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문제 정의
- 본 연구에서는 금속환원미생물들에 의한 지하수의 산화/환원전위(ORP, oxidation/reduction potential) 변화와 특성에 관한 실험을 실시하였다. 일반적으로 지하수는 깊은 심도일수록 산소 농도가 희박해짐과 더불어 Eh (표준수소전극)값이 점차 낮아진다.
- 지금까지 어느 특정 지역의 지하수의 Eh는 단순히 그 지역의 고유값으로만 생각하여 왔다. 하지만, 지하수의 Eh값은 여러 원인(용존산소 농도, 특정 원소(산화 혹은 환원제 역할) 등)에 의해 결정되며, 본 연구에서는 특별히 지하미생물이 산화/환원전위의 변화에 미칠 수 있는 영향에 대해서 알아보았다. 이를 위해 본 실험에서는 금속환원미생물들에 의한 수용액의 Eh 변화를 2주 동안 관찰하였고, 부수적으로 생성되는 생광물(biogenic)의 광물학적 특징을 조사하였다.
제안 방법
- SRB의 활동에 의해 수용액이 점차 환원되면서 고형 무기물인 황화광물이 만들어졌으며, 불가리스 미생물을 대상으로 수용액으로부터 만들어지는 황화광물의 시간별 생성량 및 입자들의 특징을 살펴보았다. 그림 3에서 볼 수 있는 것처럼, 미생물 활동에 의해 용액상에 부유하는 Fe-sulfide 입자들의 양이 점차 증가하고 있음을 알 수 있다.
- 필요에 따라서는 고체 시료를 Caldofix resin으로 굳히고 다이아몬드 칼을 사용하여 시편을 70 nm의 두께로 잘라 시편의 내부 구조를 관찰하였다. TEM 분석장비로는 JEOL JEM 2100F 모델을 사용하였으며, 200 kV의 가속전압 조건에서 필요에 따라 고형물에 대한 SAD (selected area diffraction) 이미지를 얻어 광물을 감정하였다.
- XRD 분석은 Rigaku D/MAX-2500(Japan) 모델을 사용하였으며, 2 theta 5～50°까지 1°/min의 스캔속도와 0.01 step size로 CuKα (40 kV/300 mA) 조건에서 분석하였다.
- 각기 다른 3종류의 미생물에 의한 수용액의 Eh변화 특성을 살펴보았다. 먼저, 불가리스 미생물의 경우 초기 수용액의 Eh값은 약 -120 mV였으며, 시간이 경과함에 따라 미생물의 활동에 의해 Eh값이 점차 낮아지기 시작하였다(그림 1a).
- 그리고, 진공 하에서 OsO4로 분말 시료를 얇게 코팅(～10 nm)한 후 꺼내어 SEM 본체에 시료를 집어 넣고 관찰하였다. 고체 부유물들의 미세한 조직 및 구조를 관찰하기 위해 TEM을 이용하였으며, 탄소막이 있는 200 mesh Cu-grid를 핀셋으로 잡고 용액상에 분산된 고체 부유물들의 일부를 건져내고 Cu-grid 위의 수분을 킴와이프스 페이퍼로 흡수 제거한 후 시료를 관찰하였다. 필요에 따라서는 고체 시료를 Caldofix resin으로 굳히고 다이아몬드 칼을 사용하여 시편을 70 nm의 두께로 잘라 시편의 내부 구조를 관찰하였다.
- 주사기로 채취된 고형물들을 원심분리(10,000 rpm, 10분)하고 무산소 증류수로 여러 번 세척한 후, Glove box의 환원환경(N2 gas) 하에서 충분히 건조시켰다. 광물 감정을 위해 먼저 XRD를 사용하였는데, 시료 분석 전까지 대기 중의 산소에 의한 산화를 피하기 위해 건조 시료를 진공 데시케이터에 넣고 질소가스로 충전한 후 분석 장소까지 운반하였다. XRD 분석은 Rigaku D/MAX-2500(Japan) 모델을 사용하였으며, 2 theta 5～50°까지 1°/min의 스캔속도와 0.
- 시료 관찰을 위해 SEM용 시편 홀더에 carbon tape를 붙이고 분말 시료를 고루 문질러 미세 입자들이 tape로부터 잘 떨어지지 않도록 하였다. 그리고, 진공 하에서 OsO4로 분말 시료를 얇게 코팅(～10 nm)한 후 꺼내어 SEM 본체에 시료를 집어 넣고 관찰하였다. 고체 부유물들의 미세한 조직 및 구조를 관찰하기 위해 TEM을 이용하였으며, 탄소막이 있는 200 mesh Cu-grid를 핀셋으로 잡고 용액상에 분산된 고체 부유물들의 일부를 건져내고 Cu-grid 위의 수분을 킴와이프스 페이퍼로 흡수 제거한 후 시료를 관찰하였다.
