[논문]청국장으로부터 분리한 Poly(γ-glutamic acid)를 생산하는 균주 Bacillus subtilis GS-2의 분리 및 γ-PGA의 확인

방병호; 정은자; 이문수; 김용민; 이동희

doi:10.3839/jabc.2011.001

청국장으로부터 분리한 Poly(γ-glutamic acid)를 생산하는 균주 Bacillus subtilis GS-2의 분리 및 γ-PGA의 확인
Isolation of Bacillus subtilis GS-2 Producing γ-PGA from Ghungkukjang Bean Paste and Identification of γ-PGA 원문보기

Journal of applied biological chemistry, v.54 no.1, 2011년, pp.1 - 6

방병호 (을지대학교 식품영양학과) , 정은자 (을지대학교 식품영양학과) , 이문수 (한국생명공학연구원) , 김용민 (건국대학교 미생물공학과) , 이동희 (건국대학교 미생물공학과)

초록
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Poly-${\gamma}$-glutamic acid (${\gamma}$-PGA)는 청국장이 발효할 때 생성되는 점질성 물질의 하나로, monomer glutamic acid의 ${\alpha}$-아미노기와 ${\gamma}$-카르복실기 사이의 amide linkage에 의해 결합된 D(-)와 L(-) glutamic acid repeat units로 이루어진 homopolymer이다. 주로 Bacillus sp.에 의해 생산된다. ${\gamma}$-PGA는 수용성, 음이온성, 무독성, 생분해성, 생체적 합성, 식용 등의 다양한 특성을 가지고 있기 때문에 여러 분야에서 응용되고 있다. 본 실험에서 ${\gamma}$-PGA를 생산하는 균주를 우리나라의 전통발효식품인 청국장으로부터 분리하였다. 분리균주의 형태 및 배양학적, 생리학적 특성, API kit 및 16S rRNA 서열을 사용하여 동정한 결과, 분리균주 GS-2는 B. subtilis와 가장 유사하여 B. subtilis GS-2로 명명하였다. 분리 정제된 ${\gamma}$-PGA의 동정은 TLC, HPLC, FTIR 그리고 $^1H$-NMR spectroscopy를 통하여 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

${\gamma}$-PGA(poly-${\gamma}$-glutamic acid) is an unusual anionic polypeptide that is made of D- and L-glutamic acid units connected by amide linkages between ${\alpha}$-amino and ${\gamma}$-carboxylic acid groups. ${\gamma}$-PGA has been isolated from many kinds of organisms. Many Bacillus strains produce ${\gamma}$-PGA as a capsular material of an extracellular viscous material. It is safe for eating as a viscosity element of fermented soybean products such as Chungkookjang and Natto. It is biodegradable, edible and nontoxic toward humans and the environment and its molecular weight varies from ten thousand to several hundred thousand depending on the kinds of strains used. Therefore, potential applications of ${\gamma}$-PGA and its derivatives have been of interest in the past few years in a broad range of industrial fields such as food, cosmetics, medicine, water-treatment, etc. In this study, a bacterium, Bacillus subtilis GS-2 isolated from the Korean traditional seasoning food, Chungkookjang could produce a large amount of ${\gamma}$-PGA with high productivity and had a simple nutrient requirement. Based on carbon utilization pattern and partial 16S rRNA sequence analysis, the GS-2 strain was identified as B. subtilis. The determination of purified ${\gamma}$-PGA was confirmed with thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC), fourier transform infrared (FT-IR) spectra, and $^1H$-nuclear magnetic resonance ($^1H$-NMR) spectroscopy.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

