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문제 정의
- 하지만 볼락의 초기성장과 양식 과정에서 성장특성을 조사한 연구 결과(최 등, 2005)는 있지만, 지금까지 어류의 성장단계 특이적 발현 유전자 탐색에 관한 연구 결과는 보고된 바 없다. 본 연구는 볼락의 성장단계에 따라 차등 발현 양상을 나타내는 유전자를 differential screening 방법으로 탐색하고 유전자 단편을 확보하여 유전정보를 분석하고, 성장 초기 단계와 성장의 절정기에 도달한 어류의 근육조직에서 발현량이 많은 유전자를 분석하여, 성장능력이 우수한 개체선발에 이용할 분자마커를 개발하고자 수행하였다.
- 이 연구는 한국해양연구원의「동해온 배수와 심층수 활용에 기반을 둔 해양식량 어류자원의 유전적 관리체계 구축」 연구과제의 지원을 받아 수행되었다.
제안 방법
- 2B에서 화살표로 표시한 것과 같이 강한 시그널을 나타낸 cDNA 클론을 성장단계 특이발현 후보 유전자로 선발하였다.6개월령 근육조직에서 발현량이 많은 클론 112개와 18개월령 근육조직에서 발현량이 많은 클론 90개를 확보하였고, hybridization 반응 강도를 높여 sub-任acted cDNA library를 반응 시켜 최종적으로 32개 (6개월령 근육조직에서 발현량 증가: 13개, 18개월령 근육조직에서 발현량 증가: 19개)의 각 성장단계 특이적인 차등 발현 유전자를 선택하여 염기서열을 분석하였다(Table 3).
- 6개월령 및 18개월령 볼락 근육조직 특이적인 cDNAlibrary 는 PCR-Selected cDNA Subtraction Kit (Clontech, USA) 을 사용하여 제작하였다. 각 월령별 볼락 근육조직에서 분리한 mRNA를 AMV reverse transcriptase를 사용하여 한 가닥 cDNA를 합성하였으며, 이를 주형으로 두 가닥 cDNA 를 합성하였다.
- Reverse tran~ scriptase (hw血)gew, USA)를 첨가하여 42℃에서 50분간반응시켜 한 가닥 cDNA로 전환하였다. Dicentrarchus labrax의 GAPDH 염기서열 (GenBank accession No. AY863M8) 을 기초로 하여 제작한 primer로 한 가닥 eDNA의 합성 여부 및 합성효율을 확인하였으며, semi-quaiHitation을 위하여 한 가닥 eDNA량을 정량화하였다. 적정량의 cDNA와 target primer-®- 사용하여 (Table 2) 18 cycle 반응 시킨 산물을 gel 전기영동으로 확인하였고, 각각 단편의 밝기 강도를 densitometer(Vilber Lourmat, France)# 이용하여 정량하고 분석하였다.
- 분석하였다. Digoxigenin-dUTP (Roche, Germany) 로합성한 4개의 probe로 forwardiubtracted [6개월령-18개월령 , 18M (-)] cDNA library 및 reverse-subtracted [18개월 령-6 개월령, 6M (-)] cDNA library를 분석하였다. 각 subtraction 단계에서 얻은 2차 PCR 산물을 probe로 이용하였으며, 각 subtracted cDNA library로부터 확보한 콜로니를 주형으로 사용하였다.
- 제작한 subtracted cDNA librarye 본 연구에서 사용한 kit 내에 있는 control을 이용하여 정상적으로 subtraction 되었는지 여부를 전기영동 방법으로 확인하였다. Fig 1의 1번 lane(18M-6M cDNA library)과 3번 lane(6M-18M cDNA library)^)- 같이 정상적으로 제작되어, 4개의 subtracted librarye- probe 이용하여 양방향으로 비교 가능하도록 differential screening을 실시하였다(Fig. 2)’Fig. 2B에서 화살표로 표시한 것과 같이 강한 시그널을 나타낸 cDNA 클론을 성장단계 특이발현 후보 유전자로 선발하였다.
