[국내논문]사람피부섬유아세포에서 산화적 스트레스에 대한 항산화 활성을 가진 spermidine의 억제효과 Inhibitory Effect of Spermidine with Antioxidant Activity on Oxidative Stress in Human Dermal Fibroblasts원문보기
Spermidine은 spermine의 전구체로 역할을 하는 putrescine로부터 합성되는 polycation의 한 형태이다. 최근에 spermidine는 수명연장에 중요한 역할을 하는 하나의 polyamine으로 알려져 있다. Hydroxyl radical, superoxide 및 hydrogen peroxide와 같은 활성산소(ROS)는 노화뿐만 아니라 다양한 병원성 과정에서 관여한다고 보고되고 있다. DPPH radical, $H_2O_2$ 및 hydroxyl radical에 대한 spermidine의 소거활성과 산화적 스트레스와 관련된 DNA oxidation에 대한 보호 효과가 in-vitro에서 평가되었다. Spermidine은 500 ${\mu}M$ 이상에서 DPPH radical와 $H_2O_2$에 대한 소거 효과를 보여주었다. 특히 활성산소종 중에서 spermidine는 hydroxyl radical에 대한 효과가 탁월하였다. 뿐만 아니라, spermidine는 500 ${\mu}M$에서 DNA oxidation에 대해서도 뚜렷한 보호 효과를 나타내었다. 더욱이 사람피부섬유아세포에서 superoxide dismutase와 같은 항산화 관련 단백질의 발현이 대조군과 비교시 spermidine 존재 하에 증가하였다. 이상의 결과로부터 spermidine은 암, 노화 및 염증을 포함하는 활성산소와 관련 있는 질병들을 예방하기 위한 항산화제로 이용될 수 있을 것이다.
Spermidine은 spermine의 전구체로 역할을 하는 putrescine로부터 합성되는 polycation의 한 형태이다. 최근에 spermidine는 수명연장에 중요한 역할을 하는 하나의 polyamine으로 알려져 있다. Hydroxyl radical, superoxide 및 hydrogen peroxide와 같은 활성산소(ROS)는 노화뿐만 아니라 다양한 병원성 과정에서 관여한다고 보고되고 있다. DPPH radical, $H_2O_2$ 및 hydroxyl radical에 대한 spermidine의 소거활성과 산화적 스트레스와 관련된 DNA oxidation에 대한 보호 효과가 in-vitro에서 평가되었다. Spermidine은 500 ${\mu}M$ 이상에서 DPPH radical와 $H_2O_2$에 대한 소거 효과를 보여주었다. 특히 활성산소종 중에서 spermidine는 hydroxyl radical에 대한 효과가 탁월하였다. 뿐만 아니라, spermidine는 500 ${\mu}M$에서 DNA oxidation에 대해서도 뚜렷한 보호 효과를 나타내었다. 더욱이 사람피부섬유아세포에서 superoxide dismutase와 같은 항산화 관련 단백질의 발현이 대조군과 비교시 spermidine 존재 하에 증가하였다. 이상의 결과로부터 spermidine은 암, 노화 및 염증을 포함하는 활성산소와 관련 있는 질병들을 예방하기 위한 항산화제로 이용될 수 있을 것이다.
Spermidine is a ubiquitous polycation that is synthesized from putrescine, which serves as a precursor of spermine. In recent years, spermidine was found to be a polyamine that plays an important role in longevity. Reactive oxygen species (ROS) such as hydroxyl radical, superoxide and hydrogen perox...
Spermidine is a ubiquitous polycation that is synthesized from putrescine, which serves as a precursor of spermine. In recent years, spermidine was found to be a polyamine that plays an important role in longevity. Reactive oxygen species (ROS) such as hydroxyl radical, superoxide and hydrogen peroxide have been shown to be involved in various pathogenic processes as well as aging. The direct scavenging effect of spermidine on DPPH radical, $H_2O_2$ and hydroxyl radical, and its protective effect against DNA oxidation related to oxidative stress were evaluated in vitro. It was observed that spermidine exhibits scavenging activities on DPPH radical and H2O2 above 500 ${\mu}M$. Spermidine was especially effective in exerting a scavenging activity on hydroxyl radical. In addition, spermidine at 1000 ${\mu}M$ showed a clear protective effect against DNA oxidation. Furthermore, the expression level of anti-oxidant enzymes such as superoxide dismutase in humam dermal fibroblasts increased in the presence of spermidine compared with blank group. These results suggest that spermidine can be used as an antioxidant to prevent ROS-related diseases including inflammation, cancer and aging.
