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문제 정의
- 따라서 본 연구는 제주에서만 서식하는 토종자원인 제주 흑우의 귀세포를 이용하여 생산된 체세포 핵이식 배반포기배를 자체 개발된 초자화 동결방법으로 -196℃에 냉동 보존하고 일정 시간이 경과한 다음 초간편 1-단계 방법으로 융해하여 곧 바로 수란우 자궁에 이식한 후 체내발생율을 검토함으로써 체세포 핵이식 동결배반포기배를이용한 제주흑우 복제소 생산 가능성 및 동결-융해 방법의 유용성을 조사하고자 실시하였다.
- 5% (25/40)에 비해 약간 낮았으나 유의차는 인정되지 않았다. 본 실험은 5회에 걸쳐서 조사하였다.
제안 방법
- 3. STR (short tandem repeat) profile investigated full DNA fingerprint of elite female Jeju Black Cattle somatic cell (BK94-14, A) and cloned female calf (, !Heuk Woo &mee"z B) using 11 STR markers and amelogerun.
- 공여 체세포는 2007년 제주특별자치도 축산진흥원 소재 제주흑우 우수혈통 종빈우 (BK94-14, 오)의 귀세포를 채취하여 체외에서 배양하여 동결 보관하였던 것으로 4~8 계대의 세포를 사용하였다. 핵이식 시 공여 체세포는 Tryple 용액 (Gibco)으로 처리하" 단일세포로 분리한 후 3% proteinase (Sigma) 용액에 50 초간 처리하고 TCM-HEPES 배양액으로 3번 세척한 후 10 um 크기의 체세포를 골라 핵이 제거된 수핵 난자의 투명询와 세포질 사이의 공간에 이식하였다. 체세포가 주입된 난자는 0.
- 완전히 섞이도록 하였다. 1-단계 융해 후 체외발달율을 조사하기 위한 대조군은 LN2 vapor 노줄을 제외한 초자화 동결 전-처리용액과 1-단계 융해액에 순차적으로 처리한 후 배양액으로 최종 세척한 다음 공-배양함으로써 동결-융해 처리용액의 독성 유무를 조사하였다.
- 각각의 검사 샘플에서 유전물질인 DNA 를 추출하고, 특정 유전자를 동시에 증폭하여, 여러 유전자 좌위에서 핵이식용 체세포와 복제송아지가 일치하는지 여부를 조사하였다. ISAG (International. Society of Animal Genetics, 국제동물유전학회) 11개의 친자 감별 표지 인자들을 사용하여 TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225 및 BM1824 각 primer 의 forward 에 형광 dye 를 labeling 하고 PCR을 실시하였다. 검체의 PCR 산물은 형광을 분석하는 3, 100 genetic analyzer 기기를 이용하여 샘플 별로 peak 크기를 계산하고, 각각의 표지 인자들의 반복성을 조사하여 검사한 모든 유전자 좌위에서 일치할 경우 친자로' 3개 이상의 유전자 좌위에서 불일치할 경우 친자가 아니라고 핀.
- 수란우의 임신 진단은 동결-융해된 복제 수정란 이식 후 45일째에 직장 검사법에 의하여 임신 여부를 진단하였다. 분만 시기가 가까이 올 1。~20일 전부터 수란 우의 분만 징후를 관찰하고, 적절한 시기에 정상적인 분만이 이루어지도록 유도하였다.
- 실시하였다. 각각의 검사 샘플에서 유전물질인 DNA 를 추출하고, 특정 유전자를 동시에 증폭하여, 여러 유전자 좌위에서 핵이식용 체세포와 복제송아지가 일치하는지 여부를 조사하였다. ISAG (International.
- Society of Animal Genetics, 국제동물유전학회) 11개의 친자 감별 표지 인자들을 사용하여 TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA23, ETH3, ETH225 및 BM1824 각 primer 의 forward 에 형광 dye 를 labeling 하고 PCR을 실시하였다. 검체의 PCR 산물은 형광을 분석하는 3, 100 genetic analyzer 기기를 이용하여 샘플 별로 peak 크기를 계산하고, 각각의 표지 인자들의 반복성을 조사하여 검사한 모든 유전자 좌위에서 일치할 경우 친자로' 3개 이상의 유전자 좌위에서 불일치할 경우 친자가 아니라고 핀.명하였다.
