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문제 정의
- 이와 같이 생약 복합제가 약물간의 상호작용을 통해 더욱 유효한 효과를 발휘하고 있다는 점에서, 생약재들을 배합하여 상승효과를 나타내는 복합제의 개발이 필요하다. 따라서 본 연구에서는 6종의 단일 생약재와 단일 생약재를 혼합하여 제조한 3종의 생약복합제의 항산화 및 항염증 활성에 관해 비교 조사하였다.
가설 설정
- 1)Total polyphenol content (mg/g) was equivalent as tannic acid as standard.
- 2)Total flavonoid content (mg/g) was equivalent as quercetin as standard.
제안 방법
- 5-LO 저해 활성 측정은 LO inhibitor screening assay kit(Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 실험하였다. 샘플 10 µL에 5-LO(220 units/mL) 90 µL와 1 mM 아라키돈산 10 µL를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체(chromogen) 100 µL를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA autoreader(UVM340, Biochrom Ltd.
- COX-2 저해 활성 측정은 COX inhibitor screening assay kit(Cayman Chemical Co.)를 이용하여 실험하였다. 시료 20 µL에 hematin 10 µL, 효소 5 µL, buffer 950 µL를 넣고 37℃에서 반응 후 10 µL의 아라키돈산을 첨가하여 37℃에서 2분간 반응시켜 COX-2를 활성화시킨 후 이를 50 µL를 취하여 200 µL의 색원체를 넣은 후 25℃에서 90분간 반응시킨 후 ELISA autoreader(Biochrom Ltd.
- NDGA와 indomethacin을 각각 5-LO와 COX-2의 양성대조군으로 사용하여 1 µg/mL의 농도로 효소 저해활성을 측정하였고 단일 생약재와 생약복합제 에탄올추출물의 농도는 25 µg/mL로 동일하게 처리하였다.
- RAW 264.7 세포는 10% fetal bovine serum(Gibco-BRL, Rockville, MD, USA), 100 µg/mL penicillin(Gibco-BRL) 그리고 100 µg/mL streptomycin (GibcoBRL)을 첨가한 DMEM 배지(Gibco-BRL)를 이용하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 배양기에서 2-3일에 한 번씩 계대 배양하였다.
- 항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 라디칼 소거 작용은 활성라디칼에 전자를 공여하여 항산화 효과나 인체에서 노화를 억제하는 척도로 이용되고 있다(38). 단일 생약재 및 생약복합제 에탄올추출물들의 라디칼 소거활성 측정은 DPPH와 ABTS 라디칼을 이용하여 측정하였다. DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 활성 라디칼로서 항산화제, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는 것을 이용하여 항산화물질을 검색하고, ABTS는 2-azino-bis의 색을 띤 양이온 라디칼의 감소에 근거하여 항산화능을 측정하는 방법으로 추출물의 항산화력에 의해 ABTS 라디칼이 소거되어 청록색으로 탈색된 활성 라디칼의 제거 정도를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS 소거 활성능을 측정할 수 있고 탈색 반응이 1분 안에 종료되어 단시간에 측정 가능하다(39).
- DPPH는 짙은 자색을 띄는 비교적 안정한 활성 라디칼로서 항산화제, 방향족 아민류 등에 의해 환원되어 색이 탈색되는 것을 이용하여 항산화물질을 검색하고, ABTS는 2-azino-bis의 색을 띤 양이온 라디칼의 감소에 근거하여 항산화능을 측정하는 방법으로 추출물의 항산화력에 의해 ABTS 라디칼이 소거되어 청록색으로 탈색된 활성 라디칼의 제거 정도를 흡광도 값으로 나타내어 ABTS 소거 활성능을 측정할 수 있고 탈색 반응이 1분 안에 종료되어 단시간에 측정 가능하다(39). 따라서 단일 생약재 및 생약복합제 에탄올추출물들과 인공천연 항산화제로 알려진 BHA, L-ascorbic acid의 항산화효과를 DPPH와 ABTS 라디칼의 소거활성을 측정하여 라디칼을 1/2로 소거하는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내어 비교하였다(Table 4). 그 결과, DPPH 라디칼의 RC50 값은 총폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 결과와 유사하게 어성초(HC), 홍화(CT), MIX-2 에탄올추출물에서 각각 69.
