본 연구에서는 복수의 항원-항체 결합 반응을 동시에 검출할 수 있는 미세유체역학 기반의 바이오칩을 설계하고 구현하였다. 본 연구의 바이오칩은 항원-항체 결합 반응이 이루어지는 반응기가 단일 채널에 직렬로 연결된 구조를 가지며, 각각의 반응기에는 항체가 고정화된 마이크로비드가 채워진다. 마이크로비드의 누출을 방지하기 위해서 마이크로채널에 위어 구조를 형성하였으며, 이를 위해서 gray-scale photolithography를 이용하였다. 항원-항체 결합 반응 검출 실험을 위해 3종의 항체를 선정하였으며, 각각의 항체를 avidn-biotin 반응을 통해 마이크로비드에 고정화하였다. 그리고, 형광물질이 표지된 항원을 마이크로채널에 연속적으로 주입하여 항원-항체 결합 반응을 유발하였으며, 10분 이내에 반응이 완료되는 것을 확인하였다. 또한, 항원에 따른 해당 반응기에서의 형광강도 증가를 검출함으로써, 미세유체 어레이의 구현 가능성을 확인하였다. 본 연구에서 제안한 미세유체 바이오칩은 면역 반응의 동시 검출을 위해 소요되는 시료의 양을 줄이고 반응 속도를 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
본 연구에서는 복수의 항원-항체 결합 반응을 동시에 검출할 수 있는 미세유체역학 기반의 바이오칩을 설계하고 구현하였다. 본 연구의 바이오칩은 항원-항체 결합 반응이 이루어지는 반응기가 단일 채널에 직렬로 연결된 구조를 가지며, 각각의 반응기에는 항체가 고정화된 마이크로비드가 채워진다. 마이크로비드의 누출을 방지하기 위해서 마이크로채널에 위어 구조를 형성하였으며, 이를 위해서 gray-scale photolithography를 이용하였다. 항원-항체 결합 반응 검출 실험을 위해 3종의 항체를 선정하였으며, 각각의 항체를 avidn-biotin 반응을 통해 마이크로비드에 고정화하였다. 그리고, 형광물질이 표지된 항원을 마이크로채널에 연속적으로 주입하여 항원-항체 결합 반응을 유발하였으며, 10분 이내에 반응이 완료되는 것을 확인하였다. 또한, 항원에 따른 해당 반응기에서의 형광강도 증가를 검출함으로써, 미세유체 어레이의 구현 가능성을 확인하였다. 본 연구에서 제안한 미세유체 바이오칩은 면역 반응의 동시 검출을 위해 소요되는 시료의 양을 줄이고 반응 속도를 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다.
In this paper, a microfluidic array biochip for simultaneously detecting multiple antigen-antibody bindings was designed and implemented. The biochip has the single channel in which microreaction chambers are serially connected, and the antibody-coated microbeads are packed in each microreaction cha...
In this paper, a microfluidic array biochip for simultaneously detecting multiple antigen-antibody bindings was designed and implemented. The biochip has the single channel in which microreaction chambers are serially connected, and the antibody-coated microbeads are packed in each microreaction chamber. In addition, the weir structure was fabricated in the microchannel using the gray-scale photolithography in order to trap the microbeads in the microreaction chamber. Three kinds of antibodies were chosen, and the antibodies were immobilized onto the microbeads by the streptavidin-biotin conjugation. In the experiment, as the fluorescence-labeled antigens were injected into the microchannel, the antigen-antibody bindings were completed in 10 minutes. When the solution with multiple antigens was injected into the microchannel, it was observed that the fluorescence intensity increased in only the corresponding microreaction chambers with few non-specific binding. The microfluidic array biochip implemented in this study provides, even with the consumption of tiny amount of sample and fast reaction time to simultaneously detect multiple immunoreactions.
In this paper, a microfluidic array biochip for simultaneously detecting multiple antigen-antibody bindings was designed and implemented. The biochip has the single channel in which microreaction chambers are serially connected, and the antibody-coated microbeads are packed in each microreaction chamber. In addition, the weir structure was fabricated in the microchannel using the gray-scale photolithography in order to trap the microbeads in the microreaction chamber. Three kinds of antibodies were chosen, and the antibodies were immobilized onto the microbeads by the streptavidin-biotin conjugation. In the experiment, as the fluorescence-labeled antigens were injected into the microchannel, the antigen-antibody bindings were completed in 10 minutes. When the solution with multiple antigens was injected into the microchannel, it was observed that the fluorescence intensity increased in only the corresponding microreaction chambers with few non-specific binding. The microfluidic array biochip implemented in this study provides, even with the consumption of tiny amount of sample and fast reaction time to simultaneously detect multiple immunoreactions.
