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문제 정의
- 따라서 본 연구는 보존되어 있는 구름버섯균주들의 rDNA ITS 영역의 염기서열을 분석하여 이들 균주들의 분류학적 위치와 계통분류학적인 유연관계를 분석하고 RAPD분석에 의한 유전적 다형성을 조사한 결과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- PCR 증폭은 15ng의 genomic DNA, 각 0.5 pmol의 primer, 200μM dNTP, 2.5 unit의 Taq DNA polymerase, 10mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1.5mM MgCl2에 증류수를 첨가하여 최종 volume을 30㎕로 하였다.
- PCR은 94℃에서 4분간 pre-heating시킨 다음, 94℃ 1분간 denaturation, 55℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분 동안 extension을 1cycle로 하여 총 40cycles를 반응시킨 후 4℃에서 유지하였다. PCR산물은 1.2% agarose gel에서 90 volt로 loading한 후 UV transilluminator lamp 상에서 밴드를 관찰하였다.
- 구름버섯속 균주로부터 염색체 DNA 추출은 PDA배지 (potate dextrose agar)에서 7일간 배양한 균사체를 수확하여 동결건조한 후 소량을 2㎖ 튜브에 넣고 마쇄한 뒤 1㎖ CTAB solution〔2% CTAB(w/v), 100mM Tris-HCl(pH 8.0), 20mM EDTA(pH 8.0), 1.4 M NaCl, 1% PVP(polyvinylpyrro lidone)에 현탁한 후 60℃에서 40분 동안 반응시켰다. 반응 후 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 Rnase와 Proteinase K 50㎍을 첨가 후 37℃에서 40분간 반응시켰다.
- 이들 균주들에 대한 분류학적위치 및 유전학적인 유연관계 분석을 위하여 계통수를 그려 이들 사이의 유연관계를 확인해 보았다(Fig. 3). 분석결과 T.
- 이들 염기서열을 바탕으로 GenBank에 상동성을 조사하였고, 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다(Accession no. HQ901177∼HQ901194).
- DNA 증폭은 initial denaturation을 94℃에서 2분간 실시하고, denaturation 40초(94℃), annealing 1분(58℃), extension 1분(72℃)으로 30cycle을 반응시키고 마지막으로 72℃에서 5분간 incubation 하였다. 증폭된 DNA는 1.5% agarose gel에서 전기영동을 하여 확인 후 sequencing을 수행하였다. 균주간 유연관계 분석을 위한 염기서열의 분석은 ClustralW 분석프로그램(Thompson 등, 1994)을 사용하였다.
대상 데이터
- 다형성 분석을 위하여 각각의 균주에서 추출한 염색체 DNA를 RAPD-PCR 방법을 이용하여 증폭하였다(Williams 등, 1990). Primer(20 mer)는 시제품으로 PELF을 구입하여 사용하였다. PCR은 94℃에서 4분간 pre-heating시킨 다음, 94℃ 1분간 denaturation, 55℃에서 40초간 annealing, 72℃에서 2분 동안 extension을 1cycle로 하여 총 40cycles를 반응시킨 후 4℃에서 유지하였다.
- 각 균주로부터 추출한 염색체 DNA에서 rDNA의 ITS (internal transcribed spacers)영역을 증폭하기 위하여 ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3')과 ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')의 universal primers를 사용하였다(White 등, 1990).
- ) 18균주를 사용하였다(Table 1). 본 균주의 배양은 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco)을 사용하였고, 25℃의 항온기에서 약 15일간 배양하였다. 공시균주들은 멸균증류수 튜브에 옮겨 상온에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 본 시험에 사용한 균주는 2006년 농업과학기술원 응용미생물과에 보존하고 있는 구름버섯속(Trametes spp.) 18균주를 사용하였다(Table 1). 본 균주의 배양은 PDA(Potato Dextrose Agar, Difco)을 사용하였고, 25℃의 항온기에서 약 15일간 배양하였다.
데이터처리
- 5% agarose gel에서 전기영동을 하여 확인 후 sequencing을 수행하였다. 균주간 유연관계 분석을 위한 염기서열의 분석은 ClustralW 분석프로그램(Thompson 등, 1994)을 사용하였다. Jukes와 Cantor(1969) 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
이론/모형
- 균주간 유연관계 분석을 위한 염기서열의 분석은 ClustralW 분석프로그램(Thompson 등, 1994)을 사용하였다. Jukes와 Cantor(1969) 방법을 이용하여 evolutionary distance matrix를 작성하고, MEGA 4의 Neighbor-joining 방법을 이용하여 계통수를 작성하였으며, tree의 안정성은 1000 반복의 bootstrap 분석으로 조사하였다.