- 각 subtraction 단계에서 얻은 2차 PCR 산물을 probe로 이용하였으며, 각 subtracted cDNA library로부터 확보한 콜로니를 주형으로 사용하였다. Imager를 이용하여 비교 분석한 blot의 signal 은 NBT/BCIP 용액 (Roche, Germany)으로 염색하여 분석하였다.
- ^ RNA를 옮기고 UV-cross-linEr(UVPCL-1000, USA:^ 사용하여 고정시켰다. Probe DNA는 subtracted cDNA librarye- 분석하여 확보한 cDNA 를 DIG High Prime을 이용하여 합성하였으며 , hybridization 반*은응' high SDS hybridization buffer (5x SSC, 0.1% N-lauro-ylsarcosine, 7% SDS, 2% blocking reagents, 50% formamide, 50 mM sodium phosphate buffer, pH7.0)# 사용하여 반응 강도를 높여 실시하였다. 반응이 끝난 nylon membranee CDP-s£ar (Roche, Germany)를 사용하여 Xray film에 노출시켜 signal을 확인하고 분석하였다.
- Semi-quantitative RT-PCR을 이용한 발현양상 분석 결과에서 추가분석이 요구되거나 발현량이 많은 유전자에 대해서는 northern hybridization 분석으로 발현양상을 재확인하였다(Fig. 3). 발현양상은 semi-quantitative RT-PCR 분석 결과와 크게 다르지 않았으며, cDNA clone 6M05A4-기에 해당하는 유전자는 볼락의 성장 초기에 발현량이 많다가 18개월령에는 발현량이 감소하였고, 이후의 성장단계에서는 발현량이 다시 증가하는 패턴을 나타내었다.
- Digoxigenin-dUTP (Roche, Germany) 로합성한 4개의 probe로 forwardiubtracted [6개월령-18개월령 , 18M (-)] cDNA library 및 reverse-subtracted [18개월 령-6 개월령, 6M (-)] cDNA library를 분석하였다. 각 subtraction 단계에서 얻은 2차 PCR 산물을 probe로 이용하였으며, 각 subtracted cDNA library로부터 확보한 콜로니를 주형으로 사용하였다. Imager를 이용하여 비교 분석한 blot의 signal 은 NBT/BCIP 용액 (Roche, Germany)으로 염색하여 분석하였다.
- 각 월령별 근육조직 subtracted cDNA library로부터 선발한 차등발현 유전자의 발현양상을 분석하기 위하여 볼락 6, 18, 30, 42개월령 근육조직에 대한 semiquantitative RT-PCR을 실시하였다(Table 4). 6개월령 특이적 발현양상을 나타낸 6M05A3-40, 6M05A3-55, 6M05A3-58, 6M05A4-06, 6M05A4-69 cDNA 클론은 볼락이 성장함에 따라 발현량이 급격히 감소하여 30개월령 이후에는 발현량이 극소량이었다.
- 사용하여 제작하였다. 각 월령별 볼락 근육조직에서 분리한 mRNA를 AMV reverse transcriptase를 사용하여 한 가닥 cDNA를 합성하였으며, 이를 주형으로 두 가닥 cDNA 를 합성하였다. 합성한 두 가닥 cDNA의 말단을 제한효소를 사용하여 blunt-end로 만들고 adaptor 1과 adaptor 2R을 부착하였다.
- Subtractive hybridizatione 두 단계로 나누어 실시하였으며, 첫 번째 단계의 hybridizatione 반응액을 98℃에서 90초간 반응시킨 후 68℃에서 8시간 동안 반응 시 켰다. 두 번째 단계의 hybridizatione driver cDNA를 첨가하여 98℃에서 90초 동안 반응시킨 후, hybridization sample을 혼합하여 68℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 완료하였다’ 각각의 subtraction 시료를 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 cDNA (subtracted cDNA)를 pGEM-T easy vector system (Promega, USA)을 이용하여 subtracted cDNA library 를 구축하였다. Subtracted cDNA library 제작 시 사용한 PCR primer 및 adaptor 의 서열은 Table 1과 같다.