- 그러나 앞서 소개한 두 방법 모두 필드에서 바로 적용하기는 어려운 실정이어서 본 연구에서 보고한 내용이야말로 처음으로 필드 적용 동결 방법에 의한 복제소 생산 예라고 할 수 있다. 본 연구의 차별성은 이식용 스트로를 이용해서 초자화 동결을 실시하고「단계 융해하여 (1분 소요) 바로 이식하는 최 단시간 이식 간편법으로 필드 어디에서나 환경의 제약 없이 이용할 수 있는 유용한 방법이다.
- 수란우 준비는 CIDR-PLUS를 질 내 7일간 삽입하고 제거하는 당일 PGF2a 25 mg을 투여하는 방법으로 발정 동기화를 유도하였다. 스트로 내에서 단계로 융해된 체세포 핵이식 배반포기배는 발정 동기화 처리된 대상우 중정 상적인 발정을 보이고, 이식 당일 (발정 발현 7~8일째) 직장 검사를 통하여 황체 상태가 양호한 개체를 선발하여 황체가 존재하는 자궁각에 곧 바로 이식되었으며, 700 회 이상 수정란이식 경험을 가진 전문기술자 2명에 의해 수행되었다.
- 스트로 내에서 단계로 융해된 체세포 핵이식 배반포기배는 발정 동기화 처리된 대상우 중정 상적인 발정을 보이고, 이식 당일 (발정 발현 7~8일째) 직장 검사를 통하여 황체 상태가 양호한 개체를 선발하여 황체가 존재하는 자궁각에 곧 바로 이식되었으며, 700 회 이상 수정란이식 경험을 가진 전문기술자 2명에 의해 수행되었다. 수란우의 임신 진단은 동결-융해된 복제 수정란 이식 후 45일째에 직장 검사법에 의하여 임신 여부를 진단하였다. 분만 시기가 가까이 올 1。~20일 전부터 수란 우의 분만 징후를 관찰하고, 적절한 시기에 정상적인 분만이 이루어지도록 유도하였다.
- 도축장에서 채취한 난소를 2~4시간 이내에 32~37℃ 생리 식염수에 유지하여 실험실로 운반한 뒤 직경 2~6 nun의 난포로부터 채취하여 사용하였다. 실체현미경 하에서 획득된 미성숙난자는 난구세포가 부착되어 있고 세포질이 균일한 난자만을 선별하였으며, TL-HryPES로 세척하여 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)가 첨가된 TCM-199 (Gibco-BRL) 배양액에 0.2 mM Na-pyruvate (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 pg/ml FSH (Sigma), 1 p g/ml estradiol-17 (Sigma) 50 p g/ml gentamydn (Sigma)를 넣어 38.8 ℃, 5% CQ 조건하에서 20시간 동안 체외 배양하여 성숙을 유도하였다.
- Sigma)을 혼합하여 사용하였다. 체세포 핵이식 배반포기배를 동결하기 전에 10% G가 첨가된 D-PBS (+10% FBS) 에서 5분, 10% G (v/v) 와 20% EG (v/v) 가 첨가된 D-PBS (+10% FBS)에서 5분씩 순서대로 처리하여 탈 수화평형을 유도한 후 피펫을 사용하여 25% G와 25% EG가 혼합된 D-PBS (+FBS)에 20~30초간 노출시킨 후 0.25 ml French 미니 스트로에 장착하고 열 봉입하였다. 제작된 스트로는 LN2 vapor에 3분간 노출하여 냉각시킨 후 -196 ℃ LN2에 바로 침지하였다.
- 핵이식 시 공여 체세포는 Tryple 용액 (Gibco)으로 처리하" 단일세포로 분리한 후 3% proteinase (Sigma) 용액에 50 초간 처리하고 TCM-HEPES 배양액으로 3번 세척한 후 10 um 크기의 체세포를 골라 핵이 제거된 수핵 난자의 투명询와 세포질 사이의 공간에 이식하였다. 체세포가 주입된 난자는 0.3 M mannitol (Sigma) 용액 내에서 LF101 Electro Cell Fusion Generator (NEPA GENE, Shioyaki, Japan)을 사용하여 직류 22 volt句서 1 pulse로 세포 융합을 실시하였으며, 세포융합 여부는 30분 후에 관찰하였다. 융합이 확인된 핵이식란은 5 pM Ca-iono- phore (Sigma) 에 5분 노줄시키고, 2.
