[논문]스트레스에 의한 식물세포 손상에서 Biphasic Reactive Oxygen Species(ROS)와 Ethylene 생합성의 Synergism 효과

지나리; 박기영

doi:10.5010/jpb.2011.38.1.022

스트레스에 의한 식물세포 손상에서 Biphasic Reactive Oxygen Species(ROS)와 Ethylene 생합성의 Synergism 효과
Stress-induced biphasic ethylene and ROS biosynthesis are synergistically interacted in cell damage 원문보기

Journal of plant biotechnology = 식물생명공학회지, v.38 no.1, 2011년, pp.22 - 29

지나리 (순천대학교 생명산업과학대학 생물학과) , 박기영 (순천대학교 생명산업과학대학 생물학과)

초록
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비생물학적 스트레스로 $H_2O_2$를 이용하여 산화적 스트레스와 고염분 스트레스를 처리한 후 ROS의 생성을 확인한 결과 스트레스 처리 후 30분에 일시적으로 1차 peak를 형성하였다가 거의 basal level까지 감소하고 다시 증가하여 3시간에 매우 다량의 2차 peak를 형성한 후 거의 basal level로 다시 낮아지는 biphasic 양상을 나타내게 된다. 따라서 ROS의 생성은 초기 30분 내에 일시적으로 발생한 Phase I의 ROS와 Phase II의 좀 더 장기적으로 다량의 고농도로 발생된 ROS의 생리적 역할이 다를 것으로 여겨진다. 본 논문에서는 스트레스 처리 시 생성되는 ROS를 확인한 후 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체를 이용하여 실험을 수행하였다. 스트레스에 의해 생성되는 ROS의 생성을 억제시킴으로써 스트레스에 대한 ethylene 생성이 더 적은 것으로 나타났다. 또한, 이들 형질전환 식물체에서 ethylene 생성과 $H_2O_2$ 억제 효과를 확인하였으며 고염분 등의 스트레스에 대한 저항성은 ROS와 ethylene의 생성이 저하되어 나타난 것으로 판단된다. 산화적 스트레스와 고염분 스트레스에서 후기 ethylene이 다량으로 생성되는 시기, 즉 세포손상이 초래되는 후기에서 DNA fragmentation 분석을 통해서 ROS와 ethylene의 생성이 높은 식물체일수록 PCD가 높게 나타난 것으로 여겨지며, 이 과정에서 작용하는 유전자는 RbohD와 RbohF인 것으로 보이며, RbohD가 더 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다. 따라서 스트레스에 반응하는 신호전달과정에서 초기에 ROS가 생성이 되고 후기에 ethylene이 다량으로 생성되어 결국 세포죽음에 이르게 하는 상호 synergism을 일으켜 반응을 나타내며, 이러한 반응 과정에서 RbohD와 RbohF 유전자 발현의 억제가 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 높이는 것으로 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Although reactive oxygen species (ROS) are inevitable by-products of many redox reactions in eukaryotic cells, they play a crucial role as signaling molecules in many cellular processes for development and defense response to abiotic stresses. The biphasic ROS production which was peaked twice in a first transient phase and a second massive phase was occurred after treatment of abiotic stress such as oxidative stress, high salinity. This biphasic generation of ROS was followed by the biphasic production of stress hormone, ethylene. The mechanism of interactions between ROS and ethylene biosynthesis is studied in tobacco (Nicotiana tabaccum L.) plants under the abiotic stresses. The stress-induced ethylene production was significantly inhibited in RbohD-AS and RbohF-AS, in which antisense expression of NADPH oxidase genes was performed. The accumulation of ROS, which was determined by DAB and DCFH-DA staining, was significantly decreased after abiotic stresses in transgenic plants. The suppression of signaling with ethylene and ROS induced more tolerance in response to abiotic stress. The transgenic plants were more tolerant in MS medium supplemented with salinity stress in contrast with wild-type. Stress-induced cell damage determined by DNA fragmentation was decreased at phase II in those transgenic plants. Therefore, the first burst of ROS is more responsible for making a role as a signaling molecule during stress-induced response. These results suggested that ethylene and ROS act in a positive feedback cycle that results in mutual enhancement of ethylene and ROS production during stress-induced cell death.