- 0)# 사용하여 반응 강도를 높여 실시하였다. 반응이 끝난 nylon membranee CDP-s£ar (Roche, Germany)를 사용하여 Xray film에 노출시켜 signal을 확인하고 분석하였다.
- 볼락 근육조직 total RNA는 연령별 개체의 근육조직을 각각 100與씩 취하여 액체질소를 이용하여 파쇄한 후, * TRIzol Reagent (Invitrogen, USA)와 chloroform을 사용하여 분리하였다. mRNA는 total RNA로부터 oligo (dT)-latex bead를 사용하는 NucleoTrap® mRNA Purification Kits (Clontech, USA)을 이용하여 회수하였다.
- 볼락 월령별 '근육조직 subtracted cDNA libra고를 PCR-Selected Differential Screening Kits (Clontech, US A) 을 사용하여 분석하였다. Digoxigenin-dUTP (Roche, Germany) 로합성한 4개의 probe로 forwardiubtracted [6개월령-18개월령 , 18M (-)] cDNA library 및 reverse-subtracted [18개월 령-6 개월령, 6M (-)] cDNA library를 분석하였다.
- 볼락 월령별 근육조직으로부터 분리 - 정제한 total RNA 를 RNA sample buffer (64.5% deionized formamide, 8.35% formaldehyde, 0, 64x MOPS)와 섞어 65“C에서 15분간 변성시킨 다음, formaldehyde geHoadhig buffer (50% glycerol, 1 mM EDTA pH8Q 0.25% Xylene cyanol FF, 0.25% bromophenol blue)를 첨가하여 1.2% formaldehyde gel 전기영동 하였다. 전기영동이 끝난 gel에서 formaldehydee- 충분히 제거한 nylon membrane, 0.
- 볼락의 성장 관련 기능성 유전자를 탐색하기 위하여 6개월령 및 18개월령 근육조직 특이적인 subtracted cDNA libe rary를 제작하였다. 6개월령 근육조직 특이적 인 cDNA lil> rary[18M(-), 6M-18M)]는 6개월령 근육조직 cDNA library 에서 18개월령 근육조직에서 발현되는 유전자와 일치하는 cDNA를 제거하여 제작한 것으로 18개월령 근육조직과 공통으로 발현되는 유전자가 없는 상태의 cDNA library 이다.
- 볼락의 성장단계에 따른 차등 발현 유전자를 탐색하기 위하여 6개월령 및 18개월령 근육조직을 사용하여 subtracted cDNA library# 제작하였고 각각의 연령에서 발현량 차이를 나타낸 202개의 cDNA 단편을 확보하였으며, 발현량 차이가 뚜렷한 32개의 cDNA 클론은 성장단계별 특이발현 후보 유전자로 선발하여 염기서 열을 분석하였다. Myosin, adenylate kinase, calsequestrin, dystrobrevin beta, diphosphate kinase 유전자는 6개월령 근육조직에서 발현량이 많았으며, desmin, TGFBR2 (transforming growth factor-beta receptor), creatine kinase (muscle type), cathepsin D 유전자는 18개월령 근육조직에서 발현량이 많았다.
- 어류의 성장 관련 유전자를 확보하기 위하여 최 등(2005) 이 보고한 볼락의 산출 후의 체중 변화 자료에 기초하여 성장 초기인 6개월령과 성장의 절정단계라 할 수 있는 18개월령의 근육조직을 활용하여 볼락의 성장단계 관련 유전자를 탐색하였다. Subtraction 결과로 얻은 차등 발현 유전자 중기 능이 밝혀진 유전자들은 근육의 분화나 수축에 관여하는 근육 대사 관련 유전자와 에너지 대사 관련 유전자들이 있었고, 기능이 밝혀지지 않은 유전자 단편도 있었다.