- 다형성 분석을 위하여 각각의 균주에서 추출한 염색체 DNA를 RAPD-PCR 방법을 이용하여 증폭하였다(Williams 등, 1990). Primer(20 mer)는 시제품으로 PELF을 구입하여 사용하였다.
성능/효과
- T. elegans 그룹인 TM05는 T. versicolor 그룹인 TM01 등 6균주와는 93∼94%의 상동성을 보였지만, TM17균주와 는 90%의 낮은 상동성을 보였다.
- T. gibbosa 그룹인 TM07은 T. versicolor 그룹인 TM01 등 6균주와는 91∼92%의 낮은 상동성을 보였고, TM17균주와도 87%의 낮은 상동성을 보였다.
- gibbosa는 아주 다른 밴드 패턴을 보였다. TM02 등 6 균주는 보존목록에서는 Trametes로 분류되어 있으나, 염기서 열에 의한 상동성 조사 결과 완전히 다른 genus로 밝혀졌으며, RAPD의 밴드 패턴도 Trametes와는 완전히 다른 양상을 보였다. 또한 같은 종내에서 분포지역에 따라 상이한 밴드 패턴을 보였다.
- 보존중인 구름버섯속 균주를 선발하여 배양 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정한 결과 보존시 균주의 학명과 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다. rDNA의 ITS 영역의 염기서열을 바탕으로 보존 당시 동정된 결과와 염기서열 분석을 통한 결과를 비교한 결과 종이 다른 균주가 5균주와 학명이 다른 균주가 6균주로 전체의 61%를 차지하였다. 국내에서 수집한 구름버섯의 경우 T.
- 보존균주 목록과 염기서열 분석을 통한 동정결과에서 종이 다른 균주가 5균주, 학명이 완전히 다른 균주가 6균주로 전체의 61%를 차지하였다. 국내에서 수집한 구름버섯의 경우 T. versicolor, T. elegans, T. gibbosa 등 3개 속으로만 동정되었고, 미국에서 수집한 균주는 T. junipericola로 동정되었다(Table 2). 이와 같이 보존 목록과 완전히 다른 genus로 나타난 균주들에 대해서는 계통분류학적인 유연관계 분석과 보존중인 자실체 유전자와의 상동성을 비교하여 보존진균의 오염 여부를 판단하여 기존 목록의 학명을 재분류해야 할 것으로 판단된다.
- rDNA의 ITS 영역의 염기서열을 바탕으로 보존 당시 동정된 결과와 염기서열 분석을 통한 결과를 비교한 결과 종이 다른 균주가 5균주와 학명이 다른 균주가 6균주로 전체의 61%를 차지하였다. 국내에서 수집한 구름버섯의 경우 T. versicolor, T. elegans, T. gibbosa 등 3개 속으로만 동정되었고, 미국에서 수집한 균주는 T. junipericola로 동정되었다. Trametes spp의 RAPD 분석을 통한 유전적인 다형성 조사에서 T.
- versicolor와 아주 가까운 유연관계를 보였지만, TM17은 이들 보다는 약간 먼 유연관계를 보였다. 그리고 TM07과 TM10 균주는 T. gibbosa, TM05 균주는 T. elegans와 매우 가까운 유연관계를 나타내었고, TM15 균주는 T. suaveolens과 같은 그룹에 속하며 유연관계도 가까운 것으로 분석되었다. 또한 여러 Trametes 종들 간의 유사도 와 evolutionary distance는 Table 3에서 나타내었으며, 결과는 유전적인 유연관계분석과 유사한 경향을 보였다.
- 또한 T. elegans 그룹의 TM15는 T. versicolor 그룹 인 TM01 등 6균주와는 97∼98%의 비교적은 높은 상동성을 보였지만, TM17균주와는 92%의 낮은 상동성을 보였다.
- HQ901177∼HQ901194). 보존균주 목록과 염기서열 분석을 통한 동정결과에서 종이 다른 균주가 5균주, 학명이 완전히 다른 균주가 6균주로 전체의 61%를 차지하였다. 국내에서 수집한 구름버섯의 경우 T.
- 보존중인 구름버섯속 균주를 선발하여 배양 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정한 결과 보존시 균주의 학명과 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다. rDNA의 ITS 영역의 염기서열을 바탕으로 보존 당시 동정된 결과와 염기서열 분석을 통한 결과를 비교한 결과 종이 다른 균주가 5균주와 학명이 다른 균주가 6균주로 전체의 61%를 차지하였다.
