내염성 국화 형질전환 계통 육성 및 저항성 검정과 세포특성 변화 Development of salt-tolerant transgenic chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum) lines and bio-assay with a change of cell specificity원문보기
최근 시설재배의 증가나 새만금 간척지의 개발 등 염류 농도가 높은 토양에서의 작물 재배에 대한 수요가 점차적으로 증가하고 있는 상황에서 고염환경 하에서 세포내로 주입된 염 분자를 제한된 구역으로 격리하여 염류내성을 주도록 하는 anti-porter 유전자 TANHX, HVNHX를 우리나라 주요 화훼작물이며 수출유망 작물인 국화로 도입하는 분자육종이 백마 등 5품종에 대하여 이루어졌다. 선발 마커를 이용한 배지선발 과정을 통하여 선발된 기내 식물체 390개체를 대상으로 토양 순화를 거쳐 284계통의 국화 형질전환체가 획득되었으며, 얻어진 식물체 중 임의로 40계통을 선발하고 PCR을 거쳐 진성 여부를 확인한 결과 30계통에서 target band가 검출되어 75%의 배지 발 성공률을 나타내었다. PCR 분석 선발 계통을 포함하여 토양 순화된 284계통을 대상으로 직접적으로 NaCl 0.2 ~ 1.2% (300 mM) 범위로 내염성 생물검정을 실시한 결과 NaCl 0.8% (200 mM) 농도에서도 생존 및 생장이 가능한 15계통이 선발되었으며 이중 7계통은 NaCl 1.2%(300 mM) 내에서도 생존이 가능하였다. 내염성 특성형질 도입을 위하여 anti-porter 유전자 HVNHX가 도입되어 선발된 형질전환 계통의 스트레스 저항성 정도 및 세포 형태적 특성변화가 관찰되었다. 선발된 계통은 NaCl 1.2% (300 mM) 처리 생존가능 7계통을 포함하여 NaCl 0.8% (200 mM) 관수 처리 하에서 생존 및 생장이 가능한 15계통이었다. 세포형태 특성은 전자현미경 (SEM)을 이용하여 형질전환체 및 비 형질전환체의 공변세포를 염 처리 후 관찰함으로서 이루어졌는데 형질전환체, 비형질전환체 모두 무처리에 비해 NaCl 처리한 식물체의 공변세포의 두께가 두꺼워지고 조직 치밀도가 증가하였으며 형질전환체의 경우 비 형질전환체에 비해 두꺼워지는 정도나 조직의 치밀도 증가 정도가 높아 염에 대한 내성이 강화되었음을 알 수 있었고 염 처리 후 세포의 생존정도 비교를 통한 내염 스트레스에 대한 저항성 정도를 측정하고자 TTC 검정을 실시한 결과 강 내염성 계통의 TTC 수치가 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 TTC 수치가 낮아지는 경향이었으나 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서도 0.206 ~ 0.331로 비형질전환체의 0.046 중내염성 계통의 0.114 ~ 0.193에 비해 높은 세포생존 비율을 나타내었다. 또한 식물이 스트레스에 대항하기 위하여 분비하는 아미노산인 Proline의 함량을 계통별로 측정한 결과 강 내염성 형질전환 계통이 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 나타내어 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서 2.255 ~ 2.638 mg/kg로 중 내염성 형질전환 계통의 1.496 ~ 2.125에 비해 높게 형성되었다.
최근 시설재배의 증가나 새만금 간척지의 개발 등 염류 농도가 높은 토양에서의 작물 재배에 대한 수요가 점차적으로 증가하고 있는 상황에서 고염환경 하에서 세포내로 주입된 염 분자를 제한된 구역으로 격리하여 염류내성을 주도록 하는 anti-porter 유전자 TANHX, HVNHX를 우리나라 주요 화훼작물이며 수출유망 작물인 국화로 도입하는 분자육종이 백마 등 5품종에 대하여 이루어졌다. 선발 마커를 이용한 배지선발 과정을 통하여 선발된 기내 식물체 390개체를 대상으로 토양 순화를 거쳐 284계통의 국화 형질전환체가 획득되었으며, 얻어진 식물체 중 임의로 40계통을 선발하고 PCR을 거쳐 진성 여부를 확인한 결과 30계통에서 target band가 검출되어 75%의 배지 발 성공률을 나타내었다. PCR 분석 선발 계통을 포함하여 토양 순화된 284계통을 대상으로 직접적으로 NaCl 0.2 ~ 1.2% (300 mM) 범위로 내염성 생물검정을 실시한 결과 NaCl 0.8% (200 mM) 농도에서도 생존 및 생장이 가능한 15계통이 선발되었으며 이중 7계통은 NaCl 1.2%(300 mM) 내에서도 생존이 가능하였다. 내염성 특성형질 도입을 위하여 anti-porter 유전자 HVNHX가 도입되어 선발된 형질전환 계통의 스트레스 저항성 정도 및 세포 형태적 특성변화가 관찰되었다. 선발된 계통은 NaCl 1.2% (300 mM) 처리 생존가능 7계통을 포함하여 NaCl 0.8% (200 mM) 관수 처리 하에서 생존 및 생장이 가능한 15계통이었다. 세포형태 특성은 전자현미경 (SEM)을 이용하여 형질전환체 및 비 형질전환체의 공변세포를 염 처리 후 관찰함으로서 이루어졌는데 형질전환체, 비형질전환체 모두 무처리에 비해 NaCl 처리한 식물체의 공변세포의 두께가 두꺼워지고 조직 치밀도가 증가하였으며 형질전환체의 경우 비 형질전환체에 비해 두꺼워지는 정도나 조직의 치밀도 증가 정도가 높아 염에 대한 내성이 강화되었음을 알 수 있었고 염 처리 후 세포의 생존정도 비교를 통한 내염 스트레스에 대한 저항성 정도를 측정하고자 TTC 검정을 실시한 결과 강 내염성 계통의 TTC 수치가 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 TTC 수치가 낮아지는 경향이었으나 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서도 0.206 ~ 0.331로 비형질전환체의 0.046 중내염성 계통의 0.114 ~ 0.193에 비해 높은 세포생존 비율을 나타내었다. 또한 식물이 스트레스에 대항하기 위하여 분비하는 아미노산인 Proline의 함량을 계통별로 측정한 결과 강 내염성 형질전환 계통이 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 나타내어 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서 2.255 ~ 2.638 mg/kg로 중 내염성 형질전환 계통의 1.496 ~ 2.125에 비해 높게 형성되었다.
Recently the increasing of vinyl and green houses and development of reclaimed land including Saemangeum induced the need for breeding salt-tolerant crops which can survive and grow in high salinity soil. So we try to develop salt-tolerant transgenic chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum.) lines ...
