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문제 정의
- 이와 같이 살균관련 수많은 연구가 수행되었음에도 불구하고, 살균 공정시 항생제 내성유전물질과 내성 플라스미드에 제거에 관한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 본 연구는 하수처리시설에서 많이 쓰이고 있는 염소 및 오존 살균 강도 변화에 따른 항생제 내성 미생물의 제어와 내성 유전자 제거 효율 특성을 알아보려 한다.
- 본 연구에서는 차아염소산나트륨을 이용하여 항생제 면역을 가지고 있는 pB10 plasmid의 살균 여부와 pB10의 제거 여부를 확인하는데 목적을 두고 진행하였다. 시료는 4개의 항생제(Tetracycline, Amoxicillin, Streptomycin, Sulfamethoxazole)에 대한 면역력이 있는 E.
제안 방법
- 각각 살균이 끝난 culture를 LB plate에 16시간동안 배양 하여 살아남은 colony를 계산하였다(Fig 1). 미생물의 사멸정도를 비교해 보면 오존이 염소에 비해 살균효율이 다소 높았고, 주입농도대비 오존의 살균효율이 약 120~140% 정도였다.
- 일반적으로 오존은 염소와 달리 살균력이 오래되지 않고 쉽게 분해 될 수 있기에 지속되는 살균강도의 변화는 염소살균에 비해 크게 다를 수 있다. 따라서, 오존과 염소의 증류수에서의 시간별 농도변화를 측정해 보았다. 이를 측정해 본 결과 오존의 경우 약 10분경과 후 초기 주입량의 약 70%가 소멸됨을 알 수 있었고, 20분 경과후 거의 남아 있는 오존이 없음을 알 수 있었다.
- 원심분리된 시료의 상징액을 완전히 제거한 후, 50 mL phosphate buffer solution (1: 1, v/v) 부어 원심분리로 생성된 pellet을 재 부유 시켰다. 살균효율을 비교하기 위해 염소 살균 실험시 사용하였던 염소 주입량에 상응한 오존 주입량으로 실험을 수행하였다. 회분식 실험에 사용된 오존용액은 LAB 2B 오존발생기 (오조니아코리아(주))을 사용하여 순산소로부터 오존을 발생시켰다.
- 따라서, 오존의 산화력은 20분 후에는 거의 없을 것으로 예상되었다. 이를 뒷받침하기 위해, 추가 실험으로, 10 mg/L의 오존을 이용한 접촉 시간 변화별 colony 살균효율을 산정하였다 (Fig. 5). 그림에서 보여지는 바와 같이 처음 20분에 제어효율 (85%)과 40분의 제어효율(87%)가 거의 없음을 확인 할 수 있었고 약 87%의 효율은 처음 실험값과 유사함을 알 수 있었다 (Fig 3).
- 이에 qPCR(quantative PCR)을 실시하여, 살균 실시하지 않은 샘플 대비 pB10 제거율을 산정하였다. 이에 따르면, 오존살균을 통한 pB10 제거 비율은 염소살균에 비해 약 200~400%정도 높았다(Fig 3).
- 각 시료마다 접촉시간을 45분으로 하였으며 접촉시간동안에는 20℃ Incubator에서 150rpm으로 지속적으로 shaking을 시켜주었다. 이후 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 spreading하여 colony 수를 파악하고, 시료의 50 mL에서 DNA를 추출하여 PCR과 qPCR을 통해 pB10의 살균여부를 확인하였다.
- 각 시료마다 접촉시간을 45분으로 하였고, 접촉시간동안에는 지속적으로 shaking을 시켜주었다. 이후 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 spreading하여 살균된 colony 수를 파악하고, 시료의 50 mL에서 DNA를 추출하여 PCR과 qPCR을 통해 pB10의 살균여부를 확인하였다. 추가적으로 오존의 경우 높은 반응성과 휘발에 의한 손실이 보정하기 위해 미생물 없는 시료를 준비하여 오존 잔류농도를 측정하였다.
- 순산소의 가스 유량은 4∼5 L/min 으로, 10psi 가압상태로 60분 동안 오존을 발생시켰으며 이때 오존 농도는 10 mg/L였다. 준비된 10 mg/L의 오존 용액을 3차 증류수로 희석을 하여 다양한 오존 주입량(오존농도 1, 2, 4, 5, 8, 10 mg/L)을 만들어 사용 하였다. 각 시료마다 접촉시간을 45분으로 하였고, 접촉시간동안에는 지속적으로 shaking을 시켜주었다.