- 3). 분석결과 T. vericolor, T. junipericola, T. gibbosa, T. elegans 등 4개의 분류군으로 이루어졌으며, TM01 등 6 균주는 T. versicolor와 아주 가까운 유연관계를 보였지만, TM17은 이들 보다는 약간 먼 유연관계를 보였다. 그리고 TM07과 TM10 균주는 T.
- 2와 같다. 분석결과 T. versicolor와 T. gibbosa는 아주 다른 밴드 패턴을 보였다. TM02 등 6 균주는 보존목록에서는 Trametes로 분류되어 있으나, 염기서 열에 의한 상동성 조사 결과 완전히 다른 genus로 밝혀졌으며, RAPD의 밴드 패턴도 Trametes와는 완전히 다른 양상을 보였다.
- 곰팡이류의 ITS 부위는 17S와 25S 사이에 존재하며, 이 부위의 염기서열 분석 자료는 mt-DNA등과 함께 최근 균류의 계통분류에 널리 사용되고 있으며(박 등, 1999; Kim 등, 2001), 현재까지의 보고로는 종간뿐만 아니라 종내에서도 많은 변이를 갖는 것으로 알려져 있다(Mitchel 등, 1995). 실험에 사용한 균주들의 계통분석을 하기위하여 ITS 1과 ITS 4 프라이머를 이용하여 rDNA의 ITS 영역을 증폭한 결과 600~700 bp 정도의 증폭 산물을 얻었다. 이들 염기서열을 바탕으로 GenBank에 상동성을 조사하였고, 유전자의 염기서열은 GenBank Database에 등록하였다(Accession no.
- 유관버섯속 등 31속 50종 97균주에 대해서 온도, pH, 배지종류 등에 따른 배양적 특성과 균사의 생육모양, 균총의 색깔 등을 조사하여 속별로 완전히 다른 특성을 가지는 균주에 대해서는 오염으로 간주하고 실험에서 제외 시켰다(자료생략). 이들 실험 균주 중 구름버섯속 균주를 선발하여 배양적 및 형태적 특성을 조사하여 비슷한 균주별로 그룹화한 다음 rDNA의 ITS 영역을 증폭하여 염기서열을 결정한 결과 보존균주의 학명과 많은 차이를 보였으며, 균사의 모양 및 색깔에도 많은 차이를 보였다(Fig. 1). 이와 같이 수집 당시 정확한 동정을 통하여 균주를 분리하여 보존하지 않았을 경우 균주의 생육, 형태 및 색깔 등 통하여 같은 종으로 분류하는 것은 어렵다고 생각된다.
후속연구
- versicolor 그룹 인 TM01 등 6균주와는 97∼98%의 비교적은 높은 상동성을 보였지만, TM17균주와는 92%의 낮은 상동성을 보였다. 따라서 TM17의 경우 T. versicolor와 같은 그룹에 포함되었지만, 같은 그룹에 속한 TM01 등 6균주와는 93%의 낮은 상동성을 보였으므로, T. versicolor로 동정하기 위해서는 다양한 유전자 분석을 통한 보다 정확한 동정이 이루어져야 할 것으로 판단된다. Lee 등(2005)은 강원도지역에서 채집하여 분리한 T.
- vericolor 등 4개의 분류군으로 나누어졌으며, ITS부위 유전자수준의 상동성 비교에서도 비슷한 경향을 보였다. 따라서 기존 목록과 완전히 다른 속으로 동정된 균주들에 대해서는 계통분류학적인 유연관계 분석과 보존중인 자실체 유전자와의 상동성을 비교하여 보존진균의 오염 여부를 판단하여 기존 목록의 학명을 재분류해야 할 것으로 판단된다.
- 또한 같은 종내에서 분포지역에 따라 상이한 밴드 패턴을 보였다. 따라서 이들에 대해서는 보존균주의 오염여부와 자실체 유전자와의 상동성에 대한 검토가 필요 할 것으로 생각된다.
- junipericola로 동정되었다(Table 2). 이와 같이 보존 목록과 완전히 다른 genus로 나타난 균주들에 대해서는 계통분류학적인 유연관계 분석과 보존중인 자실체 유전자와의 상동성을 비교하여 보존진균의 오염 여부를 판단하여 기존 목록의 학명을 재분류해야 할 것으로 판단된다.
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