- 2 µm 이상의 고형물은 멤브레인 필터로 거르고 곧바로 실체현미경(stereoscopy)을 이용하여 입자들을 확대하여 입자들의 크기, 분포 및 형태 등을 관찰하였다. 그리고, 필터의 고형물은 80℃ 오븐에서 12시간 건조시킨 후 전자저울로 무게를 측정하여 채취 용액 시료당 포함된 고형물의 양을 계산하고 일정 용액량에 대한 고형물의 생성량 및 증가량을 시간별로 계산하였다.
- 마지막으로, 철환원 세균(IRB)인 스와넬라에 의한 수용액의 Eh 변화를 살펴보았다(그림 2). 실험 조건은 앞서 관찰한 SRB와는 조금 다르게 Fe(II)-sulfate 대신에 Fe(III)-citrate를 전자수용체로 사용하였다.
- Eh 측정을 위해 Horiba사의 F-51BW pH/mV meter 모델과 9300-10D ORP electrode를 사용하였으며, Eh 관련 실험, 측정 및 시료 채취는 글로브박스 내에서 수행하였다. 미생물 활동에 의한 수용액상의 부유 생성물 관찰을 위해 주사기를 이용하여 2 mL의 수용액을 필요시마다 채취하였다.
- 01 step size로 CuKα (40 kV/300 mA) 조건에서 분석하였다. 미생물에 의해 만들어진 생광물의 형태를 확인하고 표면 특징을 관찰하기 위해 FE-SEM (Hitach, S-4700)을 사용하였으며, 관찰할 시료는 글로브박스의 N2 환경에서 건조하여 질소 충전 진공 데시케이터로 분석 장소까지 운반하였다. 시료 관찰을 위해 SEM용 시편 홀더에 carbon tape를 붙이고 분말 시료를 고루 문질러 미세 입자들이 tape로부터 잘 떨어지지 않도록 하였다.
- 미생물에 의해 생성된 고체 부유물들의 광물감정을 위해 X-선 회절분석기(XRD), 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM) 기기가 사용되었다. 주사기로 채취된 고형물들을 원심분리(10,000 rpm, 10분)하고 무산소 증류수로 여러 번 세척한 후, Glove box의 환원환경(N2 gas) 하에서 충분히 건조시켰다.
- 전자공여체로 젖산나트륨(Na-lactate) 10 mM이 주입되었으며 SRB 미생물의 경우 Fe(II)-sulfate (2 mM)를 전자수용체로 사용하였고, 스와넬라균의 경우에는 Fe(III)- citrate(2 mM)를 전자수용체로 사용하였다. 미생물의 총 주입량은 사전에 미리 배양된 성장배지에서 각각 1 mL씩 취득하여 주입하였고, 그 이후 2주 동안 수용액의 산화/환원전위 변화를 관찰하였다. Eh 측정을 위해 Horiba사의 F-51BW pH/mV meter 모델과 9300-10D ORP electrode를 사용하였으며, Eh 관련 실험, 측정 및 시료 채취는 글로브박스 내에서 수행하였다.
- 미생물에 의해 만들어진 생광물의 형태를 확인하고 표면 특징을 관찰하기 위해 FE-SEM (Hitach, S-4700)을 사용하였으며, 관찰할 시료는 글로브박스의 N2 환경에서 건조하여 질소 충전 진공 데시케이터로 분석 장소까지 운반하였다. 시료 관찰을 위해 SEM용 시편 홀더에 carbon tape를 붙이고 분말 시료를 고루 문질러 미세 입자들이 tape로부터 잘 떨어지지 않도록 하였다. 그리고, 진공 하에서 OsO4로 분말 시료를 얇게 코팅(～10 nm)한 후 꺼내어 SEM 본체에 시료를 집어 넣고 관찰하였다.
- 실내 실험을 통해 토양 및 지하수에 서식하는 금속환원미생물들의 생지화학적 활동으로 수용액의 산화/환원전위가 변하는 양상을 시간별로 관찰하였다. 주입 미생물에 의해 산화철 및 황산염의 환원이 시작되고 초기 수용액의 Eh가 최대 -400 mV 이하까지 떨어졌다.