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문제 정의
본 연구에서는 복수의 항원-항체 반응을 동시에 검출할 수 있는 미체유체역학 기반의 바이오칩을 설계하고 구현하고자 하였다. 특히, 단일 마이크로채널 상에서 복수의 항원-항체 반응을 유발시킬 수 있도록 채널을 설계하고 검증하였다.
제안 방법
. 간단히 요약하면, 포토리소그래피를 이용하여 마이크로채널의 패턴이 형성된 양성 PR(AZ P4620) 필름을 유리 기판위에 증착한 주형(master)를 제작하였다. 이 과정에서 10:1의 비율로 축소 촬영된 네가티브 필름(Kodak Precision Line Film LPD4)을 포토마스크로 사용하였다.
입구를 통해 주입된 항체가 고정화된 마이크로비드는 각각의 해당되는 반응기에 채워지며, 반응기 사이에는 항체가 고정화되지 않은 마이크로비드를 채움으로써 반응기 사이를 구분하도록 하였다 (그림 2(b)). 또한, 마이크로비드가 반응기로부터 누출되는 것을 방지하기 위해서 마이크로채널 내부에 위어(weir) 구조를 제작하였다. 마이크로채널의 연속된 반응기 다음에 위어가 위치하며, 위어 부분에서의 마이크로채널 높이를 마이크로비드의 지름보다 낮게 설계함으로써, 마이크로비드가 채널을 통과하지 못하고 반응기에 채워지도록 하였다.
본 연구에서 제안된 바이오칩의 주요 특징으로는 단일 채널 상에서 복수의 항원-항체 반응을 수행할 수 있다는 점으로, 이를 위해서 서로 다른 항체가 고정화된 마이크로비드를 이용하였다. 마이크로비드를 마이크로채널 상에 유지하기 위해서 위어 구조를 마이크로채널에 도입하였다. 개발된 바이오칩을 이용하여 복수의 항원-항체 반응을 동시에 수행할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
마이크로비드에 항체를 고정화하기 위해서 streptavidin-biotin 결합을 이용하였다. streptavidin이 코팅된 마이크로비드 25μL (1.
또한, 마이크로비드가 반응기로부터 누출되는 것을 방지하기 위해서 마이크로채널 내부에 위어(weir) 구조를 제작하였다. 마이크로채널의 연속된 반응기 다음에 위어가 위치하며, 위어 부분에서의 마이크로채널 높이를 마이크로비드의 지름보다 낮게 설계함으로써, 마이크로비드가 채널을 통과하지 못하고 반응기에 채워지도록 하였다. 위어를 가지는 마이크로채널을 제작하기 위해서는, 위어 부분의 PR 패턴 두께가 다른 부분보다 낮도록 마스터를 제작되어야 한다.
형광 강도의 증가는 마이크로비드에 고정화되어 있는 항체 anti-mouse IgG와 항원 mouse IgG이 결합함에 따라, 항원에 표지된 형광물질의 증가에 기인한다. 복수의 항원-항체 반응의 동시 검출 가능성을 확인하기 위해서 500nM rabbit IgG와 500nM human IgG가 혼합된 용액을 마이크로채널에 주입하였다. 그림 4(c)는 항원-항체반응 완료 후의 형광 영상을 보여준다.
이에 따라, 미세유체역학을 기반으로 하는 미세 유체 어레이 바이오칩을 제안하였으며 이를 구현하였다. 본 연구에서 제안된 바이오칩의 주요 특징으로는 단일 채널 상에서 복수의 항원-항체 반응을 수행할 수 있다는 점으로, 이를 위해서 서로 다른 항체가 고정화된 마이크로비드를 이용하였다. 마이크로비드를 마이크로채널 상에 유지하기 위해서 위어 구조를 마이크로채널에 도입하였다.
3μm이 되는 것을 확인하였다. 본 연구에서는 위어 부분에 해당하는 패턴의 투과도를 50%로 설정하여, 포토마스크를 제작하였다.