- 샘플 10 µL에 5-LO(220 units/mL) 90 µL와 1 mM 아라키돈산 10 µL를 첨가하여 5분간 상온에서 반응시킨 후, 색원체(chromogen) 100 µL를 가하여 상온에서 5분 동안 반응시키고 ELISA autoreader(UVM340, Biochrom Ltd., Holliston, MA, USA)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포배양 상등액 100 µL와 Griess시약(1% sulfanilamide, 0.1% naphthylethylendiamine in 2.5% phosphoric acid) 100 µL를 혼합하여 96 well plate에서 10분간 반응시킨 후 ELISA autoreader(Biochrom Ltd.)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, sodium nitrate(Sigma Co.)로 표준곡선을 작성하여 NO의 함량을 산출하였다.
- 시료의 free radical 소거활성은 stable radical인 DPPH(Sigma Co.)에 대한 환원력을 측정한 것으로 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도별로 희석한 희석액 800 µL와 메탄올에 녹인 0.15 mM DPPH 용액 200 µL를 가하여 실온에 30분 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 총 플라보노이드 함량은 Nieva Moreno 등(31)의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 샘플 0.
- , Hwaseong, Korea)에서 3시간 동안 2회 반복 추출한 후, 여과(Whatman No 2, Maidstone, England)하였다. 여과한 에탄올 추출액을 감압농축(N-1000S-WD, Eyela Co., Tokyo, Japan)하여 얻은 에탄올 추출물에 80% 에탄올 100 mL로 용해시켜 4℃에 하루 방치한 후 상층액을 다시 감압농축 후 동결건조(FDU-1100, Eyela Co., Tokyo, Japan)하여 에탄올추출물을 제조하였다. 생약복합제 추출물의 경우 각 조성에 들어가는 단일 생약재들을 동량의 비율로 섞어 단일 생약재 에탄올추출물 제조 방법과 동일하게 제조하였다.
- 이 때 tannic acid(Sigma Co.)를 이용한 표준곡선은 tannic acid의 최종농도가 0, 5, 25, 50, 75 µg/mL가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 700 nm에서 흡광도를 측정하여 구하였다.
- 이에 3가지 생약복합제 에탄올추출물의 농도를 각각 12.5, 25, 50, 100 µg/mL의 농도로 세포에 처리하였다.
- 따라서, 효과적인 NO 분비조절은 급성 또는 만성 염증질환의 치료방법으로 알려져 있으며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 이에 염증 형성에 중요한 역할을 하는 효소인 5-LO와 COX-2를 동시에 효과적으로 억제하는 생약복합제 MIX-1(AG, KP, AJ), MIX-2(AG, KP, CT, HC), MIX-3(AG, AJ, EU, CR)의 에탄올추출물이 NO의 생성을 저해할 수 있는지를 알아본 결과 Fig. 1과 같이 나타났다. NO 생성 저해 효과를 측정하기 전에 생약복합제 에탄올추출물이 세포에 독성을 나타내는지를 MTT assay를 이용하여 측정하였을 때, 3가지의 생약복합제 모두 90% 이상의 세포 생존율을 보여 세포 독성은 나타내지 않는 것을 확인하였다.
- 즉 RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1×105 cells/well 농도로 분주하여, 24시간 배양 후 배지를 제거하고, lipopolysaccharide(LPS, 100 ng/mL)가 첨가된 DMEM 배지 200 µL에 녹인 농도별 시료를 각 well에 첨가하여 5% CO2가 존재하는 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 희석된 용액 990 µL에 sample 10 µL를 가하여 정확히 1분 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 murine macrophage cell line RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)에서 분양 받아 사용하였다. RAW 264.
- 본 실험에 사용된 생약재는 현재 한방 및 민간처방에서 약리적으로 항산화나 항염증작용이 있는 시료를 선정하였으며, 경동시장에서 구입하였고, 공시된 시료 및 이용부분은 Table 1과 같다. 생약복합제 MIX-1, MIX-2, MIX-3는 6종의 생약재중 오가피를 각 조성물에 공통적으로 포함되도록 하였고, 그 외의 생약재는 무작위로 선별하여 총 3종의 MIX-1, MIX-2, MIX-3 생약복합제를 본 실험에 사용하였다(Table 2).
- 본 실험에 사용된 생약재는 현재 한방 및 민간처방에서 약리적으로 항산화나 항염증작용이 있는 시료를 선정하였으며, 경동시장에서 구입하였고, 공시된 시료 및 이용부분은 Table 1과 같다. 생약복합제 MIX-1, MIX-2, MIX-3는 6종의 생약재중 오가피를 각 조성물에 공통적으로 포함되도록 하였고, 그 외의 생약재는 무작위로 선별하여 총 3종의 MIX-1, MIX-2, MIX-3 생약복합제를 본 실험에 사용하였다(Table 2).