Spermidine is a ubiquitous polycation that is synthesized from putrescine, which serves as a precursor of spermine. In recent years, spermidine was found to be a polyamine that plays an important role in longevity. Reactive oxygen species (ROS) such as hydroxyl radical, superoxide and hydrogen peroxide have been shown to be involved in various pathogenic processes as well as aging. The direct scavenging effect of spermidine on DPPH radical, $H_2O_2$ and hydroxyl radical, and its protective effect against DNA oxidation related to oxidative stress were evaluated in vitro. It was observed that spermidine exhibits scavenging activities on DPPH radical and H2O2 above 500 ${\mu}M$. Spermidine was especially effective in exerting a scavenging activity on hydroxyl radical. In addition, spermidine at 1000 ${\mu}M$ showed a clear protective effect against DNA oxidation. Furthermore, the expression level of anti-oxidant enzymes such as superoxide dismutase in humam dermal fibroblasts increased in the presence of spermidine compared with blank group. These results suggest that spermidine can be used as an antioxidant to prevent ROS-related diseases including inflammation, cancer and aging.
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문제 정의
그러나 spermidine이 항산화 관련 기능적 소재로 입증되기 위해서는 보다 많은 자료의 추가가 필요한 실정이다. 그러므로 본 연구에서는 spermidine의 항산화 효과와 그 작용기전을 구체적으로 알아보고 spermidime을 항산화제로 기능성 바이오 소재로 개발하는 자료로 활용하고자 본 연구를 수행 하였다.
본 실험에서는 spermidine이 세포성장에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 세포 독성 유, 무를 조사하였다. MTT assay를 이용하여 spermidine의 세포 독성 효과를 조사하였다.
특히 spermidine은 DNA 합성 과정에서 중요한 역할을 하여 효소 활성에 영향을 주어 핵산 의 생합성을 조절하고 세포질 분열을 촉진하고 세포막의 안정화, 새포 내 물질 대사 조절 등 다양한 역할을 수행 한다[6,10]. 본 논문에서는 Polyamine 중 하나인 spermidine의 산화적 스트레스에 대해서 어떻게 작용하고 조절하는지 조사하였다. In-vitro에서 DPPH radical은 화학적으로 안정성을 가지는 자유 라디칼을 가지고 있으며, 항산화 활성이 있는 물질을 만나면 전자를 내주면서 라디칼이 소멸된다.
제안 방법
그 후, 15 μl의 1.25 mM ABTS 및 30 μl의 peroxidase 37℃에서 10 min 동안 반응시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였으며 항산화 활성은 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
Gel은 1 mg/ml ethidium bromide로 염색하여 물로 세척하여 UV로 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
1 μg의 DNA를 포함하는 20 μl의 반응혼합물을 1% agarose gel에서 100 V로 30 min 동안 전기영동 하였다.
먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험농도의 spermidine, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
그 다음, 15:1 비율의 n-butanol:pyridine 용액을 500 μl 첨가하고 1,000× g에서 10 min 동안 원심분리 하여 상등액을 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며 지질과산화 정도는 시료 첨가 전후의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
Spermidine을 125, 250, 500 및 1,000 μM의 농도가 되게 linolenic acid emulsion과 혼합한 후 0.8 mM H2O2 및 0.8 mM FeSO4를 혼합한 용액을 5 hr 동안 반응 시킨 후 0.4% TBA를 첨가하고 95℃에서 2 hr 동안 반응시켜 실온에서 10 min 동안 반응시켰다.
Brand-Williams [4,16] 실험방법을 변형하여 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 spermidine의 소거능력을 측정하였다. 시험농도의 spermidine를 DPPH 용액을 가하여 10 sec 동안 잘 혼합한 다음, 실온에서 20 min 동안 반응시킨 후 525 nm에서 흡광도를 측정하였다.