AI 본문요약
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문제 정의

ROS는 식물세포에서 integral membrane protein인 NADPH oxidase의 작용에 의해 생성되며 (Miklós P et al.2009), 본 논문에서는 ROS 생성에 관여하는 유전자인 RbohD와 RbohF의 유전자 발현이 억제된 형질전환 식물체 (RbohD-AS, RbohF-AS)를 이용하여 스트레스 저항성에 관하여 연구하였다.
따라서 스트레스 과정에서 가장 공통적으로 작용하는 두 가지 물질인 ethylene과 ROS 관계 속에 ROS가 ethylene의 upstream에 존재할 것이라는 점에 초점을 맞추어 상호 synergism을 일으켜 저항성을 유도하며 ROS 생성에 관여하는 유전자인 RbohD와 RbohF의 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서 스트레스 저항성에 관하여 연구하고자 하였다.
이때 생성된 ethylene에 의해 다시 ROS가 3시간 정도에 생성되며 그 결과 후기에서 다량의 ethylene이 생성되었는데 이때 생성된 ethylene의 양에 따라 식물이 저항성을 나타내거나 혹은 죽게 되는 것으로 보인다. 본 연구에서는 ROS 생성에 관여하는 유전자인 RbohD와 RbohF의 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에 고염분과 산화적 스트레스 등을 처리했을 때 ROS 생성과 축적, ethylene 생성에 따른 저항성을 확인하였다. 또한 후기의 다량 생성된 ethylene의 최고치에 따른 세포사멸을 통해 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서의 cell death 감소를 확인하였다.