- 배양 후에는 50 mL씩 centrifuge tube에 옮긴 다음 원심분리기를 이용하여 15분 동안 5000 rpm으로 고액분리 시킨 후 상징액을 완전히 제거하고 그 대신 phosphate buffer solution을 같은 양(50mL) 부어서 고액분리로 생성된 pellet과 섞어준다. 준비된 시료에 농도별(염소주입량 1, 2, 4, 5, 8, 10 mg/L)로 차아염소산 나트륨을 주입 후, 초기 pH를 7.6으로 맞추기 위해 염산(HCl 1+500)을 이용하였다(Table 1). 각 시료마다 접촉시간을 45분으로 하였으며 접촉시간동안에는 20℃ Incubator에서 150rpm으로 지속적으로 shaking을 시켜주었다.
- 이후 LB+Agar 배지에 살균된 시료를 spreading하여 살균된 colony 수를 파악하고, 시료의 50 mL에서 DNA를 추출하여 PCR과 qPCR을 통해 pB10의 살균여부를 확인하였다. 추가적으로 오존의 경우 높은 반응성과 휘발에 의한 손실이 보정하기 위해 미생물 없는 시료를 준비하여 오존 잔류농도를 측정하였다. 수용액상의 오존의 농도 측정은 Indigo Method의 방법을 사용하였다(Bader and Higne, 1981).
- 흡광도 분석을 위해 인디고 시액을 5 mL 씩 50 mL Conical tube에 각각 넣었다. 흡광도 기기는 DR2010(HACH)를 이용하여 600nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 한편 3차 증류수만으로 50 mL 되도록 Conical tube를 채운 시료를 blank로 사용하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서는 다제 항생제 내성특성을 가진 pB10을 함유한 Escherichia coli DH 5 alpha, (E.coli DH5α)를 연구대상 미생물로 선정하였다(Shluter et al., 2003).
- 본 연구의 오존 실험도 염소실험과 같이 4개의 항생제(Tetracycline, Amoxicillin, Streptomycin, Sulfamethoxazole)에 대한 면역력이 있는 E.coli DH5α를 20℃에서 배양시킨 시료(O.D 값 = 1.3)를 사용하였다.
- 시료는 4개의 항생제(Tetracycline, Amoxicillin, Streptomycin, Sulfamethoxazole)에 대한 면역력이 있는 E.coli DH5α를 20℃에서 광학 밀도 (Optical Density; OD)값이 1.3이 될 때까지 배양한다.
- 살균효율을 비교하기 위해 염소 살균 실험시 사용하였던 염소 주입량에 상응한 오존 주입량으로 실험을 수행하였다. 회분식 실험에 사용된 오존용액은 LAB 2B 오존발생기 (오조니아코리아(주))을 사용하여 순산소로부터 오존을 발생시켰다. 순산소의 가스 유량은 4∼5 L/min 으로, 10psi 가압상태로 60분 동안 오존을 발생시켰으며 이때 오존 농도는 10 mg/L였다.
이론/모형
- 추가적으로 오존의 경우 높은 반응성과 휘발에 의한 손실이 보정하기 위해 미생물 없는 시료를 준비하여 오존 잔류농도를 측정하였다. 수용액상의 오존의 농도 측정은 Indigo Method의 방법을 사용하였다(Bader and Higne, 1981). 인디고 표준용액은 0.
성능/효과
- 1) E.coli DH5α에 대한 염소와 오존의 살균 살균율을 batch 실험으로 비교해 본 결과, 오존의 살균효율이 약 120~140% 정도 높았다.
- 2) 유전전염물질인 pB10에 대한 PCR와 qPCR을 이용하여 제거 효율을 살펴 본 결과, 오존이 염소살균에 비해 약 200~400% 정도 높은 산화력을 보여주었다. 따라서 내성유전자 물질을 제거하기 위해 오존이 보다 효과적인 산화제이라 판단된다.
- 3) 오존을 이용하여 효과적으로 항생제 내성균 및 유전자를 제어하기 위해서는 반응기내에서 유효한 오존접촉 시간을 늘려 주는 것이 필요하다고 판단된다.