γ-PGA 생산균주의 선별은 청국장에서 점성이 높고 blank test를 하여 γ-PGA임을 확인된 γPGA-producing strain 중 γ-PGA 생산배지에서 가장 많은 양의 product를 생산하는 균주를 선별하였다.
γ-PGA는 Goto & Kunioka [1992] 와 Shih & Van [2001]의 방법을 응용하여 분리 및 정제하였다.
1차 선별된 균주들 중에서 여러 차례 새로운 배지에 옮겨 배양한 후 점성이 가장 높고 blank test를 하여 생산된 물질이 γ-PGA임이 확인된 후 가장 많은 양의 γ-PGA를 생산하는 균주 GS-2를 최종 선별하였다.
Bacillus의 동정에 사용되는 API 50 CHB kit (Biomerieux, Marcy l’Etoile, France)를 사용하여 분리균주의 생리화학적 특성을 조사하였으며 API 50 CHB database V4.0을 이용하여 동정하였다.
분리균주의 크기와 형태는 그람 염색(gram stain)하여 관찰하였고 spore는 아포 염색(spore stain)을 하여 광학현미경(ML2000, Meiji)으로 관찰하였다. Glucose-nutrient agar 배지, skim milk 배지, Luria-Bertani(LB) 배지, nutrient agar 배지 등에서 생육한 집락의 크기, 모양과 색깔 등을 관찰하였으며, 반유동 고체배지(tryptone 1.0%, sodium chloride 0.5%, agar 0.5%)에 배양하여 운동성을 조사하였다.
Taiki 등[2004]과 Thorne 등[1954]의 방법을 응용하여, γ-PGA의 여러 유기용매에대한 solubility를 알아보기 위해 용매 중 γ-PGA의 농도를 0.2%로 하여 실험하였다.
그리고 GS-2균의 chromosomal DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Madison, Wl)를 이용하여 분리한 후 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGAT CATGGCTCAG3')와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT3') primer를 사용하여 PCR 증폭[Yoo 등, 1996]한 다음, 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and clean-up system (Promega, Madison, Wl)을 이용하여 정제하였다.
Casein과 starch를 잘 분해하였으며 gelatin 액화능도 나타내었다. 또한 citrate utilization, nitrate reduction에서도 양성 반응을 나타내었으며 indole을 생성하였다. 균의 생장은 20, 30, 37℃에서 생장을 잘 하였으나 50℃에서는 생장이 미약하였고, 55℃에서는 전혀 생장하지 못 하였다(Table 1).
분리균주의 생리학적 특성으로는 casein 분해능, starch 분해능, gelatin 액화능, 당발효성, indole 생성능, nitrate 환원력, Voges-Proskauer 시험, catalase와 oxidase 생산능 등을 조사하였다. 선별된 균주의 형태학적, 배 양학적, 생리학적 특성은 Bergey’s manual of systematic bacteriology [Peter 등, 1986]의 실험법에 기초하여 조사한 후 분류 및 동정하였다.
분리균주의 크기와 형태는 그람 염색(gram stain)하여 관찰하였고 spore는 아포 염색(spore stain)을 하여 광학현미경(ML2000, Meiji)으로 관찰하였다. Glucose-nutrient agar 배지, skim milk 배지, Luria-Bertani(LB) 배지, nutrient agar 배지 등에서 생육한 집락의 크기, 모양과 색깔 등을 관찰하였으며, 반유동 고체배지(tryptone 1.
0)에 도말하고, 37℃에서 24시간 평판 배양하였다. 분리배지에서 배양 후 생성된 colony들 중 점성을 가지거나, 집락 표면에 탄성을 보이는 colony들을 1차 선별하였다. 1차 선별된 균주들 중에서 여러 차례 새로운 배지에 옮겨 배양한 후 점성이 가장 높고 blank test를 하여 생산된 물질이 γ-PGA임이 확인된 후 가장 많은 양의 γ-PGA를 생산하는 균주 GS-2를 최종 선별하였다.
분석용 시료는 KBr과 1:100으로 혼합한 다음 disk(pellet)로 만든 후 FTIR spectrometer (JASCO FT-IR-300E, Tokyo, Japan)로 400~4,000 cm−1 wavenumber에서 측정하였다.
시판 청국장 1g을 멸균된 증류수 9 mL에 현탁하여 70℃에서 10분간 열처리한 후 10−5~10−6으로 희석 하여 현탁액을 분리배지(isolation medium)인 L-glutamic acid 1.0%, glucose 1.0%, (NH4)2SO4 0.5%, MgSO4·7H2O 0.01%, KH2PO4 0.05%, agar 1.5% (pH 7.0)에 도말하고, 37℃에서 24시간 평판 배양하였다.
정제된 γ-PGA의 hydrolysate를 분석하기 위하여 high performance liquid chromatography (HPLC SCL-10A, Shimadzu, Tokyo, Japan)를 수행하였다.
정제된 γ-PGA의 구조를 분석하기 위해 D2O를 solvent로 사용하여 NMR spectrometer (Bruker AMX 500 FT-NMR, HTS, Germany)로 500 MHz에서 측정하였다.
그리고 GS-2균의 chromosomal DNA는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Madison, Wl)를 이용하여 분리한 후 universal primer인 27F (5'-AGAGTTTGAT CATGGCTCAG3')와 1492R (5'-GGATACCTTGTTACGACTT3') primer를 사용하여 PCR 증폭[Yoo 등, 1996]한 다음, 증폭된 PCR 산물은 Wizard SV Gel and clean-up system (Promega, Madison, Wl)을 이용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물의 sequencing은 ABI PRISM 3700 DNA analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 GenBank의 ribosomal DNA sequence Date base와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교분석하였다[Thompson 등, 1994].
정제된γ-PGA의 구조를 분석하기 위하여 FT-IR를 하였다.
현재, 이 균을 이용한 γ-PGA 최적 생산 조건을 검토하고 있으며, 본 연구에서는 γ-PGA를 생산하는 GS-2균을 동정하고, 그리고 정제한 점질성 생성물인 γ-PGA를 thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography(HPLC), fourier transform infrared (FT-IR), 그리고 1H-nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy를 통하여 확인하였다.