제안 방법

이러한 과정을 세포손상의 관점에서 확인하기 위해 스트레스 처리 후 genomic DNA를 분리하여 DNA fragmentation을 조사하였다. 20 mM H₂O₂ 처리 후 ethylene 생성은 각각 1시간과 30시간에 peak를 보이는 biphasic 양상을 나타내었는데 이 시기의 야생형 식물체의 잎 조직을 harvest하여 genomic DNA를 분리한 후 DNA fragmentation을 확인하였다 (Fig. 7A). 그 정도를 확인한 결과 phase II 시기인 30시간째에는 야생형 식물체에 비해 이들 형질전환 식물체에 DNA fragmentation의 효과가 월등하게 감소되는 것을 확인할 수 있었고 특히, RbohD-AS 형질전환 식물체에서 그 효과가 더 좋은 것을 알 수 있었다.
200 mM NaCl이 처리 된 0.5×MS agar medium에서 야생형 식물체와 형질전환 식물체를 동시에 치상하여 25℃로 유지되는 growth chamber에서 20일 동안 발아 후 디지털카메라로 촬영하였으며 root growth를 측정하였다.
와 200 mM NaCl)를 처리하여 DAB 용액에 5~8시간 동안 담군 상태로 25℃에 방치하였다. DAB이 염색된 잎 조직은 에탄올 (96%)에 10분 동안 끊인 후 cooling 시켜서 에탄올이 들어있는 상태로 실온에서 보관하면서 탈색된 잎 조직을 디지털카메라로 촬영하였다.
와 200 mM NaCl)를 처리한 후 6 ml 용기에 넣어 공기가 새지 않게 밀봉하여 1시간 동안 ethylene을 포집한 후 1 ml용 주사기로 용기 내 기체를 채취하였다. Gas chromatography를 이용하여 ethylene 양을 측정하였으며, 시료의 생중량과 용기의 부피를 이용하여 ethylene 생성량을 계산하였다.
최종적으로 얻은 genomic DNA를 정량 분석하였다. Genomic DNA를 정량 분석한 후 15 ug을 1.6% agarose gel에 5시간 동안 전기영동 (45V/gel cm) 한 후 EtBr 염색을 하여 UV상에서 DNA fragmentation의 변화를 확인하였다.
RbohD cDNA and RbohF cDNA were separately inserted into each the HindIII, XhoI or EcoRI sites of pGA748 in the reverse direction. The constructs were confirmed by sequence analysis and used for the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation with tobacco leaf. 35S, CaMV 35S; LB, left border; NPT II, neomycin phosphotransferase II; NOS-P, nopalin synthase gene promoter; NOS-T, 3′ terminator region of the nopalin synthase gene; RB, right border; T7, transcript 7 terminator.
광량은 100 umol m-2 s-1± 30으로서 16시간 광조건과 8시간 암조건이며, 25±5℃으로 설정되어 있는 배양실에서 재배하였다.
또한, ROS 생성 억제에 관여하는 유전자의 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체 전체를 약 6주 동안 배양병에서 생장시킨 후 산화적 스트레스와 고염분 스트레스를 30분간 처리하여 H₂O₂의 축적을 DAB 염색을 통하여 관찰하였다 (Fig. 5). 그 결과 야생형 식물체에 비해 형질전환 식물체 모두 ROS 축적이 현저하게 억제되었는데, 산화적 스트레스에 대한 저항효과가 야생형 식물체에 비해 이들 형질전환 식물체에서 높게 유지되고 있는 것은 ROS의 생성이 저해되었기 때문인 것으로 사료된다.
따라서 ROS의 생성은 초기 30분 내에 일시적으로 발생한 Phase I의 ROS와 Phase II의 좀 더 장기적으로 다량의 고농도로 발생된 ROS의 생리적 역할이 다를 것으로 여겨진다. 본 논문에서는 스트레스 처리 시 생성되는 ROS를 확인한 후 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체를 이용하여 실험을 수행하였다. 스트레스에 의해 생성되는 ROS의 생성을 억제시킴으로써 스트레스에 대한 ethylene 생성이 더 적은 것으로 나타났다.
본 연구에서는 담배 (Nicotiana tabacum L. cv Wisconsin 38) 식물체를 사용하여 ROS생성에 관여하는 유전자의 발현이 억제된 식물체를 제조하기 위하여 RbohD, RbohF를 antisense 방향으로 도입하여 제조한 형질전환 돌연변이 식물체를 사용하였다 (Fig. 1). 확보한 RbohD, RbohF의 antisense 형질전환 식물체들의 라인들 중에서 활성산소 생성이 가장 억제된 라인들을 선별하여 본 연구의 실험 재료로 사용하였다.