- 체외성숙된 소 수핵 난자는 0.1% hyaluronidase (Sig- ma)가 첨가된 TL-HEPES 배양액에서 난구세포를 제거한 뒤 제 1극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다. 탈핵될 난자는 7.
- 초자화 동결-융해된 체세포 핵이식 배반 포기 배로부터 태어난 소의 복제 유무를 검정하기 위해 핵이식에 이용된 체세포 (BK94-14)와 복제송아지 귀세포의 유전자 검정을 실시하였다. 각각의 검사 샘플에서 유전물질인 DNA 를 추출하고, 특정 유전자를 동시에 증폭하여, 여러 유전자 좌위에서 핵이식용 체세포와 복제송아지가 일치하는지 여부를 조사하였다.
- 1% hyaluronidase (Sig- ma)가 첨가된 TL-HEPES 배양액에서 난구세포를 제거한 뒤 제 1극체가 방출된 난자만을 선별하여 사용하였다. 탈핵될 난자는 7.5 ug/ml cytochalasin B (Sigma) 가 첨가된 TCM-HEPES 배양액 소적으로 옮겨 Oocyte Imaging System (CRi) 카메라를 blinking 옵션으로 지정한 후 핵의 위치를 확인하여 탈핵하였다. 공여 체세포는 2007년 제주특별자치도 축산진흥원 소재 제주흑우 우수혈통 종빈우 (BK94-14, 오)의 귀세포를 채취하여 체외에서 배양하여 동결 보관하였던 것으로 4~8 계대의 세포를 사용하였다.
- 0 mM DMAP (Sig- ma)에서 3시간 동안 배양하여 난활성을 유도하였다. 핵이식 후 활성화 처리된 난자는 3 mg/ml FAF-BSA (Sig- ma)가 들어있는 CRlaa 배양액에 옮겨 배양하고, 배양 48시간째 분열된 핵이식 배아는 동일 개체의 체세포로 단층 배양이 유도된 10 pl 소적에서 1 11 g/ml Epidermal growth factor (Bio-Research Product, Inc, North Liberty, Iowa), 1 y g/ml Insulin-like growth factor (Bio-Research Product), 10 pM flavonoid (3, 4'-Dihydroxyflavone; INDOFINE Chemical Co., Inc, Hillsborough, 1噸)와 10% FBS가 들어있는 CRlaa 배양액으로 공동 배양함으로써 배 발생을 유도하였다.
대상 데이터
- 2. One hundred and one day-old aged cloned female Jeju Black Cattle "Heuk Woo Sunee" (Birth date; Oct 31, 2010).
- Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS, Gibco) 에 10% FBS를 첨가하여 기본 용액으로 사용하였으며, 초 자화 동결 용액은 glycerol (G, Sigma)과 ethylene glycol (EG, Sigma)을 혼합하여 사용하였다. 체세포 핵이식 배반포기배를 동결하기 전에 10% G가 첨가된 D-PBS (+10% FBS) 에서 5분, 10% G (v/v) 와 20% EG (v/v) 가 첨가된 D-PBS (+10% FBS)에서 5분씩 순서대로 처리하여 탈 수화평형을 유도한 후 피펫을 사용하여 25% G와 25% EG가 혼합된 D-PBS (+FBS)에 20~30초간 노출시킨 후 0.
- 5 ug/ml cytochalasin B (Sigma) 가 첨가된 TCM-HEPES 배양액 소적으로 옮겨 Oocyte Imaging System (CRi) 카메라를 blinking 옵션으로 지정한 후 핵의 위치를 확인하여 탈핵하였다. 공여 체세포는 2007년 제주특별자치도 축산진흥원 소재 제주흑우 우수혈통 종빈우 (BK94-14, 오)의 귀세포를 채취하여 체외에서 배양하여 동결 보관하였던 것으로 4~8 계대의 세포를 사용하였다. 핵이식 시 공여 체세포는 Tryple 용액 (Gibco)으로 처리하" 단일세포로 분리한 후 3% proteinase (Sigma) 용액에 50 초간 처리하고 TCM-HEPES 배양액으로 3번 세척한 후 10 um 크기의 체세포를 골라 핵이 제거된 수핵 난자의 투명询와 세포질 사이의 공간에 이식하였다.