Chung 등 [37]의 실험방법을 변형하여 hydroxyl radical을 측정하였다. 50 μl의 10 mM FeSO4와 50 μl의 10 mM H2O2를 이용한 Fenton 반응으로 hydroxyl radical를 발생시켰다.
여기에 10% TCA (trichloroacetic acid) 용액을 1 ml 가하여 13,500× g에서 15 min 동안 원심분리하여 상등액 1 ml에 증류수 및 ferric chloride 각 1 ml을 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 환원력은 시료첨 가군과 대조군의 흡광도 비를 % 값으로 환산하였다.
10 μg의 세포용출액을 10% Tris–HCl gel에서 전기영동 후 단백질을 전기적으로 nitrocellulose membrane으로 전이시켰다. 그 다음 10% skim milk를 nitrocellulose membrane에 전 처리하고 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-Nrf2, anti-SOD-1, anti-SOD-2, anti-SOD-3, anti-beta-actin)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, chemiluminescent ECL kit (Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 목적단백질을 검출하였다. Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
Western blot의 band는 LAS3000® image analyzer (Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)를 이용하여 관찰하였다.
1A에서 보는 바와 같이 spermidine을 125, 250, 500, 1000 μM의농도로 처리한 결과 DPPH radical 소거능은 500, 1000 μM에서 농도가 증가함에 따라 소거 효과의 증가를 관찰 할 수 있었다. 그 다음 spermidine의 H2O2 소거능을 확인하기 위하여 Hydrogen peroxide scavenging assay를 수행 하였다. 양성 대조군은 동일하게 0.
In vitro에서 지질과산화에 대한 spermidine에 의한 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시켰다. 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질과산화 확인을 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 0.
사람피부섬유아세포로 부터 분리한 genomic DNA를 이용하여 Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상에 대한 spermidine의 보호 효과를 조사 하였다. 대조군의 genomic DNA는 Fig.
본 실험에서는 spermidine이 세포성장에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 세포 독성 유, 무를 조사하였다. MTT assay를 이용하여 spermidine의 세포 독성 효과를 조사하였다. Fig.
항산화 효소의 발현을 조절하는데 가장 중요한 전사인자인 Nrf2와 이 전사인자에 의하여 발현되는 3종류의 superoxide dismutase (SOD)인 항산화 효소의 단백질 발현에 대한 spermidine이 영향을 조사하였다. Fig.
Hydroxyl radical 은 생체 내에서 DNA와 결합하여 돌연변이 및 세포 독성을 유발 하며 생성되는 자유 라디칼을 활성화 시키며 모든 세포에 손상을 준다[26]. spermidine이 DNA의 hydroxyl radical에 대한 보호 효과를 알아 보기 위하여 먼저 HDFs로 부터 genomic DNA를 분리하여 연구를 진행하였다. Spermidine의 농도가 증가 할수록 hydroxyl radical에 의한 산화적 스트레스로부터 DNA의 보호 효과가 탁월한 것으로 확인 되었다.
대상 데이터
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin/amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL (Grand island, NY, USA)로 부터 구입하였다.
세포배양을 위한 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM), Trypsin-EDTA, penicillin/streptomycin/amphotericin (각각 10,000 U/ml, 10,000 μg/ml 및 2,500 μg/ml), fetal bovine serum (FBS) 시약은 Gibco BRL (Grand island, NY, USA)로 부터 구입하였다. 사람피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts, HDFs)는 ㈜ LG 생활건강 기술원으로 부터 제공받았다. MTT reagent, gelatin, agarose와 spermidine 기타시약은 Sigma Chemical Co.
사람피부섬유아세포(Human Dermal Fibroblasts, HDFs)는 ㈜ LG 생활건강 기술원으로 부터 제공받았다. MTT reagent, gelatin, agarose와 spermidine 기타시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)로 부터 구입하였다.
DPPH radical 소거법은 항산화 물질의 전자공여능으로 인해 방향족 화합물 및 방향족 아민류에 의해 환원되어 자색이 탈색에 의해 나타내는 정도를 지표로 하여 항산화 능력을 측정하는 방법이다. 이 실험에서 양성 대조군으로는 항산화 효능이 잘 알려진 0.001%의 vitamin C를 사용 하였다. Fig.