대상 데이터

2%로 하여 실험하였다. Test를 위해 aqueous NaHCO₃ (pH 9.0), H₂O, D₂O, DMSO, benzene, formaldehyde, chloroform, ethanol, methanol, acetaldehyde, formic acid, 5 N NaOH, 5 N HCl 등의 유기용매를 사용하였다.

데이터처리

정제된 PCR 산물의 sequencing은 ABI PRISM 3700 DNA analyzer를 이용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과는 GenBank의 ribosomal DNA sequence Date base와 비교하였으며, sequence의 상동성은 Clustal X와 Mega 2 program을 이용하여 비교분석하였다[Thompson 등, 1994].

이론/모형

선별된 균주의 형태학적, 배 양학적, 생리학적 특성은 Bergey’s manual of systematic bacteriology [Peter 등, 1986]의 실험법에 기초하여 조사한 후 분류 및 동정하였다.

성능/효과

Aqueous NaHCO3, formic acid, 5 N NaOH, 5 N HCl 등의 산과 염기에 대한 high solubility의 특성은 solubility control에 적용 가능할 것으로 보이며, 불용성의 용매에 대해 γ-PGA 자체적으로 용해되지 않는 특성은 chemical modification을 통해 solubility를 증가시킬 수 있을 것으로 보이며 γ-PGA의 application의 폭을 더 넓혀줄 수 있을 것으로 생각된다.
Anaerobic condition에서는 생장하지 않았고 Voges-Proskauer test에서 양성 반응을 보였다. Casein과 starch를 잘 분해하였으며 gelatin 액화능도 나타내었다. 또한 citrate utilization, nitrate reduction에서도 양성 반응을 나타내었으며 indole을 생성하였다.
Bacillus sp. 동정 kit인 API 50 CHB의 판독 결과, 분리균주의 B. subtilis에 대한 identity가 99.7%로 나타났다. 형태 및 배양학적, 생리학적 특성 그리고 API kit를 이용하여 동정한 결과, 분리균주는 B.
1). 따라서 본 최종 선발 균주를 B. subtilis GS-2로 명명하였다.
또한, HPLC를 이용하여 정제된 γ-PGA의 hydrolysate를 분석한 결과, authentic glutamic acid (A)와 γ-PGA의 hydrolysate (B)의 peak가 같은 retention time에서 detection된 점으로 보아 정제된 γ-PGA의 hydrolysate는 glutamic acid임을 확인하였다(Fig. 2).
분리균주의 동정. 분리균주의 고체배지 상에서의 특성은 glucose-nutrient agar 배지, skim milk 배지, LB 배지에서 균의 생장이 좋았으며, 이들 배지에서 집락은 유백색이었고, 집락 형태는 원형이었으며 볼록하였다. 이외에 nutrient agar, potato dextrose agar, Endo-agar에서도 좋은 생장을 보였다.
분리균주의 생리적 특성을 검토한 결과, 이 균주는 그람 양성으로 endospore를 형성하였으며 rod type을 보였다. Catalase를 생성하였고 glucose, arabinose, xylose, mannitol 등의 당류로부터 산을 생성하였다.