Recently the increasing of vinyl and green houses and development of reclaimed land including Saemangeum induced the need for breeding salt-tolerant crops which can survive and grow in high salinity soil. So we try to develop salt-tolerant transgenic chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum.) lines by using anti-porter gene TANHX and HVNHX. Through marker selection and plant regeneration step, we could get 284 putative transgenic chrysanthemum lines. On selected putative transgenic plants, 40 candidates were used for genetic analysis and 30 lines could be made up of target size band on PCR, so about 75% of marker selected lines were decided as real transgenic lines. Selected 284 transgenic lines were also used for salt-tolerance test as a range of NaCl 0.2 ~ 1.2% (300 mM). As a result of salt-tolerance test, 15 selected transgenic lines could live and grow on the continuous supply of 0.8% (200 mM) NaCl solution and another 7 lines were could survive under 1.2% (300 mM) NaCl solution. This salt-tolerant transgenic lines under salt stress also lead a cell alternation especially a guard cell. A stressed guard cell be swelled and grow larger in proportion to NaCl concentration. TTC test for cell viability on transgenic chrysanthemum lines pointed out that more strong salt-tolerant lines can be live more than another under same salt stress. The numerical value of strong salt-tolerant 7 transgenic lines were 0.206 ~ 0.331 under 1.2% NaCl stress, and then it's value is more larger than middle salinity lines' 0.114 ~ 0.193 and non-transgenic's 0.046. And the proline contents as indicated stress compound also pointed out that HVNHX introduced salt-tolerant transgenic lines were less stressed than other under same salt stress. The contents of strong salt-tolerant transgenic lines were 2.255 ~ 2.638 mg/kg and it is much higher than that of middle salinity lines' 1.496 ~ 2.125.
Recently the increasing of vinyl and green houses and development of reclaimed land including Saemangeum induced the need for breeding salt-tolerant crops which can survive and grow in high salinity soil. So we try to develop salt-tolerant transgenic chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum.) lines by using anti-porter gene TANHX and HVNHX. Through marker selection and plant regeneration step, we could get 284 putative transgenic chrysanthemum lines. On selected putative transgenic plants, 40 candidates were used for genetic analysis and 30 lines could be made up of target size band on PCR, so about 75% of marker selected lines were decided as real transgenic lines. Selected 284 transgenic lines were also used for salt-tolerance test as a range of NaCl 0.2 ~ 1.2% (300 mM). As a result of salt-tolerance test, 15 selected transgenic lines could live and grow on the continuous supply of 0.8% (200 mM) NaCl solution and another 7 lines were could survive under 1.2% (300 mM) NaCl solution. This salt-tolerant transgenic lines under salt stress also lead a cell alternation especially a guard cell. A stressed guard cell be swelled and grow larger in proportion to NaCl concentration. TTC test for cell viability on transgenic chrysanthemum lines pointed out that more strong salt-tolerant lines can be live more than another under same salt stress. The numerical value of strong salt-tolerant 7 transgenic lines were 0.206 ~ 0.331 under 1.2% NaCl stress, and then it's value is more larger than middle salinity lines' 0.114 ~ 0.193 and non-transgenic's 0.046. And the proline contents as indicated stress compound also pointed out that HVNHX introduced salt-tolerant transgenic lines were less stressed than other under same salt stress. The contents of strong salt-tolerant transgenic lines were 2.255 ~ 2.638 mg/kg and it is much higher than that of middle salinity lines' 1.496 ~ 2.125.