그 다음 spermidine의 H2O2 소거능을 확인하기 위하여 Hydrogen peroxide scavenging assay를 수행 하였다. 양성 대조군은 동일하게 0.001%의 vitamin C를 사용하였다. Fig.
데이터처리
각 실험은 3회 이상 반복실험을 통하여 그 결과를 얻어 각각의 시료농도에 대해 평균±표준편차로 나타내었다.
각 시료농도군에 대한 유의차 검정은 대조군과 비교하여 Student’s t test 한 후 p<0.05 값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 간주하였다.
이론/모형
Oyaizu [32]의 방법에 따라 측정하였다. 시료 1 ml에 pH 6.
Hansen [13]의 방법에 따라 HDFs에 대한 spermidine의세포독성을 MTT (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 이용하여 측정하였다.
Genomic DNA는 약간 변형된 표준 과정에 따라 HDFs (human dermal fibroblasts) 세포로부터 추출 하였다[35]. Fenton 반응에 의하여 발생된 hydroxyl radical에 노출된 DNA 산화는 기존에 실험된 방법에 따라 수행되었다[28]. 먼저 100 μl의 DNA 용액에 시험농도의 spermidine, 200 μM FeSO4, 1 mM H2O2 및 50 μg/ml genomic DNA를 첨가하였다.
성능/효과
Spermidine를 각 농도별로 처리한 결과 500 μM의 이하의 농도에서는 환원력이 없는 것으로 나타났으나, 1,000 μM의 농도에서는 대조군과 비교하여 환원력에서 유의성이 있는 것으로 관찰 되었다(p<0.05).
Fig. 1A에서 보는 바와 같이 spermidine을 125, 250, 500, 1000 μM의농도로 처리한 결과 DPPH radical 소거능은 500, 1000 μM에서 농도가 증가함에 따라 소거 효과의 증가를 관찰 할 수 있었다.
1B에서 spermidine을 125, 250, 500, 1000 μM로 처리하여 농도 의존적으로 소거능이 증가함을 확인 할 수 있었다. Spermidine의 hydroxyl radical 소거능을 확인한 결과 Fig. 1C에서 spermidine을 처리 하였을 때 농도가 증가함에 따라 유의성 있게 hydroxyl radical 소거능이 증가함을 확인 할 수 있었다. 항산화 능력에서 중요한 화합물의 환원력은 항산화제로부터 제공되는 수소 원자가 free radical과 반응하여 시작된다.
Hydroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상이 1,000 μM의 농도의 spermidine에 의하여 40% 정도 억제되는 것으로 관찰되었다.
따라서, 1,000 μM 이하의 농도에서 spermidine은 본 연구에서 사용된 사람피부섬유아세포에 대하여 안전하다는 것을 나타낸다.
In vitro에서 지질과산화에 대한 spermidine에 의한 항산화 효과를 조사하기 위하여 linolenic acid를 Fenton반응으로 발생시킨 hydroxyl radical에 노출시켰다. 먼저 hydroxyl radical에 의한 지질과산화 확인을 위하여 기존에 알려진 친유성 항산화제인 0.01%의 vitamin E의 지질과산화에 대한 억제효능을 평가한 결과, Fig. 2에서 보여지는 바와 같이 30%의 지질과산화 억제효과가 관찰되었다. Spermidine 처리군은 대조군과 비교 시 500 μM 이하의 농도에서는 지질과산화에 대한 효능에서 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
SOD-2와 SOD-3는 125 μM의 spermidine의 존재 하에서 발현되고 농도를 증가 시 발현이 감소되는 것으로 나타났다. 이상의 결과에서 spermidine는 전사인자인 Nrf2와는 독립적으로 대조군에 비하여 SOD의 발현을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
In-vitro에서 DPPH radical은 화학적으로 안정성을 가지는 자유 라디칼을 가지고 있으며, 항산화 활성이 있는 물질을 만나면 전자를 내주면서 라디칼이 소멸된다. 본 실험에서는 대조군 비하여 spermidine을 첨가한 실험군에서 농도가 증가 할수록 DPPH radical 소거능이 증가함을 확인 할 수 있었다. 뿐만 아니라 fenton 반응으로 생성된 hydroxyl radical과 hydrogen peroxide도 spermidine에 의해 감소됨을 확인 할 수 있었다.