- 실험 시작 2주 후 미생물에 의해 생성된 황화광물에 대한 XRD 동정을 실시하였다. 관찰된 황화광물은 뚜렷한 X-선 회절패턴을 보여 주었으며(그림 5), 감정 결과 맥키나와이트(mackinawite, FeS) 결정체 입자들로 판명되었다.
- 외부미생물에 의한 오염을 막기 위해 용액은 JISICO사의 압열멸균기(98 kPa, 121 ℃, 15분)로 멸균하였고, 각종 시약 및 성분의 주입시 0.2 µm 필터링을 거쳤다.
- 하지만, 지하수의 Eh값은 여러 원인(용존산소 농도, 특정 원소(산화 혹은 환원제 역할) 등)에 의해 결정되며, 본 연구에서는 특별히 지하미생물이 산화/환원전위의 변화에 미칠 수 있는 영향에 대해서 알아보았다. 이를 위해 본 실험에서는 금속환원미생물들에 의한 수용액의 Eh 변화를 2주 동안 관찰하였고, 부수적으로 생성되는 생광물(biogenic)의 광물학적 특징을 조사하였다.
- 주사기를 이용하여 용액 시료를 채취할 때, 0.2 µm 이상의 고형물은 멤브레인 필터로 거르고 곧바로 실체현미경(stereoscopy)을 이용하여 입자들을 확대하여 입자들의 크기, 분포 및 형태 등을 관찰하였다.
- 고체 부유물들의 미세한 조직 및 구조를 관찰하기 위해 TEM을 이용하였으며, 탄소막이 있는 200 mesh Cu-grid를 핀셋으로 잡고 용액상에 분산된 고체 부유물들의 일부를 건져내고 Cu-grid 위의 수분을 킴와이프스 페이퍼로 흡수 제거한 후 시료를 관찰하였다. 필요에 따라서는 고체 시료를 Caldofix resin으로 굳히고 다이아몬드 칼을 사용하여 시편을 70 nm의 두께로 잘라 시편의 내부 구조를 관찰하였다. TEM 분석장비로는 JEOL JEM 2100F 모델을 사용하였으며, 200 kV의 가속전압 조건에서 필요에 따라 고형물에 대한 SAD (selected area diffraction) 이미지를 얻어 광물을 감정하였다.
대상 데이터
- 미생물의 총 주입량은 사전에 미리 배양된 성장배지에서 각각 1 mL씩 취득하여 주입하였고, 그 이후 2주 동안 수용액의 산화/환원전위 변화를 관찰하였다. Eh 측정을 위해 Horiba사의 F-51BW pH/mV meter 모델과 9300-10D ORP electrode를 사용하였으며, Eh 관련 실험, 측정 및 시료 채취는 글로브박스 내에서 수행하였다. 미생물 활동에 의한 수용액상의 부유 생성물 관찰을 위해 주사기를 이용하여 2 mL의 수용액을 필요시마다 채취하였다.
- 마지막으로, 철환원 세균(IRB)인 스와넬라에 의한 수용액의 Eh 변화를 살펴보았다(그림 2). 실험 조건은 앞서 관찰한 SRB와는 조금 다르게 Fe(II)-sulfate 대신에 Fe(III)-citrate를 전자수용체로 사용하였다. 실험이 진행되면서 Eh값은 SRB의 경우와 비슷하게 계속적으로 감소하였으며, 최대 -400 mV 까지 감소하였다.
- 실험에 사용된 미생물의 종류는 총 3가지로써, 불가리스(Desulfovibrio vulgaris (ATCC 7757))와 디설프리칸스(Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 29577)) 2종류와 산화철을 환원시킬 수 있는 스와넬라(Shewanella putrefaciens (ATCC BAA-1097))등 총 3가지 종류의 미생물을 사용하였다. 위의 미생물들은 미국 ATCC (American Type Culture Collection)사로부터 구입하였다.
- 실험에 사용된 미생물의 종류는 총 3가지로써, 불가리스(Desulfovibrio vulgaris (ATCC 7757))와 디설프리칸스(Desulfovibrio desulfuricans (ATCC 29577)) 2종류와 산화철을 환원시킬 수 있는 스와넬라(Shewanella putrefaciens (ATCC BAA-1097))등 총 3가지 종류의 미생물을 사용하였다. 위의 미생물들은 미국 ATCC (American Type Culture Collection)사로부터 구입하였다. 불가리스와 디설프리칸스는 황산염환원 미생물(sulfate-reducing bacteria)로써 같은 Desulfovibrio 속이지만 다른 종이며, 공통점으로는 황산염(sulfate)을 황화물(sulfide)로 환원시킨다는 점이다.