- pB10 제거 효율도 처음 20분의 제거효율(15.3%)과 40분의 제거효율(18.4%)가 그리 다르지 않음을 알 수 있었고(Fig 6), 최종 pB10 제거율은 마찬가지로 처음 실험값과 유사함을 알 수 있었다(Fig 3).
- 그리고 이러한 pB10 제거율은 오존의 투입농도가 높을수록 염소에 비해 제거율의 차가 급격해지는 것으로 나타나졌다. 이는 오존분해(ozone decomposition)로 인해 생성된 OH· 라디칼이 pB10 분해에 오존 보다 더 중요한 역할을 한 것으로 추정된다.
- 5). 그림에서 보여지는 바와 같이 처음 20분에 제어효율 (85%)과 40분의 제어효율(87%)가 거의 없음을 확인 할 수 있었고 약 87%의 효율은 처음 실험값과 유사함을 알 수 있었다 (Fig 3).
- 왜냐하면 유전물질(pB10)은 미생물 내부에 있는 물질로, 이를 제거하기 위해서는 기본적으로 미생물 살균이 선행되어야 하기 때문이다. 따라서, 오존산화력이 염소산화력보다 높기에 항생제 내성균 제어율 증가가 pB10 제거율보다 같거나 클 것으로 예상하였다. 보통 살균력은 보통 세포막의 형태 및 조성, 염소이온에 대한 저항성, 주입농도에 따라 상의한 결과를 나타낼 수 있는데(Cho et al, 2010), 본 실험에서는 기본적으로 E.
- 실험 결과에 따르면, 오존은 산화력자체(C)는 염소보다 강력하나 유효접촉 시간(T)은 염소만큼 유지 될 수 없다. 따라서, 오존은 일단 살균된 미생물은 그 속의 유전물질까지 강력하게 산화 시키나 (염소보다 200~400%이상의 pB10 제어율) 상대적으로 염소보다 짧은 미생물 유효 노출 시간 때문에 미생물 살균효율은 pB10만큼 높지는 않은 (염소보다 120~140%이상의 colony 제어율)결과치를 보인 것으로 판단된다. 이러한 결과는 미량 오염물질 및 미생물살균을 오존을 이용하여 할 경우, 반응기내에서의 유효접촉시간, 즉 소독의 지속성을 늘리는 방안이 중요할 것으로 판단된다.
- 각각 살균이 끝난 culture를 LB plate에 16시간동안 배양 하여 살아남은 colony를 계산하였다(Fig 1). 미생물의 사멸정도를 비교해 보면 오존이 염소에 비해 살균효율이 다소 높았고, 주입농도대비 오존의 살균효율이 약 120~140% 정도였다. 일반적으로 오존은 강력한 산화제이며 다양한 종류의 미생물에 대해 살균효율이 높다고 알려져 있고(Driedger et al.
- 살균 후 6가지 다른 농도의 시료를 이용하여 pB10에 대한 PCR를 해 본 결과 6가지 농도 모두에서 pB10의 완전 제어(PCR product가 사라지는 현상)를 확인할 수는 없었다(Fig 2).
- 실험 결과에 따르면, 오존은 산화력자체(C)는 염소보다 강력하나 유효접촉 시간(T)은 염소만큼 유지 될 수 없다. 따라서, 오존은 일단 살균된 미생물은 그 속의 유전물질까지 강력하게 산화 시키나 (염소보다 200~400%이상의 pB10 제어율) 상대적으로 염소보다 짧은 미생물 유효 노출 시간 때문에 미생물 살균효율은 pB10만큼 높지는 않은 (염소보다 120~140%이상의 colony 제어율)결과치를 보인 것으로 판단된다.
- 따라서, 오존과 염소의 증류수에서의 시간별 농도변화를 측정해 보았다. 이를 측정해 본 결과 오존의 경우 약 10분경과 후 초기 주입량의 약 70%가 소멸됨을 알 수 있었고, 20분 경과후 거의 남아 있는 오존이 없음을 알 수 있었다. 그러나, 염소의 경우 40분까지 처음농도의 약 91%가 유지되는 것으로 나타났다 (Fig 4).