5가 될 때까지 48시간 동안 배양한 후 MM과 IM 배지로 옮겨 각각 24시간 동안 배양하여 활성화 시킨 후 acetosyringone이 첨가된 활성배지로 계대하여 6시간 동안 배양한 용액을 1/30 으로 희석시켜 멸균된 흡지에 도포하고 형질전환 대상 재료인 국화의 줄기, 잎과 72시간 동안 공동 배양하여 형질전환 하였다. particle bombardment 방법은 유전자를 담은 vector를 추출 분리하여 1.0 ㎛ 직경의 gold particle에 coating한 후 target 거리 9 cm에서 helium 가스 압력 1,100 psi로 분사하여 형질전환 하였다 (Table 1). 형질전환체의 선발은 1차적으로 Kanamycin 50 mg/L를 선발마커로 하여 캘러스 상태에서 이루어 졌으며 선발된 캘러스로부터 식물체를 재분화하여 기내 및 토양순화 시킨 후 잎을 채취하여 Plant DNA preparation kit (Corebio co.
내염성 유전자 도입 형질전환 개체의 선발 기간을 단축시키고 선발의 효율성을 높이기 위해서 형질전환 대상개체에 대한 실내검정을 실시하였다. 검정은 크게 형질전환체의 잎을 NaCl 수용액에 침전시키고 갈변 정도를 관찰 상대적 고사정도를 측정하는 Leaf salt-tolerance test와 식물체 전초를 NaCl 수용액에 담그고 식물 상태를 관찰하는 NaCl solution soaking test를 동시에 실시하였다.
국화 형질전환은 Agrobacterium-mediated 형질전환과 (Cough and Bent 1988; Sasidaharanpillai et al. 2004) particle bombardment 방법이 (Tan et al. 2005) 동시에 사용되었는데 Agrobacterium-mediated 형질전환은 TANHX-LBA4404, HVNHXLBA4404를 YEP 배지에서 O.D.620=0.5가 될 때까지 48시간 동안 배양한 후 MM과 IM 배지로 옮겨 각각 24시간 동안 배양하여 활성화 시킨 후 acetosyringone이 첨가된 활성배지로 계대하여 6시간 동안 배양한 용액을 1/30 으로 희석시켜 멸균된 흡지에 도포하고 형질전환 대상 재료인 국화의 줄기, 잎과 72시간 동안 공동 배양하여 형질전환 하였다. particle bombardment 방법은 유전자를 담은 vector를 추출 분리하여 1.
국화의 형질전환 식물체 배양은 3%의 sucrose가 포함된 MS salt 배지에서 2,4-D 1.0 mg/L 생장조정제가 함유되고 300 ㎎/L의 cefotaxime과 50 mg/L의 kanamycin이 포함된 선발배지 상에서 Agrobacterium tumefaciens에 의해서 형질전환된 개체가 분화되어 callus가 형성될 수 있도록 유도하였는데 선발 마커를 통하여 분화된 캘러스가 형성된 후에는 3%의 sucrose가 포함된 MS salt배지 (Murashige and Skoog 1962)와 1.0 ㎎/L naphthalene acetic acid와 1.0 ㎎/L benzyl-adenine이 함유되고 300 ㎎/L의 cefotaxime과 50 ㎎/L 의 kanamycin이 포함된 국화 형질전환식물체 재분화 배지로 분열하고 있는 캘러스를 계대하여 shoot를 유기시키고 shoot가 유기된 식물체를 생장조절제 무 첨가 MS 배지로 전환하여 발근시킨 다음 토양 순화를 실시하여 만들어진 식물체를 대상으로 유전분석을 실시하였다.
내염성 유전자 도입 형질전환 개체의 선발 기간을 단축시키고 선발의 효율성을 높이기 위해서 형질전환 대상개체에 대한 실내검정을 실시하였다. 검정은 크게 형질전환체의 잎을 NaCl 수용액에 침전시키고 갈변 정도를 관찰 상대적 고사정도를 측정하는 Leaf salt-tolerance test와 식물체 전초를 NaCl 수용액에 담그고 식물 상태를 관찰하는 NaCl solution soaking test를 동시에 실시하였다.
잎, 뿌리 등 식물체 부위 중 가장 높은 proline 함량 변화를 나타낸 줄기를 대상으로 하였으며 분석기기는 분광광도계 SHIMADZU UV-Visible 1650 PC를 사용하였다. 분석방법은 줄기 1 g을 액체질소로 마쇄하고, Nin hydrin과 acetic acid 혼합용액 2 ml로 30분간 끓인 후 toluene 2 ml를 첨가하여 520 nm 파장에서 분광광도계로 측정하였다.