- 2 µm 필터링을 거쳤다. 전자공여체로 젖산나트륨(Na-lactate) 10 mM이 주입되었으며 SRB 미생물의 경우 Fe(II)-sulfate (2 mM)를 전자수용체로 사용하였고, 스와넬라균의 경우에는 Fe(III)- citrate(2 mM)를 전자수용체로 사용하였다. 미생물의 총 주입량은 사전에 미리 배양된 성장배지에서 각각 1 mL씩 취득하여 주입하였고, 그 이후 2주 동안 수용액의 산화/환원전위 변화를 관찰하였다.
이론/모형
- ATCC사로부터 구입한 미생물들은 초기에 분말 상태로 작은 유리캡슐에 담겨 있었으며, 유리칼을 사용하여 캡슐을 절단하고 담겨진 세균분말을 준비된 액체배지에 분산시켰다. 배지 조성은 황산염 환원미생물(SRB)인 경우 오종민 외(2010)에 기술된 방법으로 준비하였으며, 철환원미생물(IRB, iron-reducing bacteria)인 경우에는 TSB (tryptic soy broth) 성분의 배양액(이승엽 외, 2009; Lee et al., 2010)을 사용하였다. SRB에 대한 모든 실험 준비과정은 글로브박스(N2:CO2 = 80:20) 안에서 수행되었다.
성능/효과
- 실험 시작 2주 후 미생물에 의해 생성된 황화광물에 대한 XRD 동정을 실시하였다. 관찰된 황화광물은 뚜렷한 X-선 회절패턴을 보여 주었으며(그림 5), 감정 결과 맥키나와이트(mackinawite, FeS) 결정체 입자들로 판명되었다. 비교적 잘 발달된 결정 구조를 가진 형태로 성장하였으며 첫 번째 (001) 피크를 통해 맥키나와이트 판상광물이 0.
- 이는 수용액상에 용존된 황산염이 미생물로부터 전자를 공급받는 과정에서 반응 초기부터 소량의 Fe-sulfide 광물들이 형성되기 시작한다는 것을 지시한다. 또한, 최종적으로 확인된 황화광물들의 양은 용액상에 용존된 황산염 및 철의 농도와 밀접한 관련이 있는 것으로 보이며, 만약 이들의 초기 용존 이온 농도가 높거나 미생물의 증식이 활발하다면 생성되는 황화광물의 속도 및 최종적인 양도 증가할 것으로 예상된다.
- 디설프리칸스에 의해 만들어진 맥키나와이트 입자는 상대적으로 좀 더 일그러진 형태를 보여주고 있으며, 입자들의 크기는 nm에서 µm 크기까지 다양하였다. 맥키나와이트 광물을 TEM으로 관찰하였을 때, 관찰된 입자들은 대체로 전자빔이 투과될 정도로 얇은 판상두께를 가지고 있었다(그림 7). 판상 형태로 이루어진 구조를 자세히 관찰하면 FeS layer들의 개수를 알 수 있는데, 관찰된 입자들은 적게는 수 개의 layer에서 많게는 수십 개의 layer들로 구성되어 있었다.
- 각 layer들은 Fe와 S가 1:1로 결합하여 a와 b축 방향으로 성장한다(Ohfuji and Rickard, 2006). 맥키나와이트 입자들의 SAD (selected area diffraction)는 뚜렷한 환형 패턴(ring pattern)을 가지고 있었고, 앞서 관찰된 XRD 결과(그림 5)와 동일한 d-spacing 회절 간격을 보여 주었다.
- 그림 6은 불가리스 및 디설프리칸스의 활동에 의해 생성된 맥키나와이트 광물의 표면 조직을 확대하여 관찰한 주사전자현미경(SEM) 이미지이다. 미생물별 생성 맥키나와이트의 표면 형태는 큰 차이가 없었으며, 광물 외형이 얇은 종잇장처럼 다소 일그러진 모습이 특징적이었다. 이러한 점은 결정성이 약한 스멕타이트(smectite) 점토광물과 매우 유사한 특징이라 할 수 있다.