- 볼락의 성장초기와 성장절정기에서 차등발현 양상을 나타낸 유전자는 6, 18, 30, 42 개월령 근육조직에서 연령 증가에 따른 발현양상을 분석하였으며 , dystrobrevin beta와 diphosphate kinase-Z] 은 6개월령 이후에는 발현량이 급격히 감소하여 18개월령, 30개월령 및 42개월령에서는 발현량이 극히 적었으며, creatine kinase (mus(시© type)와 cathepsin D 유전자는 연령 이 증가함에 따라 발현량이 증가되어 18개월령 이후, 30개월령과 42 개월령 근육조직에서도 발현량이 많았다. 이와 같이 성장단계에 따른 차등 발현 유전자를 탐색하고 연령 증가에 따른 발현양상을 비교.분석한 결과로부터 본 연구에서는 어류의 성장 초기 단계 근육조직에서는 근육수축 관련 유전자가 많이 발현되고, 성장 절정기에는 근육 내 에너지 양 조절 관련 유전자가 많이 발현되는 것을 확인하였다.
- 재조합 체로부터 plasmid DNA> 회수한 후, BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 염기서열 결정반응을 실시하였다. 반응이 끝난 산물은 ABI 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였으며 Chromas 230 과 BioEditv 50.
- AY863M8) 을 기초로 하여 제작한 primer로 한 가닥 eDNA의 합성 여부 및 합성효율을 확인하였으며, semi-quaiHitation을 위하여 한 가닥 eDNA량을 정량화하였다. 적정량의 cDNA와 target primer-®- 사용하여 (Table 2) 18 cycle 반응 시킨 산물을 gel 전기영동으로 확인하였고, 각각 단편의 밝기 강도를 densitometer(Vilber Lourmat, France)# 이용하여 정량하고 분석하였다.
- 이와 반대의 방법으로 18개월령 근육조직 특이적인 cDNA library [6M(-), (18M-6M)]를 제작하였다. 제작한 subtracted cDNA librarye 본 연구에서 사용한 kit 내에 있는 control을 이용하여 정상적으로 subtraction 되었는지 여부를 전기영동 방법으로 확인하였다. Fig 1의 1번 lane(18M-6M cDNA library)과 3번 lane(6M-18M cDNA library)^)- 같이 정상적으로 제작되어, 4개의 subtracted librarye- probe 이용하여 양방향으로 비교 가능하도록 differential screening을 실시하였다(Fig.
- 각 월령별 볼락 근육조직에서 분리한 mRNA를 AMV reverse transcriptase를 사용하여 한 가닥 cDNA를 합성하였으며, 이를 주형으로 두 가닥 cDNA 를 합성하였다. 합성한 두 가닥 cDNA의 말단을 제한효소를 사용하여 blunt-end로 만들고 adaptor 1과 adaptor 2R을 부착하였다. Subtractive hybridizatione 두 단계로 나누어 실시하였으며, 첫 번째 단계의 hybridizatione 반응액을 98℃에서 90초간 반응시킨 후 68℃에서 8시간 동안 반응 시 켰다.
대상 데이터
- 2)’Fig. 2B에서 화살표로 표시한 것과 같이 강한 시그널을 나타낸 cDNA 클론을 성장단계 특이발현 후보 유전자로 선발하였다.6개월령 근육조직에서 발현량이 많은 클론 112개와 18개월령 근육조직에서 발현량이 많은 클론 90개를 확보하였고, hybridization 반응 강도를 높여 sub-任acted cDNA library를 반응 시켜 최종적으로 32개 (6개월령 근육조직에서 발현량 증가: 13개, 18개월령 근육조직에서 발현량 증가: 19개)의 각 성장단계 특이적인 차등 발현 유전자를 선택하여 염기서열을 분석하였다(Table 3).
