존률과 증식률, apoptosis률 간에 차이가 없었으며, 동결 후 모든 처리 군에서 colony가 형성되고 AP 염색에 positive 함을 알 수 있었다. Apoptosis, 줄기세포 분화와 관련된 유전자의 발현에 있어서 10% DMSO와 1.
- 75M EG를 동결 보호제로 사용해도 생존률에 큰 차이가 없음을 말해준다. 또한, 동결 처리군 간의 apoptosis율 역시 동결 전 세포와 비교했을 때 큰 차이는 없으나, necrosis율에서는 동결 후 세포 군이 동결 전 세포보다 유의적으로 높음을 알 수 있었다. 하지만 Heng(2006) 등의 보고에 따르면 인간 배아줄기세포를 전통적인 방식인 완만동결을 했을 때, apoptosis율이 necrosis율 보다 더 높았다.
- , 2005). 본 연구에서 ap2의 발현은 동결 전후, 해동 후 배양시켰을 때 모든 처리군 간에 큰 차이가 없었다. PPAR α의 경우 동결 전후 모든 세포군 사이에 발현이 되지 않았다.
- 이와 대조적으로 Ha(2005) 등에 의하면, 인간 배아줄기세포를 DMSO와 EG으로 동결하였을 때 Oct-4와 Nanog 유전자의 경우, 동결 후 유전자의 발현에 큰 차이가 없음을 보고하였다. 본 연구에서는 돼지 중간엽 줄기세포를 동결 후 해동하여 5시간에서 10시간 배양하였을 때, 시간의 경과에 따라 유전자의 발현이 증가하는 경향을 보였다. 이는 동결 후 해동시킴에 따라 세포가 스스로 회복하려는 능력때문에 줄기세포 표지인자인 Nanog과 Oct-4의 발현이 증가하는 것으로 생각된다.
- /㎠로 접종한 후, 48시간마다 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 세포증식률은 각 실험군에서 비슷한 양상을 보였으며, 48～96시간 사이 동결 전 세포가 동결보호제를 사용하여 동결시킨 처리 군보다 유의적으로 증식률이 높았으나, 144시간 이후로는 모든 군에서 차이를 보이지 않았다(Fig. 2). 하지만, 1.
- 실험 결과, Nanog과 Sox-2 유전자 발현의 경우, 서로 다른 동결 보호제로 동결한 후 해동한 처리군에 있어서 동결 전 세포와 비교했을 때, 배양할수록 약간 증가하는 경향을 보였으나, 동결보호제 처리군 간에는 유의적인 차이가 없었다. Bax의 경우, 동결 전후 발현량에 차이가 거의 없었고, 배양하였을 때 역시 차이를 보이지 않았다(Fig.
- 실험 결과, 동결 전후 생존률에서는 동결 전 세포(92.3±1.3)가 동결 후 세포(10% DMSO:72.3±4.3; 1.5M EG: 70.3±4.3; 5% DMSO/0.75M EG: 66.8±2.8)보다 유의적으로 높음을 확인할 수 있었다.
- 돼지의 femur와 tibia로부터 분리한 줄기세포의 형태와, 14일간 배양하여 형성된 colony를 확인하기 위해 AP 염색을 하였다. 실험 결과, 돼지로부터 채취한 줄기세포는 배양용기에 부착 할 수 있는 능력을 가졌고, 그 형태 또한 섬유아세포와 비슷한 모양을 가지며, 다각형 또는 방추 모양을 보였다(Fig. 1A-a). 또한 2주간 배양 하였을 때, 배양 용기에 서로 균형이 잡힌 colony들이 많이 형성되었음을 알 수 있었다(Fig.
- 동결 전, 돼지로부터 직접 분리해낸 세포를 중간엽 줄기세포임을 확인하기 위하여, colony 형성과 AP 활성, 중배엽 유래 지방세포로의 분화를 실험하였다. 실험 결과, 형태학적으로 분리한 돼지 중간엽 줄기세포는 섬유아세포 및 방추사 모양이며, 배양 시 균형적인 colony 형성을 보였다. 또한 colony들은 AP 염색에 positive 함을 나타내었다.
- 줄기세포 분화와 관련된 유전자 발현에서도 지방세포 표지인자인 ap2의 경우, 동결 전후, 동결 후 배양하였을 때, 발현량에 차이가 없었고, PPARα 유전자는 모든 처리군에서 발현되지 않았다. 연골세포 표지인자인 Collagen type XI의 경우 동결 전후 배양시간에 따라 약간의 발현은 있었으나, 처리군 간에 유의적인 차이를 보이지 않았으며, 골세포 표지인자인 osteonectin 역시 모든 처리군에서 아주 약하게 발현되었으나, 모든 처리군 사이에 차이가 없었다(Fig. 4B).
- 이를 종합해 볼 때 동결은 줄기세포의 분화에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 요약적으로 본 연구에서 돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포는 높은 성장률과 다양한 계통으로 분화되는 능력을 가지고 있음을 알 수 있었다. 또한 동결 처리군(10% DMSO, 1.
- , 2005). 이를 종합해 볼 때 동결은 줄기세포의 분화에 영향을 미치지 않음을 알 수 있다. 요약적으로 본 연구에서 돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포는 높은 성장률과 다양한 계통으로 분화되는 능력을 가지고 있음을 알 수 있었다.
- 하지만 동결 처리군 간에는 유의적인 차이가 없었다. 이를 종합해 볼 때, 돼지 중간엽 줄기세포 동결 시 일반적으로 쓰이는 10% DMSO와 1.5M EG, 5% DMSO/ 0.75M EG 역시 동결보호제로서 사용할 수 있는 것으로 사료된다.
- 하지만 이 실험에서는 대조적으로 동결 전 세포의 생존률(92.3±1.3%)이 동결 해동한 세포의 생존률(10% DMSO: 72.3±4.3; 1.5M EG: 70.3±4.3; 5% DMSO/0.75M EG: 66.8±2.8) 보다 유의적으로 높았으며, 동결 해동한 세포군에서 일반적으로 쓰이는 10% DMSO와 1.5M EG, 5% DMSO/0.75M EG를 비교해 보았을 때 유의적인 차이가 없음을 보였다.
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