상등액을 옮긴 후 추출물 2.4 ml과 24 ul 0.1 mM 2’7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) (SigmaChemicals,StLouis,Mo,USA)을 첨가하여 잘 섞은 후 실온에서 dark 상태로 10분간 incubation 하였으며 Spectrofluorophotometer를 이용하여 excitation 485 nm/emission 525nm 파장에서 형광을 측정한 후 각각 sample의 protein양을 정량하여 각각의 sample의 값을 계산하였다.
스트레스 처리 시 생성되는 ROS를 확인한 후 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서 활성산소 생성이 적은 라인을 각각 선별 (RbohD-AS #10, RbohF-AS #8) 하였다. 이를 이용하여 스트레스 (20 mM H₂O₂, 200 mM NaCl)를 처리한 후 시간에 따른 ethylene 생성량을 측정하였다 (Fig.
2010). 식물에 스트레스가 주어지면 ROS의 발생이 증가하게 되어 식물생장도 저하되는 스트레스 반응을 나타내므로 ROS가 저하된 형질전환 식물체를 통해 ROS와 스트레스에 대한 저항성과의 관계를 알아보고자 ROS 생성 억제에 관여하는 유전자의 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체를 이용하여 200 mM NaCl이 포함된 MS agar 배지에서 종자의 발아 및 유식물의 생장을 조사하였다. 고염분 MS 배지에서 발아한 유식물의 생장은 발아 후 20일째 된 유식물의 표현형 변화와 뿌리 생장 정도를 측정하여 조사하였고 그 결과 야생형 식물체에 비해 형질 전환 식물체인 RbohD-AS에서 두드러지게 높은 생장률을 나타내었으나, RbohF-AS 형질전환 식물체에서 야생형에 비해 생장이 약간 증가하였을 뿐, RbohD-AS 보다는 월등하게 낮은 생장을 나타내었다 (Fig.
야생형 식물체와 형질전환 담배 식물체의 잎 조직을 수확하여 스트레스 (20 mM H2O2와 200 mM NaCl)를 처리하여 ethylene 후기 peak에서 잎 조직을 액체질소를 이용하여 마쇄한 후 DNA 추출용액 [0.1 M Tris-HCl (pH 8.0), 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA, 2% CTAB, 0.2% β-mercaptoethanol] 을 혼합하여 65℃에 10분간 방치하였다.
야생형 식물체와 형질전환 담배 식물체의 잎 조직을 수확하여 스트레스 (20 mM H₂O₂와 200 mM NaCl)를 처리한 후 6 ml 용기에 넣어 공기가 새지 않게 밀봉하여 1시간 동안 ethylene을 포집한 후 1 ml용 주사기로 용기 내 기체를 채취하였다. Gas chromatography를 이용하여 ethylene 양을 측정하였으며, 시료의 생중량과 용기의 부피를 이용하여 ethylene 생성량을 계산하였다.
야생형 식물체의 잎 조직을 수확하여 스트레스 (20 mM H₂O₂와 200 mM NaCl)를 처리한 후 각 시간에 맞춰 액체질소를 이용하여 즉시 마쇄한 후 10 mM Tris (hydroxylmethyl)aminomethane (Tris) buffer (pH 7.2)를 첨가하여 원심분리 (2,000 xg, 5min, 4℃) 하였다. 상등액을 옮긴 후 추출물 2.
앞서 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF의 유전자 발현이 억제된 식물체에서 스트레스 처리에 대한 ethylene 생성량이 크게 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 과정을 세포손상의 관점에서 확인하기 위해 스트레스 처리 후 genomic DNA를 분리하여 DNA fragmentation을 조사하였다. 20 mM H₂O₂ 처리 후 ethylene 생성은 각각 1시간과 30시간에 peak를 보이는 biphasic 양상을 나타내었는데 이 시기의 야생형 식물체의 잎 조직을 harvest하여 genomic DNA를 분리한 후 DNA fragmentation을 확인하였다 (Fig.
스트레스 처리 시 생성되는 ROS를 확인한 후 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서 활성산소 생성이 적은 라인을 각각 선별 (RbohD-AS #10, RbohF-AS #8) 하였다. 이를 이용하여 스트레스 (20 mM H₂O₂, 200 mM NaCl)를 처리한 후 시간에 따른 ethylene 생성량을 측정하였다 (Fig. 3). 전체적으로 보았을 때 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서는 야생형 식물체에 비해 전반적으로 ethylene의 양이 적게 측정되었으며 이는 RbohD-AS와 RbohF-AS 식물체에서 스트레스에 의해 생성되는 ROS의 생성이 억제되었으며 그 결과로 스트레스에 대한 ethylene 생성이 더 적은 것으로 보여졌다.
상기과정에서 얻은 DNA pellet을 50 ul TE beffer에 녹여 1 ul RNase (10 mg/㎖)를 첨가하여 30분간 실온에서 반응시켜 RNA를 제거하였다. 최종적으로 얻은 genomic DNA를 정량 분석하였다. Genomic DNA를 정량 분석한 후 15 ug을 1.