- 경남 통영시 소재의 한국해양연구원 통영 MRC에서 일반적인 관리방법으로 사육된 6개월령 (6M) 및 18개월령 (18M) 볼락을 각각 10개체씩 확보하였고, 각 개체의 근육조직을 library 제작에 이용하였다. 성장단계에 따른 발현량 분석에 사용하기 위하여 30개월령과 42개월령 볼락을 각각 10개체씩 확보하였다.
- library 제작에 이용하였다. 성장단계에 따른 발현량 분석에 사용하기 위하여 30개월령과 42개월령 볼락을 각각 10개체씩 확보하였다.
- 6개월령 근육조직 특이적 인 cDNA lil> rary[18M(-), 6M-18M)]는 6개월령 근육조직 cDNA library 에서 18개월령 근육조직에서 발현되는 유전자와 일치하는 cDNA를 제거하여 제작한 것으로 18개월령 근육조직과 공통으로 발현되는 유전자가 없는 상태의 cDNA library 이다. 이와 반대의 방법으로 18개월령 근육조직 특이적인 cDNA library [6M(-), (18M-6M)]를 제작하였다. 제작한 subtracted cDNA librarye 본 연구에서 사용한 kit 내에 있는 control을 이용하여 정상적으로 subtraction 되었는지 여부를 전기영동 방법으로 확인하였다.
데이터처리
- 1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 염기서열 결정반응을 실시하였다. 반응이 끝난 산물은 ABI 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 염기서열을 결정하였으며 Chromas 230 과 BioEditv 50.6 프로그램을 사용하여 비교 분석하였다.
성능/효과
- , 2006). 18개월령 특이적 발현 유전자에는 heat shock protein 90, chaperone protein GP 96, cathepsin, translationally control tumor protein 등의 유전자가 있었으며, 이 시기에는 면역 관련 유전자를 포함하여 외부의 환경변화에 적응에 필요한 유전자들이 발현되는 것으로 추정이 가능하다. 기능이 알려져 있지 않은 유전자의 성장단계에 따른 발현양상 분석 결과와 성장단계 특이적 발현 유전자의 발현양상 재확인을 위하여 실시한 northern blot 분석 결과로부터, 볼락의 성장초기부터 성장의 절정기에 도달시기까지 발현량이 많다가 18개월령 이후 근육조직에는 급속도로 발현량이 감소하는 유전자 그룹이 존재함을 알 수 있다.
- Myosin에 해당하는 6M05A4-71 클론은 6개월령에서 발현량이 많았고, 18개월령 근육조직에서 발현량이 급격히 감소하였으나, 30개월령과 42개월령 근육조직에서는 급격히 증가하는 발현양상을 나타내었다. 18개월령 특이적인 발현양상을 나타낸 creatine kinase (muscle type) 와 cathepsin D에 해 당하는 단편인 18M05A1-22과 18M05A2-09는 성장단계에 따른 특이적 발현량증가 없이 지속적으로 발현량이 높았고, 18M05A1-13 (TGFBR2)과 18M05A2-74 (TCTP) 클론은 성장함에 따라 약 20%의 발현량 감소가 있었다. 18MO5A1-26, 18M05A1-90, 18M05A2-84, 18M05A3-04 클론은 30개월령 이후에는 발현량이 급속히 감소하였다.
- 발현양상은 semi-quantitative RT-PCR 분석 결과와 크게 다르지 않았으며, cDNA clone 6M05A4-기에 해당하는 유전자는 볼락의 성장 초기에 발현량이 많다가 18개월령에는 발현량이 감소하였고, 이후의 성장단계에서는 발현량이 다시 증가하는 패턴을 나타내었다. 6M05A3-61 클론은 성장단계에 따른 발현량 증가는 없었으며, 6M05A4-14 클론은 18개월령 조직에서 발현량이 다소 감소하였으나, 42개월령 조직에서는 발현량이 높았다. 18M05A1-53 (Grp 94)는 30개월령에서 가장 많이 발현되었고, 그 이후에는 감소하였다.