또한, 각종 질환의 진단을 위해서 복수의 바이오마커의 신속한 동시 검출 필요가 제안되고 있다. 이에 따라, 미세유체역학을 기반으로 하는 미세 유체 어레이 바이오칩을 제안하였으며 이를 구현하였다. 본 연구에서 제안된 바이오칩의 주요 특징으로는 단일 채널 상에서 복수의 항원-항체 반응을 수행할 수 있다는 점으로, 이를 위해서 서로 다른 항체가 고정화된 마이크로비드를 이용하였다.
이 과정에서 10:1의 비율로 축소 촬영된 네가티브 필름(Kodak Precision Line Film LPD4)을 포토마스크로 사용하였다. 이후에 마스터에 경화제와 혼합된 PDMS를 붓고 경화시켜서 마이크로채널을 제작하고, 이를 유리 기판에 결합시킴으로써, 바이오칩을 제작하였다.
입구를 통해 주입된 항체가 고정화된 마이크로비드는 각각의 해당되는 반응기에 채워지며, 반응기 사이에는 항체가 고정화되지 않은 마이크로비드를 채움으로써 반응기 사이를 구분하도록 하였다 (그림 2
제작된 바이오칩의 검출 한계를 조사하였다. 그림 5는 시료를 연속적으로 주입(flow rate: 0.
본 연구에서는 복수의 항원-항체 반응을 동시에 검출할 수 있는 미체유체역학 기반의 바이오칩을 설계하고 구현하고자 하였다. 특히, 단일 마이크로채널 상에서 복수의 항원-항체 반응을 유발시킬 수 있도록 채널을 설계하고 검증하였다.
대상 데이터
간단히 요약하면, 포토리소그래피를 이용하여 마이크로채널의 패턴이 형성된 양성 PR(AZ P4620) 필름을 유리 기판위에 증착한 주형(master)를 제작하였다. 이 과정에서 10:1의 비율로 축소 촬영된 네가티브 필름(Kodak Precision Line Film LPD4)을 포토마스크로 사용하였다. 이후에 마스터에 경화제와 혼합된 PDMS를 붓고 경화시켜서 마이크로채널을 제작하고, 이를 유리 기판에 결합시킴으로써, 바이오칩을 제작하였다.
지름이 9.77μm이고 streptavidin이 코팅된 마이크로 비드(Bangs Laboratories, USA), Biotin이 레이블링된 항체인 anti-rabbit IgG, anti-human IgG, anti-mouse IgG 그리고, 항원으로 형광 물질인 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 rabbit IgG, human IgG, mouse IgG 등은 Pierce Biotechnology (USA)에서 구입하였다.
이론/모형
본 연구에서 사용된 바이오칩은 널리 사용되는 PDMS molding 방법을 이용하여 제작하였다 (그림 1)[8~9]. 간단히 요약하면, 포토리소그래피를 이용하여 마이크로채널의 패턴이 형성된 양성 PR(AZ P4620) 필름을 유리 기판위에 증착한 주형(master)를 제작하였다.
위어를 가지는 마이크로채널을 제작하기 위해서는, 위어 부분의 PR 패턴 두께가 다른 부분보다 낮도록 마스터를 제작되어야 한다. 이러한 구조를 제작하기 위해서, gray-scale photolitography (GSPL)를 이용하여 제작하였다(그림 1)[8]. GSPL에서는 포토마스크에 회색 패턴을 도입하여 PR에 노출되는 광량을 조절함으로써 현상 과정에서 PR 두께를 조절할수 있다.
성능/효과
1μM mouse IgG 용액이 주입하였을 때 제일 왼쪽과 가운데 반응기에서 약간의 형광 강도 증가가 발생하였음을 확인할 수 있는데, 이는 항원 mouse IgG의 마이크로비드에 대한 비선택성 흡착에 기인하는 것으로 보인다.
마이크로비드를 마이크로채널 상에 유지하기 위해서 위어 구조를 마이크로채널에 도입하였다. 개발된 바이오칩을 이용하여 복수의 항원-항체 반응을 동시에 수행할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 특히, 마이크로비드를 이용하면 반응기에서의 부피 대비 표면적 비율을 향상시킴으로써 시료의 혼합 효과를 증가시킬 뿐만 아니라, 반응 속도를 향상시킬 수 있다.