대상 데이터

1). 확보한 RbohD, RbohF의 antisense 형질전환 식물체들의 라인들 중에서 활성산소 생성이 가장 억제된 라인들을 선별하여 본 연구의 실험 재료로 사용하였다. 광량은 100 umol m^-2s^-1± 30으로서 16시간 광조건과 8시간 암조건이며, 25±5℃으로 설정되어 있는 배양실에서 재배하였다.

성능/효과

Biphasic한 ROS와 ethylene의 생성에서 초기 과정인 phase I에서는 세포손상이 두드러지게 나타나지 않으며, DNA fragmentation도 관찰되지 않았지만 후기 peak시기인 phase II에서 야생형 식물체로부터 분리한 genomic DNA의 fragmentation이 증가한 것으로 보아 이 시기에 주로 PCD를 유발하는 것으로 사료된다. 그렇다면 phase I에서의 ROS의 생성과 ethylene 생성은 오히려 신호물질로 작용하여 phase II의 ROS와 ethylene 생성을 유발하는 것으로 생각할 수도 있을 것이다.
ROS 생성 억제에 관여하는 유전자의 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체를 이용하여 ROS 축적을 조사한 결과 H₂O₂와 NaCl의 모든 처리구에서 ROS 축적이 현저하게 억제됨을 확인하였는데 (Fig. 4) 이는 ROS 생성에 관여하는 RbohD와 RbohF의 유전자가 이들 형질 전환 식물체에서 효과적으로 억제되었음을 확인해 주었다. 또한 이들 형질전환 식물체에서 스트레스에 의한 ROS 축적이 크게 억제된 결과를 통해 RbohD와 RbohF가 스트레스에 의해 유도되는 ROS 생성에 주요하게 작용하고 있다는 것을 확인하였다.
또한 이 과정에서 ROS와의 상호관계로서 ROS 억제로 인한 ethylene 생성량 감소도 스트레스 저항성을 높게 유도하는 것으로 여겨진다. RbohD-AS와 RbohF-AS에서 상대적인 스트레스 저항성을 비교하여 보면, RbohF-AS보다 RbohD-AS에서 더 월등하게 높은 스트레스 저항성을 나타낸 것으로 보아 유식물에 처리된 스트레스에 대한 반응 과정에서 RbohF 유전자보다는 RbohD의 유전자가 더 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 현재 스트레스 반응 과정에서 ROS 생성에 RbohF와 RbohD 중 어떤 유전자가 더 주요하게 작용하는지에 대해서는 아직 확립된 이론은 없으나 스트레스를 받은 식물의 유전자 발현 정도는 RbohF 유전자가 RbohD 유전자 보다 월등하게 낮은 편이다.
식물에 스트레스가 주어지면 ROS의 발생이 증가하게 되어 식물생장도 저하되는 스트레스 반응을 나타내므로 ROS가 저하된 형질전환 식물체를 통해 ROS와 스트레스에 대한 저항성과의 관계를 알아보고자 ROS 생성 억제에 관여하는 유전자의 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체를 이용하여 200 mM NaCl이 포함된 MS agar 배지에서 종자의 발아 및 유식물의 생장을 조사하였다. 고염분 MS 배지에서 발아한 유식물의 생장은 발아 후 20일째 된 유식물의 표현형 변화와 뿌리 생장 정도를 측정하여 조사하였고 그 결과 야생형 식물체에 비해 형질 전환 식물체인 RbohD-AS에서 두드러지게 높은 생장률을 나타내었으나, RbohF-AS 형질전환 식물체에서 야생형에 비해 생장이 약간 증가하였을 뿐, RbohD-AS 보다는 월등하게 낮은 생장을 나타내었다 (Fig. 6A). 또한, RbohD-AS 식물체에서 뿌리생장 역시 고농도의 NaCl이 처리된 배지에서 야생형에 비해 2배 높은 생장이 관찰되었다 (Fig.
5). 그 결과 야생형 식물체에 비해 형질전환 식물체 모두 ROS 축적이 현저하게 억제되었는데, 산화적 스트레스에 대한 저항효과가 야생형 식물체에 비해 이들 형질전환 식물체에서 높게 유지되고 있는 것은 ROS의 생성이 저해되었기 때문인 것으로 사료된다. 또한 스트레스에 의한 ROS 생성에 RbohD와 RbohF가 관여하고 있기 때문에 이들 유전자 발현이 억제된 형질전환 식물체에서 ROS 생성이 현저하게 감소한 것으로 나타났으며 이들 형질전환 식물체에서는 ethylene 생성도 크게 저하되었으므로 ROS 생성 저하에 낮은 수준의 ethylene 생성도 영향을 미치는 것으로 판단된다.
7A). 그 정도를 확인한 결과 phase II 시기인 30시간째에는 야생형 식물체에 비해 이들 형질전환 식물체에 DNA fragmentation의 효과가 월등하게 감소되는 것을 확인할 수 있었고 특히, RbohD-AS 형질전환 식물체에서 그 효과가 더 좋은 것을 알 수 있었다. 또한 200 mM NaCl을 처리한 경우에 다량의 ethylene이 생성되는 시기인 48시간 후 야생형 식물체에서 DNA의 fragmentation은 대조구에 비해 NaCl 처리구에서 크게 증가되었고 형질전환 식물체에서는 대조구에 비해 DNA fragmentation이 다소 낮은 수준으로 일어났다.