- Calsequestrin 1 유전자 단편인 6M05A3-89 클론은 6개월령 근육조직에서 발현량이 가장 많았으며, 18개월령 이후 급격히 감소하다가 42개월령 근육조직에서는 발현되지 않았다. 6M05A4-02 클론은 dystrobrevin beta 유전자 단편이었으며, 6개월령 근육조직에서 발현량이 많았고, 18개월령 이후 근육조직에서의 발현량은 극히 미미하였다. Myosin에 해당하는 6M05A4-71 클론은 6개월령에서 발현량이 많았고, 18개월령 근육조직에서 발현량이 급격히 감소하였으나, 30개월령과 42개월령 근육조직에서는 급격히 증가하는 발현양상을 나타내었다.
- 실시하였다(Table 4). 6개월령 특이적 발현양상을 나타낸 6M05A3-40, 6M05A3-55, 6M05A3-58, 6M05A4-06, 6M05A4-69 cDNA 클론은 볼락이 성장함에 따라 발현량이 급격히 감소하여 30개월령 이후에는 발현량이 극소량이었다. Calsequestrin 1 유전자 단편인 6M05A3-89 클론은 6개월령 근육조직에서 발현량이 가장 많았으며, 18개월령 이후 급격히 감소하다가 42개월령 근육조직에서는 발현되지 않았다.
- 6개월령 특이적 발현양상을 나타낸 6M05A3-40, 6M05A3-55, 6M05A3-58, 6M05A4-06, 6M05A4-69 cDNA 클론은 볼락이 성장함에 따라 발현량이 급격히 감소하여 30개월령 이후에는 발현량이 극소량이었다. Calsequestrin 1 유전자 단편인 6M05A3-89 클론은 6개월령 근육조직에서 발현량이 가장 많았으며, 18개월령 이후 급격히 감소하다가 42개월령 근육조직에서는 발현되지 않았다. 6M05A4-02 클론은 dystrobrevin beta 유전자 단편이었으며, 6개월령 근육조직에서 발현량이 많았고, 18개월령 이후 근육조직에서의 발현량은 극히 미미하였다.
- 선발하여 염기서 열을 분석하였다. Myosin, adenylate kinase, calsequestrin, dystrobrevin beta, diphosphate kinase 유전자는 6개월령 근육조직에서 발현량이 많았으며, desmin, TGFBR2 (transforming growth factor-beta receptor), creatine kinase (muscle type), cathepsin D 유전자는 18개월령 근육조직에서 발현량이 많았다. 볼락의 성장초기와 성장절정기에서 차등발현 양상을 나타낸 유전자는 6, 18, 30, 42 개월령 근육조직에서 연령 증가에 따른 발현양상을 분석하였으며 , dystrobrevin beta와 diphosphate kinase-Z] 은 6개월령 이후에는 발현량이 급격히 감소하여 18개월령, 30개월령 및 42개월령에서는 발현량이 극히 적었으며, creatine kinase (mus(시© type)와 cathepsin D 유전자는 연령 이 증가함에 따라 발현량이 증가되어 18개월령 이후, 30개월령과 42 개월령 근육조직에서도 발현량이 많았다.
- 6M05A4-02 클론은 dystrobrevin beta 유전자 단편이었으며, 6개월령 근육조직에서 발현량이 많았고, 18개월령 이후 근육조직에서의 발현량은 극히 미미하였다. Myosin에 해당하는 6M05A4-71 클론은 6개월령에서 발현량이 많았고, 18개월령 근육조직에서 발현량이 급격히 감소하였으나, 30개월령과 42개월령 근육조직에서는 급격히 증가하는 발현양상을 나타내었다. 18개월령 특이적인 발현양상을 나타낸 creatine kinase (muscle type) 와 cathepsin D에 해 당하는 단편인 18M05A1-22과 18M05A2-09는 성장단계에 따른 특이적 발현량증가 없이 지속적으로 발현량이 높았고, 18M05A1-13 (TGFBR2)과 18M05A2-74 (TCTP) 클론은 성장함에 따라 약 20%의 발현량 감소가 있었다.