살아있는 세포를 검경 확인하기 위하여 분광광도계 SHIMADZU UV-Visible 1650 PC를 이용하여 TTC 검정을 실시하였다. 우선 직경 7 mm Leaf disc 2개를 만들고 0.
샘플은 스트레스 처리가 완료된 잎을 채취하여 0.4×0.4 cm로 절단한 후 2% aldehyde 용액에 2시간 전고정 한 후 phosphate buffer로 20분씩 3회 수세한 다음 2% osmium tetraoxide로 2시간 후고정하여 phosphate buffer로 20분씩 3회 수세한 시료를 에탄올 (50, 70, 80, 90, 95, 100%)로 탈수하였다.
형질전환 계통의 내염성 향상 정도를 확인하기 위하여 내염성 생물검정을 실시하였다. 생물검정은 크게 실내검정과 실외검정으로 구분하여 실시하였는데 실내검정은 다시 형질전환체의 잎을 대상으로 1.2% NaCl 수용액에 침지시킨 후 세포 고사 정도를 관찰하는 Leaf salt-tolerance test와 (Lim et al. 2007) 형질전환 식물체를 1.2% NaCl 수용액이 들어있는 플라스크에 침지시키고 상대적인 활력도를 비교하는 NaCl solution soaking test로 구분하여 실시하였다. 실외검정은 기내에 있는 형질전환 식물체를 4주간에 걸쳐 Jiffy 7 포트에 토양 순화시킨 후 NaCl 수용액을 0.
순화된 계통들 중 40개체를 우선적으로 선발하여 PCR 검정을 실시하여 유전자 도입여부를 확인하였다. PCR 분석 결과 30계통에서 2,500 base pair 길이의 target band가 확인되어 75%의 배지 선발 성공률이 확인되었다 (Fig.
2% NaCl 수용액이 들어있는 플라스크에 침지시키고 상대적인 활력도를 비교하는 NaCl solution soaking test로 구분하여 실시하였다. 실외검정은 기내에 있는 형질전환 식물체를 4주간에 걸쳐 Jiffy 7 포트에 토양 순화시킨 후 NaCl 수용액을 0.2 (50 mM) ~ 1.2% (300 mM) 농도로 48시간 주기로 50 ml 씩 8주간 저면 관수하여 염에 대한 내성 향상 정도를 관찰하였으며 염액 관수 제거 후 회복여부를 관찰하기 위하여 2주간 무염수를 공급하면서 잎의 위조회복 및 식물체 분화 재생 여부를 관찰하였다.
염처리에 의한 식물체의 특성변화를 세포 수준에서 해석하고자 전자현미경을 2,000배 수준으로 하여 염농도 처리별 형질전환체와 비형질전환체의 기공구조 변화를 관찰하였다. 대체적으로 염 처리 농도가 증가할수록 공변 세포가 비후화 되는 특성이 나타났는데 세포내 수분 손실 억제와 구조강화에 의한 세포 파괴를 최소화하기 위한 방어적 현상으로 추정하고 있으며 비후화 정도를 비교해 볼 때 형질전환 식물체의 비후화 정도가 비형질전환체에 비해 강하게 나타나 염에 대한 내성이 강화된 원인이 세포조직의 치밀도 증가와 일정정도 연계되어 있음을 확인할 수 있었다 (Fig.
미생물 및 벼에서의 유전자 기능 확인을 통하여 생물체 내에서 유효하게 작용할 수 있음이 확인되었다. 이에 anti-porter 유전자인 TANHX, HVNHX 유전자를 국화에 도입하고 도입된 유전자의 기능 확인 및 이에 따른 생물검정을 통하여 내염성향상정도를 구명하는 시험을 실시하였다.
분석대상은 줄기. 잎, 뿌리 등 식물체 부위 중 가장 높은 proline 함량 변화를 나타낸 줄기를 대상으로 하였으며 분석기기는 분광광도계 SHIMADZU UV-Visible 1650 PC를 사용하였다. 분석방법은 줄기 1 g을 액체질소로 마쇄하고, Nin hydrin과 acetic acid 혼합용액 2 ml로 30분간 끓인 후 toluene 2 ml를 첨가하여 520 nm 파장에서 분광광도계로 측정하였다.
재해에 대한 저항성 축적물질인 proline 함량을 측정하여 세포내 저항성 증진 정도를 비교하였다. 분석대상은 줄기.
4 cm로 절단한 후 2% aldehyde 용액에 2시간 전고정 한 후 phosphate buffer로 20분씩 3회 수세한 다음 2% osmium tetraoxide로 2시간 후고정하여 phosphate buffer로 20분씩 3회 수세한 시료를 에탄올 (50, 70, 80, 90, 95, 100%)로 탈수하였다. 탈수된 시료는 100% isoamyl acetate에 치환시켜 critical point dryer로 임계 건조시키고 gold coating 한 후 주사전자현미경 (SEM : JSM-5410LV)으로 관찰하였다.