산화적 스트레스와 고염분 스트레스에서 후기 ethylene이 다량으로 생성되는 시기, 즉 세포손상이 초래되는 후기에서 DNA fragmentation 분석을 통해서 ROS와 ethylene의 생성이 높은 식물체일수록 PCD가 높게 나타난 것으로 여겨지며, 이 과정에서 작용하는 유전자는 RbohD와 RbohF인 것으로 보이며, RbohD가 더 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다. 따라서 스트레스에 반응하는 신호전달과정에서 초기에 ROS가 생성이 되고 후기에 ethylene이 다량으로 생성되어 결국 세포죽음에 이르게 하는 상호 synergism을 일으켜 반응을 나타내며, 이러한 반응 과정에서 RbohD와 RbohF 유전자 발현의 억제가 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 높이는 것으로 사료된다.
그 정도를 확인한 결과 phase II 시기인 30시간째에는 야생형 식물체에 비해 이들 형질전환 식물체에 DNA fragmentation의 효과가 월등하게 감소되는 것을 확인할 수 있었고 특히, RbohD-AS 형질전환 식물체에서 그 효과가 더 좋은 것을 알 수 있었다. 또한 200 mM NaCl을 처리한 경우에 다량의 ethylene이 생성되는 시기인 48시간 후 야생형 식물체에서 DNA의 fragmentation은 대조구에 비해 NaCl 처리구에서 크게 증가되었고 형질전환 식물체에서는 대조구에 비해 DNA fragmentation이 다소 낮은 수준으로 일어났다. 특히 DNA fragmentation 현상은 스트레스를 주지 않은 상태의 대조구에서도 다소 나타난 것으로 보였으나 형질전환 식물체에서는 이러한 DNA fragmentation 현상이 거의 보이지 않았다 (Fig.
그 결과 야생형 식물체에 비해 형질전환 식물체 모두 ROS 축적이 현저하게 억제되었는데, 산화적 스트레스에 대한 저항효과가 야생형 식물체에 비해 이들 형질전환 식물체에서 높게 유지되고 있는 것은 ROS의 생성이 저해되었기 때문인 것으로 사료된다. 또한 스트레스에 의한 ROS 생성에 RbohD와 RbohF가 관여하고 있기 때문에 이들 유전자 발현이 억제된 형질전환 식물체에서 ROS 생성이 현저하게 감소한 것으로 나타났으며 이들 형질전환 식물체에서는 ethylene 생성도 크게 저하되었으므로 ROS 생성 저하에 낮은 수준의 ethylene 생성도 영향을 미치는 것으로 판단된다.
따라서 ethylene의 생성은 ROS 생성의 downstream에 위치하고 있는 것으로 여겨진다. 또한 이 결과에서 보면 ROS 생성이 낮으면 ethylene 생성이 낮아짐으로써 ethylene과 ROS는 서로 synergism을 갖고 합성이 되고 있는 것으로 여겨졌으며, 한편으로 서로의 생합성을 촉진하고 이 과정에서도 biphasic 양상을 나타내게 된다고 여겨진다.
이것으로 보아 고염분 스트레스에 의해서 생성되는 ROS의 생성이 감소하면 식물체의 스트레스 저항성이 높아지는 것으로 여겨진다. 또한 이 과정에서 ROS와의 상호관계로서 ROS 억제로 인한 ethylene 생성량 감소도 스트레스 저항성을 높게 유도하는 것으로 여겨진다. RbohD-AS와 RbohF-AS에서 상대적인 스트레스 저항성을 비교하여 보면, RbohF-AS보다 RbohD-AS에서 더 월등하게 높은 스트레스 저항성을 나타낸 것으로 보아 유식물에 처리된 스트레스에 대한 반응 과정에서 RbohF 유전자보다는 RbohD의 유전자가 더 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다.
4) 이는 ROS 생성에 관여하는 RbohD와 RbohF의 유전자가 이들 형질 전환 식물체에서 효과적으로 억제되었음을 확인해 주었다. 또한 이들 형질전환 식물체에서 스트레스에 의한 ROS 축적이 크게 억제된 결과를 통해 RbohD와 RbohF가 스트레스에 의해 유도되는 ROS 생성에 주요하게 작용하고 있다는 것을 확인하였다.
본 연구에서는 ROS 생성에 관여하는 유전자인 RbohD와 RbohF의 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에 고염분과 산화적 스트레스 등을 처리했을 때 ROS 생성과 축적, ethylene 생성에 따른 저항성을 확인하였다. 또한 후기의 다량 생성된 ethylene의 최고치에 따른 세포사멸을 통해 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서의 cell death 감소를 확인하였다.
6A). 또한, RbohD-AS 식물체에서 뿌리생장 역시 고농도의 NaCl이 처리된 배지에서 야생형에 비해 2배 높은 생장이 관찰되었다 (Fig. 6B). 이것으로 보아 고염분 스트레스에 의해서 생성되는 ROS의 생성이 감소하면 식물체의 스트레스 저항성이 높아지는 것으로 여겨진다.
, 200 mM NaCl) 각각 처리 후 ROS 생성을 확인한 결과 대조구에 비해 굉장히 높은 수준의 ROS가 생성되는 것을 확인하였다. 또한, 스트레스 처리 후 30분이 지났을 때 일시적으로 1차 peak를 형성하였다가 거의 basal level까지 감소하고 다시 증가하여 3시간 후에 상당히 오랫동안 지속되는 다량의 2차 peak를 형성한 후 다시 거의 basal level로 낮아지는 두 번의 ROS 생성 peak가 biphasic 양상이 나타났다 (Fig. 2). 따라서 스트레스 반응에서 ROS 생성의 biphasic한 양상을 확인하였으며 이러한 두 번의 ROS peak가 스트레스 signal로 작용할 것인지 혹은 앞의 peak만 스트레스 signal로 작용하고 있는 것인지에 대한 추가 연구가 필요 할 것으로 사료된다.