결과적으로 본 연구에서 제안된 복수의 항원-항체 반응 검출을 위한 미세 유체 어레이는 신속한 반응과 소량의 시료 소모 측점에서 장점을 제공한다.
예비 실험에서 투과도(검정색이 0% 패턴이 없을 때 100%로 가정)가 50%과 70%인 회색 패턴을 이용 하여 두께가 24.5μm인 PR을 노광하였을 때 PR의 두께가 각각 6.0±0.7μm ,12.4±0.3μm이 되는 것을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
마이크로채널의 병렬 구조를 지닌 바이오칩의 문제점은 무엇입니까?
또한, 복수의 항원-항체 반응의 동시 검출을 위한 바이오칩을 위해서는 마이크로채널의 병렬 구조를 제안하고 있다[4～5]. 그러나, 이러한 병렬 구조의 바이오칩은 단순히 미세유체채널을 연결한 것으로 검출하는 항원항체 반응의 수가 늘어남에 따라 바이오칩의 구조가 복잡해지고, 사용되는 시료의 양도 증가하는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 단일 채널 상에서 복수의 항원-항체 반응을 수행할 수 있는 바이오칩의 구조 설계가 요구된다.
미세유체역학이란 무엇입니까?
미세유체역학(microfluidics)은 μL 이하의 유체 거동을 해석하고 제어하기 하기 위한 기술로써, 각종 생체 반응을 수행하고 물질을 검출하기 위한 바이오칩의 플랫폼으로 활용되고 있다[1]. 이를 위해서는, 미세유체 흐름을 제어를 위한 마이크로채널(microchannel), 생물 반응을 위한 반응기(microreaction chamber), 시료 혼합을 위한 믹서(mixer) 등의 각종 미세유체 제어용 요소들이 구현되어야 한다.
미세유체역학 기반의 바이오칩 기술의 장점은 무엇입니까?
이를 위해서는, 미세유체 흐름을 제어를 위한 마이크로채널(microchannel), 생물 반응을 위한 반응기(microreaction chamber), 시료 혼합을 위한 믹서(mixer) 등의 각종 미세유체 제어용 요소들이 구현되어야 한다. 미세유체역학 기반의 바이오칩 기술은 작은 시료 양이 요구되고 반응 시간이 촉진되며 반응 프로토콜을 자동화시킬 수 있다는 장점을 가지기 때문에, 항원-항체 결합 반응과 효소의 촉매 반응 등이 미세유체역학 플랫폼을 이용하여 구현되고 있다[2～3]. 특히, 항원-항체 결합에 따른 분자 인식 기능을 이용하는 바이오칩 기술은 임상 병리 검사를 위한 바이오마커 검출, 환경 모니터링, 식품 안전성 평가 분야에서 연구가 진행되었는데, 이들 연구들은 주로 항원-항체 반응의 효율을 최적화하기 위한 미세유체채널의 구조 설계와 항원-항체 결합 반응의 고감도 검출 등에 집중되어 있다.
참고문헌 (11)
R. Bashir, "BioMEMS: state-of-the art in detection, opportunities and prospects," Adv. drug Delivery review vol. 56, pp. 1565-1586, Sep. 2004.
A. Bernard, and M. B. Delamarche, "Micromosaic immunoassays," Anal. Chem. vol. 73, pp. 8-12, Jan. 2001.
E. Eteshola, and D. Leckband, "Development and characterization of an ELISA assay in PDMS microfluidic channels," Sensor Actuat. B vol. 72, pp. 129-133, Jan. 2001.
S. Lai, S. Wang, J. Luo, J.J. Lee, S.-T. Yang, M.J. Madou, "Design of a compact disk-like microfluidic plateform for enzyme-linked immunosorbent assay," Anal. Chem. vol. 76, pp.1832-1837, April 2004.
K. Sato, M. Tokeshi, H. Kimura, and t. Kitamori, "Determination of carcinoembryonic antigen in human sera by integrated bead-bed immunoassay in a microchip for cancer diagnosis," Anal. Chem. vol. 73, pp.1213-1218, Mar. 2001.
G.H. Seong, W. Zhan, and R.M. Crooks, "Fabrication of microchambers defined by photopolymerized hydrogels and weirs within microfluidic systems: Application of DNA hybridization," Anal. Chem. vol. 74, pp.3372-3377, July 2002.
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