형질전환 계통의 내염성 향상 정도를 확인하기 위하여 내염성 생물검정을 실시하였다. 생물검정은 크게 실내검정과 실외검정으로 구분하여 실시하였는데 실내검정은 다시 형질전환체의 잎을 대상으로 1.
0 ㎛ 직경의 gold particle에 coating한 후 target 거리 9 cm에서 helium 가스 압력 1,100 psi로 분사하여 형질전환 하였다 (Table 1). 형질전환체의 선발은 1차적으로 Kanamycin 50 mg/L를 선발마커로 하여 캘러스 상태에서 이루어 졌으며 선발된 캘러스로부터 식물체를 재분화하여 기내 및 토양순화 시킨 후 잎을 채취하여 Plant DNA preparation kit (Corebio co.)를 이용하여 genomic DNA를 분리한 후 PCR을 통하여 형질전환 식물체를 확인하였다.
대상 데이터
시장성과 사용목적 그리고 조직배양과 형질전환 효율성 등을 고려하여 대상재료를 선택 하였는데 standard type의 Paekma, Shuho-no-chikara, Zinba 그리고 spray type인 Pinkpride 와 Puma 등 5품종이 형질전환 대상재료로 사용되었다.
2007). 시험에 사용된 내염성 유전자 TANHX, HVNHX (Na/H+ antiporter)는 전북대학교 윤성중 교수팀이 개발한 유전자로 세포내에 축적된 염 이온 등을 능동수송으로 세포 밖으로 배출시키는 기작을 가지고 있는 것으로 확인되었으며 (Nase et al. 1997; Apse et al. 1999; Hamada et al. 2001; Zhang et al. 2001; Otha et al. 2002; Shi and Zhu 2002; Tian et al. 2006). 미생물 및 벼에서의 유전자 기능 확인을 통하여 생물체 내에서 유효하게 작용할 수 있음이 확인되었다.
실험에 사용한 TANHX, HVNHX (Na/H+ antiporter) 유전자는 내염성 기능을 강화시키는 유전자로 (Nase et al. 1997; Apse et al. 1999; Hamada et al. 2001; Zhang et al. 2001; Otha et al. 2002; Shi and Zhu 2002; Tian et al. 2006). 전북대학교 윤성중 교수팀이 개발한 유전자를 분양받아 사용하였으며 식물형질전환 vector인 pGA 643에 연결 35S promoter에 의하여 식물에서 발현이 가능하며 kanamycin 유전자에 의하여 선발이 가능하도록 조작되었다.
또한 HVNHX 유전자를 백마 (Paekma) 등 4품종에 형질 전환 시킨 결과 백마 (Paekma) 품종에서 160개의 선발 마커 저항성 캘러스와 48계통의 재분화 형질전환 식물체가 선발되었으며 수방력 (Shuho-no-chikara)은 284개체와 68계통 신마 (Zinba)는 286개체와 80계통 그리고 퓨마 (Puma) 품종에서는 각각 420개체의 저항성 캘러스와 124계통의 식물체가 재분화 선발되었다 (Table 2). 이렇게 기내 재분화한 식물체를 기내 순화 과정과 토양 순화과정을 거친 결과 최종적으로 284개체의 형질전환체가 외부 순화되어 유전분석과 생물검정의 재료로 사용되었다 (Fig. 1).
2006). 전북대학교 윤성중 교수팀이 개발한 유전자를 분양받아 사용하였으며 식물형질전환 vector인 pGA 643에 연결 35S promoter에 의하여 식물에서 발현이 가능하며 kanamycin 유전자에 의하여 선발이 가능하도록 조작되었다. 작성된 유전자 cassette는 Agrobacterium tumefaciens LBA4404 strain에 형질전환하여 식물체 형질전환에 사용하였다.
최근 시설재배의 증가나 새만금 간척지의 개발 등 염류 농도가 높은 토양에서의 작물 재배에 대한 수요가 점차적으로 증가하고 있는 상황에서 고염환경 하에서 세포내로 주입된 염 분자를 제한된 구역으로 격리하여 염류내성을 주도록 하는 anti-porter 유전자 TANHX, HVNHX를 우리나라 주요 화훼작물이며 수출유망 작물인 국화로 도입하는 분자육종이 백마 등 5품종에 대하여 이루어졌다. 선발 마커를 이용한 배지선발 과정을 통하여 선발된 기내 식물체 390개체를 대상으로 토양 순화를 거쳐 284계통의 국화 형질전환체가 획득되었으며, 얻어진 식물체 중 임의로 40계통을 선발하고 PCR을 거쳐 진성 여부를 확인한 결과 30계통에서 target band가 검출되어 75%의 배지 선발 성공률을 나타내었다.
이론/모형
전자현미경은 JEOL, SEM-5410-LV 모델을 사용하여 세포의 기공특성 등 식물체의 표층 형태 변화를 관찰하였다. 샘플은 스트레스 처리가 완료된 잎을 채취하여 0.