스트레스에 의해 생성되는 ROS의 생성을 억제시킴으로써 스트레스에 대한 ethylene 생성이 더 적은 것으로 나타났다. 또한, 이들 형질전환 식물체에서 ethylene 생성과 H₂O₂억제 효과를 확인하였으며 고염분 등의 스트레스에 대한 저항성은 ROS와 ethylene의 생성이 저하되어 나타난 것으로 판단된다. 산화적 스트레스와 고염분 스트레스에서 후기 ethylene이 다량으로 생성되는 시기, 즉 세포손상이 초래되는 후기에서 DNA fragmentation 분석을 통해서 ROS와 ethylene의 생성이 높은 식물체일수록 PCD가 높게 나타난 것으로 여겨지며, 이 과정에서 작용하는 유전자는 RbohD와 RbohF인 것으로 보이며, RbohD가 더 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다.
비생물학적 스트레스로 H₂O₂를 이용하여 산화적 스트레스와 고염분 스트레스를 처리한 후 ROS의 생성을 확인한 결과 스트레스 처리 후 30분에 일시적으로 1차 peak를 형성하였다가 거의 basal level까지 감소하고 다시 증가하여 3시간에 매우 다량의 2차 peak를 형성한 후 거의 basal level로 다시 낮아지는 biphasic 양상을 나타내게 된다. 따라서 ROS의 생성은 초기 30분 내에 일시적으로 발생한 Phase I의 ROS와 Phase II의 좀 더 장기적으로 다량의 고농도로 발생된 ROS의 생리적 역할이 다를 것으로 여겨진다.
7B). 산화적 스트레스와 고염분 스트레스 모두 RbohF-AS 식물체보다는 RbohD-AS의 식물체에서 DNA fragmentation이 크게 저하된 것으로 보아 역시 스트레스에 의한 세포 손상 과정에서 일어나는 DNA의 fragmentation에도 역시 RbohF 유전자보다는 RbohD의 유전자가 더 주요하게 작용하고 있는 것으로 여겨진다. 식물이 높은 강도의 스트레스가 받았을 경우 세포죽음이 초래되는 경우나 혹은 HR (Hypersensitive response)에 의한 저항성 반응이 일어나는 기작을 보면 다음과 같다.
또한, 이들 형질전환 식물체에서 ethylene 생성과 H₂O₂억제 효과를 확인하였으며 고염분 등의 스트레스에 대한 저항성은 ROS와 ethylene의 생성이 저하되어 나타난 것으로 판단된다. 산화적 스트레스와 고염분 스트레스에서 후기 ethylene이 다량으로 생성되는 시기, 즉 세포손상이 초래되는 후기에서 DNA fragmentation 분석을 통해서 ROS와 ethylene의 생성이 높은 식물체일수록 PCD가 높게 나타난 것으로 여겨지며, 이 과정에서 작용하는 유전자는 RbohD와 RbohF인 것으로 보이며, RbohD가 더 효과적으로 작용하는 것으로 생각된다. 따라서 스트레스에 반응하는 신호전달과정에서 초기에 ROS가 생성이 되고 후기에 ethylene이 다량으로 생성되어 결국 세포죽음에 이르게 하는 상호 synergism을 일으켜 반응을 나타내며, 이러한 반응 과정에서 RbohD와 RbohF 유전자 발현의 억제가 스트레스에 대한 식물체의 저항성을 높이는 것으로 사료된다.
스트레스 처리 후 생성되는 ROS를 정량적으로 분석하기 위해 야생형 식물체에서 비생물학적 스트레스로 산화적 스트레스와 염분 스트레스를 (20 mM H₂O₂, 200 mM NaCl) 각각 처리 후 ROS 생성을 확인한 결과 대조구에 비해 굉장히 높은 수준의 ROS가 생성되는 것을 확인하였다. 또한, 스트레스 처리 후 30분이 지났을 때 일시적으로 1차 peak를 형성하였다가 거의 basal level까지 감소하고 다시 증가하여 3시간 후에 상당히 오랫동안 지속되는 다량의 2차 peak를 형성한 후 다시 거의 basal level로 낮아지는 두 번의 ROS 생성 peak가 biphasic 양상이 나타났다 (Fig.
본 논문에서는 스트레스 처리 시 생성되는 ROS를 확인한 후 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF 유전자 발현이 억제된 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체를 이용하여 실험을 수행하였다. 스트레스에 의해 생성되는 ROS의 생성을 억제시킴으로써 스트레스에 대한 ethylene 생성이 더 적은 것으로 나타났다. 또한, 이들 형질전환 식물체에서 ethylene 생성과 H₂O₂억제 효과를 확인하였으며 고염분 등의 스트레스에 대한 저항성은 ROS와 ethylene의 생성이 저하되어 나타난 것으로 판단된다.
2010). 앞서 ROS 생성 유전자인 RbohD와 RbohF의 유전자 발현이 억제된 식물체에서 스트레스 처리에 대한 ethylene 생성량이 크게 저하되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 과정을 세포손상의 관점에서 확인하기 위해 스트레스 처리 후 genomic DNA를 분리하여 DNA fragmentation을 조사하였다.
3). 전체적으로 보았을 때 RbohD-AS, RbohF-AS 형질전환 식물체에서는 야생형 식물체에 비해 전반적으로 ethylene의 양이 적게 측정되었으며 이는 RbohD-AS와 RbohF-AS 식물체에서 스트레스에 의해 생성되는 ROS의 생성이 억제되었으며 그 결과로 스트레스에 대한 ethylene 생성이 더 적은 것으로 보여졌다. 또한 biphasic ROS 생성은 스트레스 처리 후 30분과 3시간에 나타났지만 ethylene의 biphasic peak는 스트레스 처리 후 1시간과 30시간에 최대치를 이루었다.