본 실험에서는 대조군 비하여 spermidine을 첨가한 실험군에서 농도가 증가 할수록 DPPH radical 소거능이 증가함을 확인 할 수 있었다. 뿐만 아니라 fenton 반응으로 생성된 hydroxyl radical과 hydrogen peroxide도 spermidine에 의해 감소됨을 확인 할 수 있었다. 이것은 spermidine은 생리적 pH에서 양이온의 성질을 가지는 polycation으로 존재하며 음이온으로 하전된 부위와 결합 할 수 있다.
spermidine이 DNA의 hydroxyl radical에 대한 보호 효과를 알아 보기 위하여 먼저 HDFs로 부터 genomic DNA를 분리하여 연구를 진행하였다. Spermidine의 농도가 증가 할수록 hydroxyl radical에 의한 산화적 스트레스로부터 DNA의 보호 효과가 탁월한 것으로 확인 되었다. 이것은 spermidine이 핵산의 음전하를 가진 인산기와 강하게 결합하여 hydroxyl radical로부터 DNA를 보호 한다 다는 것을 알 수 있었다[29].
superoxide dismutases, catalases 및 glutathionine peroxidase와 같은 효소에 의해서 세포가 활성산소에 노출되었을 때 세포 내 radical이 제거 된다[20,24,25]. 항산화에 중요한 전사인자인 Nrf2로 조절 되는 SOD-1과 SOD-2, SOD-3의 발현 정도를 조사한 결과 spermidine는 전사인자인 Nrf2와는 독립적으로 SOD의발현을 증가시키는 것으로 나타났는데, 이는 사람 피부섬유아 세포에서 spermidine은 적정농도에서 SOD-1, SOD-2 및 SOD-3의 발현을 증가시켜 항산화 효과를 나타낼 수 있다는 것을 암시하고 있다. 이전의 연구에서도 spermidine이 항산화 효소에 영향을 줄 수 있다고 보고하였는데, 이러한 결과는 본 연구결과와 상충된다[38].
후속연구
그러므로 이러한 작용 기전에 의하여 spermidine이 산화적 스트레스에 의한 질병을 예방 할 수 있는 하나의 근거 될 수 있다. 본 연구 결과를 바탕으로 spermidine의 항산화 효과를 통해 우수한 생리 활성 소재로서 기능성 건강 식품 개발에 이바지 할 수 있다고 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
spermidine이 항산화, 항노화, 세포 성장 과정에 관여하는 기능 이외 어떤 역할을 하고 있다고 보고되고 있는가?
Spermidine은 spermine, putrescine과 함께 polyamine에 속하며, 사람의 정자와 포도 열매에서 많이 발견되는 선형 분자로서 세포성장, 성숙, 항노화 및 항산화 과정에 많이 관여하고 있다[39]. 뿐만 아니라 spermidine은 다양한 환경적인 스트레스를 차단하는데 중요한 역할을 한다[1]. 더욱이 spermidine은 산화적 스트레스뿐만 아니라 중금속의 독성 및 결핍현상, 염분, 냉기로부터 오는 스트레스에 대한 보호 효과가 있는 것으로 보고되고 있다[5,11,34]. 최근에는 초파리나 효모에 spermidine을 먹이면 3~4배 정도 수명이 연장 된다고 보고 되었다[8].
Spermidine이란?
Spermidine은 spermine의 전구체로 역할을 하는 putrescine로부터 합성되는 polycation의 한 형태이다. 최근에 spermidine는 수명연장에 중요한 역할을 하는 하나의 polyamine으로 알려져 있다.
전통적으로 잘 알려진 항산화제는 어떤 것이 있는가?
따라서 생체 내에서 활성산소를 조절 할 수 있는 항산화제의 개발에 대한 필요성이 강조되고 있다. 전통적으로 잘 알려진 항산화제로는 vitamin C 및 E를 비롯하여 폴리페놀 화합물로 resveratrol, propolis, eugenol, curcumin 등이 알려져 있다[15,17,27,31,33]. Spermidine은 spermine, putrescine과 함께 polyamine에 속하며, 사람의 정자와 포도 열매에서 많이 발견되는 선형 분자로서 세포성장, 성숙, 항노화 및 항산화 과정에 많이 관여하고 있다[39].
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