성능/효과
국화 형질전환은 Table 1과 같이 시행하였다. Agrobacteriummediated 형질전환과 particle bombardment법을 사용하여 형질전환 하고 형질전환 선발 마커인 kanamycin 50 mg/L로 첨가한 선발배지에서 형질전환된 캘러스를 분리한 결과 TANHX 유전자를 도입한 국화 수방력 (Shuho-no-chikara)과 핑크프라이드 (Pinkpride) 품종에서 각각 128개체와 67개체의 선발 마커 저항성 캘러스가 분리되었으며 이 캘러스를 재분화 배지로 치상하여 식물체로 분화시킨 결과 각각 48개와 22개의 완전한 형질전환 개체가 분리되었다.
순화된 계통들 중 40개체를 우선적으로 선발하여 PCR 검정을 실시하여 유전자 도입여부를 확인하였다. PCR 분석 결과 30계통에서 2,500 base pair 길이의 target band가 확인되어 75%의 배지 선발 성공률이 확인되었다 (Fig. 2).
선발 마커를 이용한 배지선발 과정을 통하여 선발된 기내 식물체 390개체를 대상으로 토양 순화를 거쳐 284계통의 국화 형질전환체가 획득되었으며, 얻어진 식물체 중 임의로 40계통을 선발하고 PCR을 거쳐 진성 여부를 확인한 결과 30계통에서 target band가 검출되어 75%의 배지 선발 성공률을 나타내었다. PCR 분석 선발 계통을 포함하여 토양 순화된 284계통을 대상으로 직접적으로 NaCl 0.2 ~ 1.2% (300 mM) 범위로 내염성 생물검정을 실시한결과 NaCl 0.8% (200 mM) 농도에서도 생존 및 생장이 가능한 15계통이 선발되었으며 이중 7계통은 NaCl 1.2% (300 mM) 내에서도 생존이 가능하였다. 내염성 특성형질 도입을 위하여 anti-porter 유전자 HVNHX가 도입되어 선발된 형질전환 계통의 스트레스 저항성 정도 및 세포 형태적 특성변화가 관찰되었다.
검정 결과 비형질전환체에 비해 형질전환 식물체의 잎은 NaCl 1.2% 수용액에 침지한지 4주 후에도 거의 고사되지 않고 원형 상태를 유지하고 있어 내염성 기작이 세포 수준에서 이루어지고 있음이 확인되었고 식물체 전초를 1.2% NaCl 수용액에 침지시킨 상태에서 고사에 까지 이르는 기간도 비형질전환체의 26일에 비하여 48 ~ 56일로 최대 2.2배까지 연장되었다. 또한 식물체 뿌리 발달이나 세포고사를 관찰한 결과 비 형질전환체에 비해 고사 정도가 낮고 활발하게 성장하는 특성을 보여 염에 대한내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다 (Fig.
특히 국화는 로열티 문제 등으로 신품종의 육성이 매우 절실하나 주요 육종 방식이 교배에 의존하고 있어 품종 육성의 한계를 극복하지 못하고 있는 실정인데 최근 전통적인 작물 육종방법을 보완, 발전시키기 위하여 형질전환기술이 활발히 이용되고 있다. 그 결과 유전자변형농산물 (LMO)의 상업화와 재배면적이 급속히 증가하고 있으며 세계적으로 22개국이 LMO의 재배를 승인하였고 LMO 종자의 종자시장 점유율은 22%에 달하고 있다. 식량작물의 경우는 LMO에 대한 소비자의 선호도가 낮은 단점이 있으나 화훼 작물은 LMO에 대한 소비자의 거부감이 낮아 실용화가 용이한 장점도 가지고 있다.
염처리에 의한 식물체의 특성변화를 세포 수준에서 해석하고자 전자현미경을 2,000배 수준으로 하여 염농도 처리별 형질전환체와 비형질전환체의 기공구조 변화를 관찰하였다. 대체적으로 염 처리 농도가 증가할수록 공변 세포가 비후화 되는 특성이 나타났는데 세포내 수분 손실 억제와 구조강화에 의한 세포 파괴를 최소화하기 위한 방어적 현상으로 추정하고 있으며 비후화 정도를 비교해 볼 때 형질전환 식물체의 비후화 정도가 비형질전환체에 비해 강하게 나타나 염에 대한 내성이 강화된 원인이 세포조직의 치밀도 증가와 일정정도 연계되어 있음을 확인할 수 있었다 (Fig. 6).
또한 HVNHX 유전자를 백마 (Paekma) 등 4품종에 형질 전환 시킨 결과 백마 (Paekma) 품종에서 160개의 선발 마커 저항성 캘러스와 48계통의 재분화 형질전환 식물체가 선발되었으며 수방력 (Shuho-no-chikara)은 284개체와 68계통 신마 (Zinba)는 286개체와 80계통 그리고 퓨마 (Puma) 품종에서는 각각 420개체의 저항성 캘러스와 124계통의 식물체가 재분화 선발되었다 (Table 2). 이렇게 기내 재분화한 식물체를 기내 순화 과정과 토양 순화과정을 거친 결과 최종적으로 284개체의 형질전환체가 외부 순화되어 유전분석과 생물검정의 재료로 사용되었다 (Fig.