- 이러한 Eh값은 일반 지하 환경의 저산소 환원환경에 해당될 수 있는 낮은 값이다. 미생물별로 수용액에 대한 환원 능력은 약간의 차이가 있었으며, 같은 SRB 미생물 계열이라 할지라도 종에 따라 Eh 감소율이 조금 달랐다. 특히, 디설프리칸스의 환원 능력이 상대적으로 탁월했으며, 수용액이 환원되면서 수용액상의 환원된 철과 황이 결합하여 맥키나와이트라는 황화광물이 지속적으로 만들어졌다.
- 실험 시작 후 불가리스의 경우처럼 Eh값이 서서히 감소하기 시작했으며, 약 5일이 지나면서 최저점(약 -500 mV)에 도달하였다. 불가리스의 경우와 비교해 볼 때, 수용액의 환원 속도는 매우 빠르게 진행되었으며 최저 Eh값도 -100 mV 이상 차이났다. 이상의 결과로 볼 때, 비슷한 계통의 황산염환원 미생물(SRB)이라도 개체의 종류에 따라 환원능력에 다소간 차이가 있다는 것 알 수 있으며, 디설프리칸스는 불가리스에 비해 상대적으로 강한 환원능력을 갖는 미생물로 평가된다.
- 관찰된 황화광물은 뚜렷한 X-선 회절패턴을 보여 주었으며(그림 5), 감정 결과 맥키나와이트(mackinawite, FeS) 결정체 입자들로 판명되었다. 비교적 잘 발달된 결정 구조를 가진 형태로 성장하였으며 첫 번째 (001) 피크를 통해 맥키나와이트 판상광물이 0.5 nm의 층간 두께를 가지고 있음을 알 수 있었다. 맥키나와이트 광물은 황철석(FeS2)의 선구광물(precursor mineral)로 알려져 있으며(Barton and Hamilton, 2007), 지하미생물인 SRB에 의해 흔히 만들어지는 광물이다(Gramp et al.
- 디설프리칸스가 있는 수용액의 경우 불가리스의 경우와 조금 다른 Eh 변화 양상을 보여 주었다(그림 1b). 실험 시작 후 불가리스의 경우처럼 Eh값이 서서히 감소하기 시작했으며, 약 5일이 지나면서 최저점(약 -500 mV)에 도달하였다. 불가리스의 경우와 비교해 볼 때, 수용액의 환원 속도는 매우 빠르게 진행되었으며 최저 Eh값도 -100 mV 이상 차이났다.
- 실험 조건은 앞서 관찰한 SRB와는 조금 다르게 Fe(II)-sulfate 대신에 Fe(III)-citrate를 전자수용체로 사용하였다. 실험이 진행되면서 Eh값은 SRB의 경우와 비슷하게 계속적으로 감소하였으며, 최대 -400 mV 까지 감소하였다. 초기의 Eh값 변화속도는 조금 느렸지만 시간이 지남에 따라 수용액의 환원되는 속도는 점차 증가하였다.
- 불가리스의 경우와 비교해 볼 때, 수용액의 환원 속도는 매우 빠르게 진행되었으며 최저 Eh값도 -100 mV 이상 차이났다. 이상의 결과로 볼 때, 비슷한 계통의 황산염환원 미생물(SRB)이라도 개체의 종류에 따라 환원능력에 다소간 차이가 있다는 것 알 수 있으며, 디설프리칸스는 불가리스에 비해 상대적으로 강한 환원능력을 갖는 미생물로 평가된다.
- 환원조건의 수용액으로부터 만들어지는 이러한 생기원 광물들은 초기에는 비정질 형태였지만 점차 성장하여 점토광물과 같은 판상구조의 결정질 형태로 발전하였다. 이의 결과로부터 우리가 알 수 있는 사실은, 생기원 황화 금속광물들은 단순히 미생물로부터 만들어진 침전 광물에 지나지 않고, 일시적으로 유입된 지하수와 반응하여 수용액의 급격한 ORP 변화를 예방하거나 공존하는 환원 핵종들의 재산화를 억제하는 버퍼로써의 역할을 감당하는 중요한 환원물질로 평가될 수 있다.
후속연구
- 또한, 미생물 의해 간접적으로 형성된 맥키나와이트와 같은 황화광물들은 환원 지하수의 장기적 안정성 유지에 매우 중요한 역할을 담당하리라 판단된다. 만약, 미생물의 활동이 일시적으로 약화되거나 외부의 산화 지하수 유입에 의해 해당 지역의 환원환경이 교란될 경우, 다량의 황화광물들이 유입 지하수와 반응하여 지하수의 급격한 산화/환원 변화를 감소시키고 빠르게 안정화시킬 수 있을 것이다.
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