- Subtraction 결과로 얻은 차등 발현 유전자 중기 능이 밝혀진 유전자들은 근육의 분화나 수축에 관여하는 근육 대사 관련 유전자와 에너지 대사 관련 유전자들이 있었고, 기능이 밝혀지지 않은 유전자 단편도 있었다. 특히 myosin 유전자의 발현량은 18개월령에서는 적었으나 성장 초기 6개월령 근육조직에서는 많았으며, 모두 myosin light chain인 것으로 나타났다.
- 18개월령 특이적 발현 유전자에는 heat shock protein 90, chaperone protein GP 96, cathepsin, translationally control tumor protein 등의 유전자가 있었으며, 이 시기에는 면역 관련 유전자를 포함하여 외부의 환경변화에 적응에 필요한 유전자들이 발현되는 것으로 추정이 가능하다. 기능이 알려져 있지 않은 유전자의 성장단계에 따른 발현양상 분석 결과와 성장단계 특이적 발현 유전자의 발현양상 재확인을 위하여 실시한 northern blot 분석 결과로부터, 볼락의 성장초기부터 성장의 절정기에 도달시기까지 발현량이 많다가 18개월령 이후 근육조직에는 급속도로 발현량이 감소하는 유전자 그룹이 존재함을 알 수 있다.
- 3). 발현양상은 semi-quantitative RT-PCR 분석 결과와 크게 다르지 않았으며, cDNA clone 6M05A4-기에 해당하는 유전자는 볼락의 성장 초기에 발현량이 많다가 18개월령에는 발현량이 감소하였고, 이후의 성장단계에서는 발현량이 다시 증가하는 패턴을 나타내었다. 6M05A3-61 클론은 성장단계에 따른 발현량 증가는 없었으며, 6M05A4-14 클론은 18개월령 조직에서 발현량이 다소 감소하였으나, 42개월령 조직에서는 발현량이 높았다.
- 본 연구에서도 myosin 등 근육의 수축과 분화에 관련된 유전자는 대체로 성장 초기에 많이 발현되었으며, 근육 내 에너지양을 조절하는 기능을 가진 유전자들은 성장 절정기에 많이 발현되었다. 본 연구수행 결과로 확보한 유전자 정보와 cDNA 클론은 빠른 성장능력을 가진 볼락의 개체 선발을 위한 분자 마커 개발에 유용한 결과이다. 볼락의 근육에서 성장단계에 따라 특이적인 발현양상을 나타냈지만 기능이 정확하게 밝혀지지 않은 유전자 단편에 대한 발현양상 분석을 비롯한 추가적인 연구는 염기서열 분석을 포함하여 유전자의 정보와 기능을 해석하는 접근 방법으로 수행되어야 할 것이다.
- , 1990). 본 연구에서도 myosin 등 근육의 수축과 분화에 관련된 유전자는 대체로 성장 초기에 많이 발현되었으며, 근육 내 에너지양을 조절하는 기능을 가진 유전자들은 성장 절정기에 많이 발현되었다. 본 연구수행 결과로 확보한 유전자 정보와 cDNA 클론은 빠른 성장능력을 가진 볼락의 개체 선발을 위한 분자 마커 개발에 유용한 결과이다.