- 도축장에서 채취한 난소를 2~4시간 이내에 32~37℃ 생리 식염수에 유지하여 실험실로 운반한 뒤 직경 2~6 nun의 난포로부터 채취하여 사용하였다. 실체현미경 하에서 획득된 미성숙난자는 난구세포가 부착되어 있고 세포질이 균일한 난자만을 선별하였으며, TL-HryPES로 세척하여 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)가 첨가된 TCM-199 (Gibco-BRL) 배양액에 0.
데이터처리
- 초자화 동결 후 1-단계 융해된 체세포 핵이식 배반포기배의 생존율에 대한 결과는 SAS program을 이용하여 분석하였으며, 처리군 간 유의성은 Duncan怎 multiple range test를 이용하여 검정하였다.
이론/모형
- 본 실험에 공시될 도축된 소 난소로부터 난자의 회수 및 체외성숙은 Kim 등 (2010)의 방법에 준하여 실시하였다. 도축장에서 채취한 난소를 2~4시간 이내에 32~37℃ 생리 식염수에 유지하여 실험실로 운반한 뒤 직경 2~6 nun의 난포로부터 채취하여 사용하였다.
성능/효과
- 초자화 동결 배반포기배의 1■.단계 융해 후 간편 이식 방법으로 태어난 복제 송아지의 귀세포와 복제수정란 생산에 이용된 공여 제주흑우 씨암소의 체세포를 11개의 STR 마커로 친자 감별 유전자 분석을 실시한 결과, 복제 송아지와 공여된 제주흑우 체세포 간에 11 개의 microsatellite loci에서 모두 완벽하게 유전자형이 일치하였으며, 성별도 동일한 암컷으로 확인되었다 (Fig. 3).
- 따라서: 본 연구에서 개발된 초자화 동결과 1-단계 융해 및 직접 이식 기술은 체세포 핵이식 배반포기배뿐만아니라 체내 .외 수정란 활용에 효과적으로 이용될 수 있을 것이며, 제주흑우의 대량 증식 기술 개발 및 산업화의 기반 기술 구축뿐만 아니라 구제역 등 예견되지 않는 자연환경 질환으로 인해 사라지는 우수 종 보존과 멸종 위기의 우수 혈통 복원에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 본 연구는 우수 혈통 제주흑우 복제소를 생산함에 있어서 체세포 핵이식 배반포기 배아를 초자화 동결 보존해 두었다가 수란우가 준비되는 시점에 맞추어서 초간편 1-단계 융해 방법으로 녹이고, 수란우 자궁에 곧 바로 이식하는 전형적인 필드용 동결-융해 방법으로 복제 송아지 생산이 가능함을 나타낸다.
- 더욱이 이번에 생산된 제주흑우 복제 암소는 제왕절개 시술로 태어났던 두 복제 씨수소와 달리 임신 299일째 자연분만으로 태어났으며, 체중은 36 kg이었다. 빠른 회복으로 분만 20분 후에 바로 서서 어미젖을 빨았고, 이유기를 거쳐 현재 4달째 정상적인 성장을 보이고 있다.
- 1에 제시된 바와 같다. 액체질소에 노출 없이 초자화 동결 전- 처리용액과 1-단계 융해액 [슈크로즈와 초자화 동결액 (9:1) 혼합액]에만 단계적으로 처리한 대조군과 초자화 동결/L 단계융해 처리군에서 회수된 복제수정란을 체외배양환경에서 48시간 동안 배양하였을 때, 처리군에서 융해 후 생존율은 84.6% (33/39)였으며, 생존 배반포기배 (Fig. 1A) 중 부화 배반포기배 (Fig. IB)로의 발달율은 56.4% (22/39)로 대조군 62.5% (25/40)에 비해 약간 낮았으나 유의차는 인정되지 않았다. 본 실험은 5회에 걸쳐서 조사하였다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 본 연구진은 체세포 핵이식, 배양 환경, 동결. 융해, 이식, 임신 유지 및 관리 등 체세포 복제소 생산에 필요한 모든 기술 및 제반 환경을 두루 갖추고 있으며, 현존하는 씨수소와 현존하지 않은 씨수소 복제에 성공한 데 이어, 현존하지 않은 씨암소 복제이면서 더불어 초급속동결-간편융해에 따른 직접 이식기술 접목으로 멸종 위기의 제주흑우의 대량증식 기술개발 및 산업화를 위한 귀중한 연구 기반을 확립한 것으구.