193에 비해 높은 세포생존 비율을 나타내었다. 또한 식물이 스트레스에 대항하기 위하여 분비하는 아미노산인 Proline의 함량을 계통별로 측정한 결과 강 내염성 형질전환 계통이 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 나타내어 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서 2.255 ~ 2.638 mg/kg로 중 내염성 형질전환 계통의 1.496 ~ 2.125에 비해 높게 형성되었다.
2배까지 연장되었다. 또한 식물체 뿌리 발달이나 세포고사를 관찰한 결과 비 형질전환체에 비해 고사 정도가 낮고 활발하게 성장하는 특성을 보여 염에 대한내성이 증가하였음을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).
2006). 미생물 및 벼에서의 유전자 기능 확인을 통하여 생물체 내에서 유효하게 작용할 수 있음이 확인되었다. 이에 anti-porter 유전자인 TANHX, HVNHX 유전자를 국화에 도입하고 도입된 유전자의 기능 확인 및 이에 따른 생물검정을 통하여 내염성향상정도를 구명하는 시험을 실시하였다.
최근 시설재배의 증가나 새만금 간척지의 개발 등 염류 농도가 높은 토양에서의 작물 재배에 대한 수요가 점차적으로 증가하고 있는 상황에서 고염환경 하에서 세포내로 주입된 염 분자를 제한된 구역으로 격리하여 염류내성을 주도록 하는 anti-porter 유전자 TANHX, HVNHX를 우리나라 주요 화훼작물이며 수출유망 작물인 국화로 도입하는 분자육종이 백마 등 5품종에 대하여 이루어졌다. 선발 마커를 이용한 배지선발 과정을 통하여 선발된 기내 식물체 390개체를 대상으로 토양 순화를 거쳐 284계통의 국화 형질전환체가 획득되었으며, 얻어진 식물체 중 임의로 40계통을 선발하고 PCR을 거쳐 진성 여부를 확인한 결과 30계통에서 target band가 검출되어 75%의 배지 선발 성공률을 나타내었다. PCR 분석 선발 계통을 포함하여 토양 순화된 284계통을 대상으로 직접적으로 NaCl 0.
8% (200 mM) 관수 처리 하에서 생존 및 생장이 가능한 15계통이었다. 세포형태 특성은 전자현미경 (SEM)을 이용하여 형질전환체 및 비 형질전환체의 공변세포를 염 처리 후 관찰함으로서 이루어졌는데 형질전환체, 비형질전환체 모두 무처리에 비해 NaCl 처리한 식물체의 공변세포의 두께가 두꺼워지고 조직 치밀도가 증가하였으며 형질전환체의 경우 비 형질전환체에 비해 두꺼워지는 정도나 조직의 치밀도 증가 정도가 높아 염에 대한 내성이 강화되었음을 알 수 있었고 염 처리 후 세포의 생존정도 비교를 통한 내염 스트레스에 대한 저항성 정도를 측정하고자 TTC 검정을 실시한 결과 강 내염성 계통의 TTC 수치가 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 TTC 수치가 낮아지는 경향이었으나 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서도 0.206 ~ 0.331로 비형질전환체의 0.046 중내염성 계통의 0.114 ~ 0.193에 비해 높은 세포생존 비율을 나타내었다. 또한 식물이 스트레스에 대항하기 위하여 분비하는 아미노산인 Proline의 함량을 계통별로 측정한 결과 강 내염성 형질전환 계통이 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 나타내어 강 내염성 7계통은 1.
125에 비해 높게 형성되었다. 염 처리 후 세포의 생존정도 비교를 통한 내염 스트레스에 대한 저항성 정도를 측정하고자 TTC검정 (Iborra et al. 1992)을 실시한 결과 강 내염성 계통의 TTC 수치가 높게 나왔으며 NaCl 처리 농도가 높아질수록 TTC 수치가 낮아지는 경향이었으나 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서도 0.206 ~ 0.331로 비형질전환체의 0.046, 중 내염성 계통의 0.114 ~ 0.193에 비해 높은 세포생존 비율을 나타내었다 (Table 2).
염에 대한 내성을 보다 실질적으로 확인하기 위하여 토양 순화 과정을 거쳐 Jiffy pot에 이식된 형질전환 식물체를 대상으로 주기적으로 NaCl 수용액을 농도별로 관수한 결과 NaCl 0.8% (200 mM) 수용액을 8주간 관수한 상태에서도 생장이 가능한 중 내염성 8계통이 선발되었으며 (Fig. 4) 같은 조건에서 1.2% (300 mM) NaCl 수용액을 관수한 상태에서도 생장이 가능한 강 내염성 7계통이 또한 선발되었다 (Fig. 5).