- Myosin, adenylate kinase, calsequestrin, dystrobrevin beta, diphosphate kinase 유전자는 6개월령 근육조직에서 발현량이 많았으며, desmin, TGFBR2 (transforming growth factor-beta receptor), creatine kinase (muscle type), cathepsin D 유전자는 18개월령 근육조직에서 발현량이 많았다. 볼락의 성장초기와 성장절정기에서 차등발현 양상을 나타낸 유전자는 6, 18, 30, 42 개월령 근육조직에서 연령 증가에 따른 발현양상을 분석하였으며 , dystrobrevin beta와 diphosphate kinase-Z] 은 6개월령 이후에는 발현량이 급격히 감소하여 18개월령, 30개월령 및 42개월령에서는 발현량이 극히 적었으며, creatine kinase (mus(시© type)와 cathepsin D 유전자는 연령 이 증가함에 따라 발현량이 증가되어 18개월령 이후, 30개월령과 42 개월령 근육조직에서도 발현량이 많았다. 이와 같이 성장단계에 따른 차등 발현 유전자를 탐색하고 연령 증가에 따른 발현양상을 비교.
- 이와 같이 성장단계에 따른 차등 발현 유전자를 탐색하고 연령 증가에 따른 발현양상을 비교.분석한 결과로부터 본 연구에서는 어류의 성장 초기 단계 근육조직에서는 근육수축 관련 유전자가 많이 발현되고, 성장 절정기에는 근육 내 에너지 양 조절 관련 유전자가 많이 발현되는 것을 확인하였다.
- 성장단계가 다른 볼락 근육조직으로부터 확보한 차등 발현 유전자들은 근육의 수축, 근섬유 생성, 근육 내 ATP 양을 유지하는 기능과 관련이 있었다. 이와 같은 결과로부터 어류의 근육발달은 성장 초기부터 성장 절정기까지 꾸준히 진행되며, 성장단계에 따라 각각 다른 근육대사 관련 유전자가 관여하여 근육발달을 지속시키는 것을 확인하였다.
- 유지하는 기능과 관련이 있었다. 이와 같은 결과로부터 어류의 근육발달은 성장 초기부터 성장 절정기까지 꾸준히 진행되며, 성장단계에 따라 각각 다른 근육대사 관련 유전자가 관여하여 근육발달을 지속시키는 것을 확인하였다. 근육세포를 배양할 때 myosin 유전자가 많이 발현되며 (Silberstein et al.
- Subtraction 결과로 얻은 차등 발현 유전자 중기 능이 밝혀진 유전자들은 근육의 분화나 수축에 관여하는 근육 대사 관련 유전자와 에너지 대사 관련 유전자들이 있었고, 기능이 밝혀지지 않은 유전자 단편도 있었다. 특히 myosin 유전자의 발현량은 18개월령에서는 적었으나 성장 초기 6개월령 근육조직에서는 많았으며, 모두 myosin light chain인 것으로 나타났다. myosine 근육 수축시 ATPase 활성을 조절하며 (Mugue and Ozernyuk, 2006), adenylate kinase는 세포사멸과 암 발달에 관여하는 것으로 보고되었다 (Chen et al.
후속연구
- 것이다. 또한 볼락의 성장 절정기인 18개월령에 발현량이 많고, 그 후의 성장에서도 발현량이 많은 creatine kinase (muscle type)와 cathepsin D 유전자의 발현양상은 이 유전자를 이용하여 개발한 분자 마커로 볼락의 성장 초기 단계에서 빠른 성장능력을 가진 개체의 선발 가능성을 시사해 준다.
- 본 연구수행 결과로 확보한 유전자 정보와 cDNA 클론은 빠른 성장능력을 가진 볼락의 개체 선발을 위한 분자 마커 개발에 유용한 결과이다. 볼락의 근육에서 성장단계에 따라 특이적인 발현양상을 나타냈지만 기능이 정확하게 밝혀지지 않은 유전자 단편에 대한 발현양상 분석을 비롯한 추가적인 연구는 염기서열 분석을 포함하여 유전자의 정보와 기능을 해석하는 접근 방법으로 수행되어야 할 것이다.
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