- 이에 qPCR(quantative PCR)을 실시하여, 살균 실시하지 않은 샘플 대비 pB10 제거율을 산정하였다. 이에 따르면, 오존살균을 통한 pB10 제거 비율은 염소살균에 비해 약 200~400%정도 높았다(Fig 3).
- 전체적으로 항생제 내성균 제어와 유전물질 제어는, 오존의 살균력이 염소 살균력보다 높은 것으로 나타났다. 특히, pB10 유전자 제거에는 훨씬 더 좋은 제거 효율(200~400%)을 보였으나, colony 수 감소에는 그리 큰 감소 효율(120~140%)을 보이지는 아니하였다.
- 전체적으로 항생제 내성균 제어와 유전물질 제어는, 오존의 살균력이 염소 살균력보다 높은 것으로 나타났다. 특히, pB10 유전자 제거에는 훨씬 더 좋은 제거 효율(200~400%)을 보였으나, colony 수 감소에는 그리 큰 감소 효율(120~140%)을 보이지는 아니하였다. 이는 예상과는 다른 결과 이다.
- 하지만 본 연구에서 사용한 항생제 내성 E.coli DH5α에 대해서 염소에 비해 월등한 살균효율을 보이지는 못하였다.
후속연구
- 그러나, 이러한 국내외 연구는 극히 제한적이다. 따라서, 하수내에 존재하는 항생제 내성 플라스미드 제어기법 연구는 향후 필요한 미량유해물질 제어연구 중 하나가 될 것이다.
- 하지만, 하수처리수가 안정적인 도시 내 대체수자원으로서의 여러 기능을 감당하기 위해서는 미래에는 하수처리수의 수질수준이 상수 원수 수준 또는 이상까지 도달할 필요가 있을 것으로 사료된다. 따라서, 하수처리수를 상수원수 수준의 고품질로 처리하기 위해서는 현재 집중하고 있는 유기물질 및 영양소(질소, 인)제거 뿐만 아니라 하수 내에 포함되어 있는 다양한 미량오염물질의 제거가 특히 중요할 것으로 판단된다. 최근 10년 사이에 분석기술의 발달 및 물의 재이용관점에서 많은 관심을 받게 된 하수 내 미량 오염물질은, 하수 내 함유된 농도가 기존의 오염물질에 비해 매우 적은 농도임에도 불구하고 (ppb나 ppt) 생태계에 미치는 영향은 간과 할 수 없는 것으로 알려지고 있다 (Rosal et al.
- 이러한 결과는 미량 오염물질 및 미생물살균을 오존을 이용하여 할 경우, 반응기내에서의 유효접촉시간, 즉 소독의 지속성을 늘리는 방안이 중요할 것으로 판단된다. 따라서, 효과적 미량 유전 오염물질 제어를 위해서는 연속적인 오존 주입 시스템, 오존 버블사이즈를 줄이는 등의 오염물질과 접촉시간을 늘리는 반응기를 고안하는 것이 필요할 것으로 판단된다.
- pB10는 64kbp의 IncP-β의 플라스미드로 프랑스 하수처리장에서 처음 분리되었다. 이 항생제 내성 플라스미드는 Amoxicillin, Streptomycin, Sulfamethoxazole 과 Tetracycline 과 Mercury에 저항성을 가진다고 알려져 있으므로 내성균 및 내성유전자 연구를 위한 지표미생물로 적합할 것으로 판단된다.
- 따라서, 오존은 일단 살균된 미생물은 그 속의 유전물질까지 강력하게 산화 시키나 (염소보다 200~400%이상의 pB10 제어율) 상대적으로 염소보다 짧은 미생물 유효 노출 시간 때문에 미생물 살균효율은 pB10만큼 높지는 않은 (염소보다 120~140%이상의 colony 제어율)결과치를 보인 것으로 판단된다. 이러한 결과는 미량 오염물질 및 미생물살균을 오존을 이용하여 할 경우, 반응기내에서의 유효접촉시간, 즉 소독의 지속성을 늘리는 방안이 중요할 것으로 판단된다. 따라서, 효과적 미량 유전 오염물질 제어를 위해서는 연속적인 오존 주입 시스템, 오존 버블사이즈를 줄이는 등의 오염물질과 접촉시간을 늘리는 반응기를 고안하는 것이 필요할 것으로 판단된다.
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