- 각 시료의 유리라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50 값으로 나타내었다. 이때 활성 비교를 위하여 합성 항산화제인 t-butylatedhydroxyanisole(BHA, Sigma Co.)와 천연 항산화제인 L-ascorbic acid(Sigma Co.)를 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 실시하여 mean±SD로 나타내었으며, 실험결과의 통계분석은 SAS version 6.12(SAS Institute, Cary, NC, USA)를 이용하여 평균화 표준오차, Duncan’s multiple range test에 의해 시료간의 유의적 차이(p<0.05)를 검정하였다.
이론/모형
- ABTS radical을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+· cation decolorization assay방법(32)에 의하여 시행하였다.
- NO 함량은 Green 등(34)의 방법으로 측정하였다. RAW 264.
- 세포 생존율은 Carmichael 등(33)의 방법에 따라 MTT assay를 이용하여 측정하였다. 즉 RAW 264.
- 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법(30)을 응용하였다. 각 시료 1 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 다시 증류수로 10배 희석한 희석액 2 mL에 2배 희석된 Folin 시약(Sigma Co.
성능/효과
- NDGA와 indomethacin을 각각 5-LO와 COX-2의 양성대조군으로 사용하여 1 µg/mL의 농도로 효소 저해활성을 측정하였고 단일 생약재와 생약복합제 에탄올추출물의 농도는 25 µg/mL로 동일하게 처리하였다. 5-LO의 저해활성의 경우 단일 생약재 에탄올추출물에서 오가피(AG)만이 약 36.23%로 30% 이상의 저해활성을 보인데 반해 생약복합제 에탄올추출물의 경우 3가지 생약복합제 에탄올추출물 모두 30% 이상의 저해활성을 보였고 특히 MIX-3의 경우 약 52.43%의 높은 저해활성을 나타냈다. 양성대조군으로 사용된 NDGA는 1 µg/mL의 낮은 농도에서도 약 86.
- 89 µg/mL로 보고되었던 것과 비교해 NDGA 보다는 낮은 저해활성을 나타냈지만 25 µg/mL의 농도에서 50% 이상의 저해활성을 보인 MIX-3는 5-LO를 효과적으로 저해한다고 볼 수 있다. COX-2의 저해활성은 모든 시료에서 70% 이상의 높은 저해활성을 보였으며 어성초(HC), 홍화(CT), MIX-2 에탄올추출물의 경우 90% 이상의 저해활성을 보였다. 양성대조군인 indomethacin의 경우 1 µg/mL의 농도에서 약 95.
- 1과 같이 나타났다. NO 생성 저해 효과를 측정하기 전에 생약복합제 에탄올추출물이 세포에 독성을 나타내는지를 MTT assay를 이용하여 측정하였을 때, 3가지의 생약복합제 모두 90% 이상의 세포 생존율을 보여 세포 독성은 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이에 3가지 생약복합제 에탄올추출물의 농도를 각각 12.
- 그 결과, DPPH 라디칼의 RC50 값은 총폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 결과와 유사하게 어성초(HC), 홍화(CT), MIX-2 에탄올추출물에서 각각 69.64, 50.70, 63.49 µg/mL로 추출물 가운데 우수한 DPPH 라디칼 소거능을 보였고, ABTS 라디칼의 RC50 값은 각각 24.06, 18.91, 41.61 µg/mL로 DPPH 라디칼 소거능과 유사한 경향을 보였다.
- 5, 25, 50, 100 µg/mL의 농도로 세포에 처리하였다. 그 결과, LPS만 처리한 군에서는 NO가 약 18.9 µM로 처리하지 않은 군보다 약 2배 이상의 NO를 생성하였고 여기에 MIX-1과 MIX-3 에탄올추출물을 처리한 군의 경우 100 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 유의적으로 NO의 생성을 저해한 것에 비해 MIX-2 에탄올추출물의 경우 50 µg/mL의 농도에서부터 유의적으로 NO의 생성을 저해하는 것을 확인하였다. 이는 생약복합제 에탄올추출물 중 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 라디칼 소거능이 MIX-2 에탄올추출물이 가장 우수하게 나타난 결과와 일치한 것을 보였다.
- 74 mg/g의 함량으로 다른 시료들 보다 높게 측정되었다. 또한 플라보노이드 함량도 어성초, 홍화, MIX-2 에탄올추출물이 각각 36.86, 19.42, 14.74 mg/g으로 높게 측정되었다. 어성초의 경우 총 폴리페놀 함량은 홍화와 비슷한 함량을 보였으나 플라보노이드 함량은 홍화보다 약 2배정도 높은 함량을 보였다.