- (Park, 2008). 이러한 안정된 동결-융해 기술을 바탕으로 본 연구에서는 2007년에 냉동 보관해둔 제주특별자치도 죽산진흥원 보유의 제주흑우 암소 (BK94-14, 우, 1994년 7월 25 일 출생, 2008년 12월 5일 도축)의 귀 체세포를 이용해 핵이식 배반포기배를 생산하고 2개씩을 각 스트로에 장착하여 초자화 동결 방법으로 보관해 두었다가, 그 중 일부를 초간편 융해법으로 녹인 후 이식하여, 현존하지 않는 최우량 혈통 제주흑우 씨암소 종을 복원하는데 성공하였다.
- 이번에 개발된 초자화 동결/1-단계 융해 후 직접 이식기술 방법의 유용성 및 안전성은 이미 본 연구팀이 체외수정란을 이용한 선행연구로서 제주도 일부 농장에서 시행한 한우 엘리트 송아지 생산 시도에서 40% 분만율 (4/10)을 획득하여 그 가능성을 확인한 바 있다. (Park, 2008).
- 복제 송이!지와 제주흑우 씨암소 공여체세포 간에 11개의 microsatellite loci에서 모두 완벽하게 유전자형이 일치되었으며, 성별도 동일한 암컷으로 확인되어 본 연구에서 생산된 송아지가 BK94-14 유래 복제소임이 증명되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 초자화 동결-초간편 융해 방법은 체세포 핵이식 배아의 유용성을 높여 산업화할 수 있는 기반 조성에 매우 귀중한 기술로 여겨져, 현재 우수혈통복원을 위한 복제소 생산 연구에서 추가적인 동결 복제 수정란의 이식연구를 진행 중에 있다.
- 초자화 동결 체세포 핵이식 배반포기를 1-단계 융해 방법으로 녹인 후 곧 바로 발정동기화가 유도된 5 마리의수란우 자궁에 이식한 결고}, 한 마리의 수란우에서 이 식후 45일째 정상임신이 확인되었다. 이후 정상 임신 기간보다 2주 가량 경과하여 299일 째에 제주흑우 씨암소 체세포 핵이식 복제 송아지가 성공적으로 자연분만 되었고 생시체중은 36 kg이었다« 또한, 복제 송아지 "흑우순이” 는 101일째 (2011년 2월 9일 현재) 체중은 85 kg으로 건강하게 성장하고 있다.
후속연구
- 증명되었다. 따라서 본 연구에서 개발된 초자화 동결-초간편 융해 방법은 체세포 핵이식 배아의 유용성을 높여 산업화할 수 있는 기반 조성에 매우 귀중한 기술로 여겨져, 현재 우수혈통복원을 위한 복제소 생산 연구에서 추가적인 동결 복제 수정란의 이식연구를 진행 중에 있다.
- 체내 .외 수정란 활용에 효과적으로 이용될 수 있을 것이며, 제주흑우의 대량 증식 기술 개발 및 산업화의 기반 기술 구축뿐만 아니라 구제역 등 예견되지 않는 자연환경 질환으로 인해 사라지는 우수 종 보존과 멸종 위기의 우수 혈통 복원에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 배양 환경, 동결. 융해, 이식, 임신 유지 및 관리 등 체세포 복제소 생산에 필요한 모든 기술 및 제반 환경을 두루 갖추고 있으며, 현존하는 씨수소와 현존하지 않은 씨수소 복제에 성공한 데 이어, 현존하지 않은 씨암소 복제이면서 더불어 초급속동결-간편융해에 따른 직접 이식기술 접목으로 멸종 위기의 제주흑우의 대량증식 기술개발 및 산업화를 위한 귀중한 연구 기반을 확립한 것으구... 사료된다.
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