후속연구

2). 따라서 스트레스 반응에서 ROS 생성의 biphasic한 양상을 확인하였으며 이러한 두 번의 ROS peak가 스트레스 signal로 작용할 것인지 혹은 앞의 peak만 스트레스 signal로 작용하고 있는 것인지에 대한 추가 연구가 필요 할 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	스트레스로 인한 유전자 발현 변화 또는 세포의 대사작용 변화는 어떤 문제점이 있는가?	1995) 스트레스에 대해 식물은 유전자 발현 변화 또는 세포의 대사작용 변화를 일으키게 된다 (Knight and Knight 2001). 이러한 비생물학적 스트레스가 가해지면 일시적으로 활성산소군의 생성이 크게 증가하여 식물생장에 불리하게 작용하기 때문에 식물의 생산성과 작물의 질이 떨어지는 등 식물에 해를 입히게 된다 (Inzé and Montague1995). 활성 산소군 (Reactive oxygen species, ROS)은 superoxide radical (O2-․), hydroxyl radical (OH․), 그리고 hydrogen peroxide (H2O2) 등으로 식물체내에서 과잉 생산되면 생체 내에서 세포막과 단백질을 분해하고 DNA 합성을 저해할 뿐 아니라 다른 세포구성 성분에 산화적 스트레스를 일으키며 (Fridovich 1986; Bartosz 1997; Foyer and Noctor 2000), 그 중 H2O2는 낮은 농도에서도 엽록체에서의 광합성률을 저하시키며 치명적 피해를 식물에 일으킨다 (Alscher et al.
	생물에게 노출되는 스트레스는 무엇이 있는가?	식물과 동물은 발달 과정 중 노화과정이나 스트레스에 노출되게 되는데 병원균, 가뭄, 과도한 고온과 저온, 고광도, 고염분 등의 다양한 비생물학적/생물학적 스트레스가 있으며 식물은 대부분 변화가 많은 환경 조건에서 살게 되는데, 특히 식물의 생장과 발달에 지장을 초래하는 환경조건에 처하게 되므로 (Boyer 1982; Thomashow 2001; Bohnert et al. 1995) 스트레스에 대해 식물은 유전자 발현 변화 또는 세포의 대사작용 변화를 일으키게 된다 (Knight and Knight 2001).
	활성 산소군의 문제점은 무엇인가?	이러한 비생물학적 스트레스가 가해지면 일시적으로 활성산소군의 생성이 크게 증가하여 식물생장에 불리하게 작용하기 때문에 식물의 생산성과 작물의 질이 떨어지는 등 식물에 해를 입히게 된다 (Inzé and Montague1995). 활성 산소군 (Reactive oxygen species, ROS)은 superoxide radical (O2-․), hydroxyl radical (OH․), 그리고 hydrogen peroxide (H2O2) 등으로 식물체내에서 과잉 생산되면 생체 내에서 세포막과 단백질을 분해하고 DNA 합성을 저해할 뿐 아니라 다른 세포구성 성분에 산화적 스트레스를 일으키며 (Fridovich 1986; Bartosz 1997; Foyer and Noctor 2000), 그 중 H2O2는 낮은 농도에서도 엽록체에서의 광합성률을 저하시키며 치명적 피해를 식물에 일으킨다 (Alscher et al. 1997).

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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