- 89%의 우수한 COX-2 저해활성을 나타냈다. 본 연구에서 단일 생약재 및 생약복합제 에탄올추출물의 COX-2 저해활성은 70% 이상의 높은 저해활성을 나타내었고, 5-LO의 경우 단일 생약재 에탄올추출물보다 생약복합제 에탄올추출물이 더 높은 저해활성을 보였다. Lee와 Jang(42)은 COX-2와 염증성 cytokine들이 금은화와 황금 단일 추출물보다 금은화와 황금 복합 추출물에서 보다 더 우수한 저해 효과를 보인 것과 같이 본 연구에서도 생약 복합제 에탄올추출물이 단일 생약재 에탄올추출물보다 5-LO와 COX-2 효소를 동시에 효과적으로 저해할 수 있는 것으로 나타났다.
- 어성초의 경우 총 폴리페놀 함량은 홍화와 비슷한 함량을 보였으나 플라보노이드 함량은 홍화보다 약 2배정도 높은 함량을 보였다. 생약복합제의 경우 MIX-2가 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높게 측정되었다. Lee 등(35)의 결과에서 천연물 복합제의 경우 비교적 많은 양의 페놀 화합물을 함유하고 있는 것으로 나타났고, 복합제를 구성하고 있는 생약재의 대부분이 페놀을 다량 함유하는 식물에 기인한다는 결과와 같이 본 연구에서도 MIX-2의 경우 단일 생약재 중 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 가장 많이 함유된 어성초와 홍화가 첨가되어 있어 높은 함량을 보인 것으로 생각된다.
- 양성대조군으로 사용된 NDGA는 1 µg/mL의 낮은 농도에서도 약 86.11%의 저해활성을 보였다.
- 74 mg/g으로 높게 측정되었다. 어성초의 경우 총 폴리페놀 함량은 홍화와 비슷한 함량을 보였으나 플라보노이드 함량은 홍화보다 약 2배정도 높은 함량을 보였다. 생약복합제의 경우 MIX-2가 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량이 높게 측정되었다.
- 9 µM로 처리하지 않은 군보다 약 2배 이상의 NO를 생성하였고 여기에 MIX-1과 MIX-3 에탄올추출물을 처리한 군의 경우 100 µg/mL의 농도로 처리하였을 때 유의적으로 NO의 생성을 저해한 것에 비해 MIX-2 에탄올추출물의 경우 50 µg/mL의 농도에서부터 유의적으로 NO의 생성을 저해하는 것을 확인하였다. 이는 생약복합제 에탄올추출물 중 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 라디칼 소거능이 MIX-2 에탄올추출물이 가장 우수하게 나타난 결과와 일치한 것을 보였다.
- 90 µg/mL로 RC50값이 낮게 측정되었다. 전자공여능이 phenolic acids와 flavonoids 및 기타 phenol성 물질에 대한 항산화작용의 지표라는 보고(40)와 유사하게 본 연구의 추출물들의 경우 폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 결과와 대부분 비례적으로 일치하는 것으로 나타났다.
- 6종의 단일 생약재인 두충(EU), 어성초(HC), 오가피(AG), 우슬(AJ), 홍화(CT), 해동피(KP)와 생약복합제인 MIX-1(AG, KP, AJ), MIX-2(AG, KP, CT, HC), MIX-3(AG, AJ, EU, CR)의 에탄올추출물에 존재하는 총 폴리페놀의 함량은 tannic acid를 기준물질로, 총 플라보노이드 함량은 quercetin을 기준물질로 하여 각각 측정한 결과는 Table 3과 같다. 총 폴리페놀 함량은 어성초, 홍화, MIX-2 에탄올추출물이 각각 58.98, 60.79, 57.74 mg/g의 함량으로 다른 시료들 보다 높게 측정되었다. 또한 플라보노이드 함량도 어성초, 홍화, MIX-2 에탄올추출물이 각각 36.
후속연구
- 본 연구에서 사용된 단일 생약재 에탄올추출물 보다는 생약복합제 에탄올추출물이 생약복합제 조성물 중에 함유되어 있는 성분들이 서로 혼합되면서 시너지 효과를 나타내는 것으로 생각되며 이러한 생약복합제들은 염증성 질환의 예방 및 치료용 기능성 소재로 활용될 수 있으리라 본다.
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