정제된 γ-PGA를 1H-NMR분석한 결과, chemical shift 상에서 γ-PGA의 α-CH (c, 4.1 ppm), β-CH2 (b, 2.1 ppm; b', 1.9 ppm), γ-CH2 (a, 2.3 ppm)를 확인하였으며 다른 macromolecular impurities는 나타나지 않았다(Fig. 4).
정제된 γ-PGA를 FT-IR 분석한 결과, γ-PGA의 carboxylic acid salt (-COO− asymmetric stretch) peak (1630 cm−1), C=O stretch peak (1730 cm−1) 그리고 N-H stretch peak (3460 cm−1)를 확인하였다(Fig. 3).
즉, γ-PGA는 aqueous NaHCO3, H2O, D2O, DMSO, formaldehyde, formic acid, 5 N NaOH, 5 N HCl 등에는 침전물이 형성되지 않고 투명하게 잘 용해되었으며, benzene, chloroform, ethanol, methanol, acetaldehyde 등의 용매에서는 불용성의 상태로 침전되었다.
7%로 나타났다. 형태 및 배양학적, 생리학적 특성 그리고 API kit를 이용하여 동정한 결과, 분리균주는 B. subtilis에 속하는 균주임이 확인되었다(Table 2). 또한 16S rRNA sequencing을 이용하여, 확인, 동정 결과 B.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한국에서 콩을 가공한 식품은 무엇이 있는가?	대두는 식용 및 공업용으로 널리 쓰이는데, 자실(子實)은 단백질 및 지방이 풍부하다. 콩은 한국인의 식생활에서 가장 중요한 식물성 단백질원이 되고 있으며, 가공하여 콩나물, 두부·된장·간장·청국장 등을 제조하여 식용한다[Oh 등, 2007]. 이 중 청국장은 우리나라 전통 발효식품의 하나로, 대두에 고초균을 번식시켜 제조한 단기 발효식품이다.
	청국장의 생리 활성 기능은?	또한 영양학적, 생리학적으로 여러 가지 기능을 지니고 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 항산화효과, 혈압강하효과, 항균효과, 항암성 등 각종 유용한 생리활성 기능이 보고됨에 따라 기능성 식품으로서 관심이 증가하고 있는 추세이다[Back 등, 2008].
	Poly-γ-glutamic acid란?	Poly-γ-glutamic acid(γ-PGA)는 청국장이 발효될 때 생성되는 점질성 물질의 하나로, monomer glutamic acid의 α-아미노기와 γ-카르복실기 사이의 amide linkage에 의해 결합된 D(-)와 L(-) glutamic acid repeated units로 이루어진 homopolymer이다[Bovarnick, 1942; Thorne 등, 1954; Shih & Van, 2001]. γPGA는 Ivánovics 등에 의해 Bacillus anthracis의 capsule로부터 처음 발견되었으며[Oh 등, 2007], 이후 B.

참고문헌 (18)

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Yoo Jh, Lee ST, and Park YH (1996) Inter- and intraspecific phylogenetic analysis of genus nocardioides and related taxa based on 16S rDNA sequences. Int J Syst Bacteriol 48, 187-194.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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