1996; Fariba and Ali 2005) 아미노산인 proline의 함량을 형질전환체와 비 형질전환체간 비교하고 형질전환 계통별로 비교 측정한 결과는 Figure 7과 같다. 측정 결과 비 형질전환체인 control 의 Proline 함량이 상대적으로 높게 측정되었는데 이는 비형질전환 식물체의 경우 염에 대한 저항 기작이 없어서 높은 스트레스를 받고 여기에 대응하기 위하여 상대적으로 많은 양의 proline을 분비한 것으로 판단되며 형질 전환 계통 간 비교에서는 강 내염성 형질전환 계통의 proline 함량 수치가 NaCl 처리 농도가 높아질수록 증가하는 경향을 나타내어 강 내염성 7계통은 1.2% NaCl 처리에서 2.255~ 2.638 mg/g의 proline 농도로 중 내염성 형질전환 계통의 1.496 ~ 2.125에 비해 높게 형성되었다. 염 처리 후 세포의 생존정도 비교를 통한 내염 스트레스에 대한 저항성 정도를 측정하고자 TTC검정 (Iborra et al.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
국화란 무엇인가?
원예작물의 경우 재배면적 76,453 ha중 52,949 ha가 시설 재배면적에 해당되고, 반복된 비료와 농약의 투입 등으로 염류집적이 문제되고 있는 시설재배지가 급격히 증가하고 있는 상황이며 새만금 간척지의 경우 총 개발면적 28,300 ha의 30% 해당하는 8,490 ha가 농업 용지로 개발되고 이외의 산업, 관광 및 주거단지 에서도 내염성 원예작물의 수요가 지속적으로 발생될 것으로 예상되어 이에 대한 대비가 필요하다 (Boyer 1982; Ashraf 1999). 특히 국화 (Dendranthema grandiflorum Kitamura)는 재배면적 및 경제적 규모면에서의 생산액이 국내 1~2위를 기록하고 있는 중요 화훼작물이며 세계적으로도 소비량이 2위인 절화작물로서 (재배면적 : ('00) 732 → ('06) 805 ha; 생산액: ('00) 562 → ('06) 915 억원) 수요 확대를 위한 면적 증가와 국화 재배시의 현안 애로사항을 해결하고 국토의 효율적 이용을 통하여 농가의 소득과 국부의 창출을 증대 시키기 위해서 내염성을 포함한 내재해성 품종육성이 필요하다. 특히 국화는 로열티 문제 등으로 신품종의 육성이 매우 절실하나 주요 육종 방식이 교배에 의존하고 있어 품종 육성의 한계를 극복하지 못하고 있는 실정인데 최근 전통적인 작물 육종방법을 보완, 발전시키기 위하여 형질전환기술이 활발히 이용되고 있다.
형질전환기술을 이용한 LMO의 생산의 장단점은 무엇인가?
특히 국화는 로열티 문제 등으로 신품종의 육성이 매우 절실하나 주요 육종 방식이 교배에 의존하고 있어 품종 육성의 한계를 극복하지 못하고 있는 실정인데 최근 전통적인 작물 육종방법을 보완, 발전시키기 위하여 형질전환기술이 활발히 이용되고 있다. 그 결과 유전자변형농산물 (LMO)의 상업화와 재배면적이 급속히 증가하고 있으며 세계적으로 22개국이 LMO의 재배를 승인하였고 LMO 종자의 종자시장 점유율은 22%에 달하고 있다. 식량작물의 경우는 LMO에 대한 소비자의 선호도가 낮은 단점이 있으나 화훼 작물은 LMO에 대한 소비자의 거부감이 낮아 실용화가 용이한 장점도 가지고 있다. 우리나라에서는 농촌진흥청을 중심으로 많은 수의 국화 품종이 개발되어오고 있으나 재배농가의 선호도를 완전히 충족시키지 못해 시장에서 주요하게 거래되고 있는 품종의 상당수가 외국에서 육종된 품종들이 차지하고 있으며 거의 대부분의 육종방식이 교배를 바탕으로 하는 전통육종에 의존하고 있어 유전적 다양성의 한계를 쉽게 넘어서지 못하고 있는 실정이다.
내염성 작물 육성 필요성이 증가하는 이유는 무엇인가?
최근 시설재배 면적의 급격한 증가와 새만금 간척지 개발 등 내염성 작물 육성 필요성이 급격히 증가하고 있다. 원예작물의 경우 재배면적 76,453 ha중 52,949 ha가 시설 재배면적에 해당되고, 반복된 비료와 농약의 투입 등으로 염류집적이 문제되고 있는 시설재배지가 급격히 증가하고 있는 상황이며 새만금 간척지의 경우 총 개발면적 28,300 ha의 30% 해당하는 8,490 ha가 농업 용지로 개발되고 이외의 산업, 관광 및 주거단지 에서도 내염성 원예작물의 수요가 지속적으로 발생될 것으로 예상되어 이에 대한 대비가 필요하다 (Boyer 1982; Ashraf 1999).
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