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문제 정의
- 따라서, 본 연구는 식물자원을 재료로 하여 in vitro 항염증 및 항산화 활성을 분석함으로써 염증 및 산화스트레스와 관련된 질병의 발병을 예방 또는 치료할 수 있는 기능성 후보 소재를 발굴하고자 수행하였다.
- 본 연구는 식물자원을 재료로 하여 in vitro 항염증 및 항산화 활성을 분석함으로써 기능성소재로의 활용 가능성이 있는 유망 후보자원을 발굴하고자 수행하였다. 이를 위해 식물추출물 38종을 대상으로 세포증식에 대한 영향, 염증 관련지표(nitric oxide, TNF-α, IL-6, IκBα, iNOS, COX-2) 및 항산화항목(DPPH 라디칼 소거능, LDL 산화저해능) 및 총페놀 함량에 대한 효과를 탐색하고 결과로부터 8종의 시료를 1차로 선발하였다.
제안 방법
- 38종 식물추출물의 항산화 및 항염증활성에 대한 1차 분석실험 결과, 각 분석항목에 대해 시료별로 1부터 15위까지 순위를 부여하고 점수화하여 그 결과를 합한 후 가장 높은 점수에 해당하는 시료 8종 어저귀(꽃/종자), 어저귀(잎), 으름(꽃), 족제비싸리(꽃), 개모시풀(뿌리), 소사나무(가지), 등골나물(잎), 왕벗나무(가지)를 선발하여 농도에 따른 활성 및 세포증식에 대한 영향을 확인하여 보았다.
- , 2011). Peroxynitrite 소거능 분석은 96-well microplate에 여러 농도의 추출물을 분주하고, 90 mM NaCl, 5 mM KCl 및 100 mM diethylenetriaminepenta acetic acid와 10 mM dihydrorhodamine 123을 함유하는 sodium phosphate 완충액(pH 7.4)을 가하고, 이어서 50 mM의 3-morpholinosydnonimine hydrochloride(SIN-1)를 처리한 후 fluorescence microplate reader(Synergy HT, BIO-TEK, USA)로 excitation 500nm 및 emission 536 nm에서 측정하여 peroxynitrite의 제거 능을 측정하였으며 결과는 SIN-1을 처리한 대조군의 결과에 대한 시료처리에 의해 나타나는 수치를 50% 저해하는 농도로 환산(IC50)하여 나타내었다. ROS 소거능은 12.
- ROS 소거능은 12.5 mM DCFDA 및 600 U/ml esterase의 각 stock solution을 혼합하여 조제된 2',7'-dichlorodihydrofluorescein(DCFH) 용액(최종농도 0.125 mM DCFDA, 6 U/ml esterase) 2 μl를 취해 SIN-1 용액(최종농도 50 mM) 190 μl 및 여러 농도의 각 시료 10 μl를 상온의 암소에서 5 분간 교반한 후 수차례 fluorescence(excitation wavelength 485 nm/emission wavelength 530 nm)를 측정하고 분당 생성된 ROS량을 산출하여 그 결과는 IC50로 나타내었다.
- TNF-α와 IL-6 분비에 대한 영향은 LPS 단독처리로 얻어진 대조실험에 대한 각 추출물의 저해율로써 나타내었고, Iκ-Bα, iNOS 및 COX-2 단백질 발현량에 대한 분석결과는 LPS 단독처리 대조실험의 결과치(1 fold로 환산)에 대한 각 식물추출물의 결과치를 비교한 후 백분율로서 나타내었다.
- 그리고, nitric oxide 생성에 대한 저해능(IC50)을 분석하기 위해 RAW264.7 세포를 48-well plate에 5×105/ well이 되도록 분주하여 16 시간 배양한 후 여러 농도의 시료를 가하고 100 ng/ml 농도의 LPS로 동시 처리 또는 LPS를 단독 처리하여 18 시간 배양하였고, 그 후 세포상층액을 얻어 분비된 nitrite양을 Griess reagent system으로 측정하여 구하였다.
- , 2011). 또한, western blot의 결과분석은 실시간 화학 발광 및 형광영상장치(Chemi-smart 2100, Vilber Lourmat, Italy)를 사용하여 측정하였다. TNF-α와 IL-6 분비에 대한 영향은 LPS 단독처리로 얻어진 대조실험에 대한 각 추출물의 저해율로써 나타내었고, Iκ-Bα, iNOS 및 COX-2 단백질 발현량에 대한 분석결과는 LPS 단독처리 대조실험의 결과치(1 fold로 환산)에 대한 각 식물추출물의 결과치를 비교한 후 백분율로서 나타내었다.
- 산화스트레스는 이를 제거하는 생체 내의 방어시스템과의 균형이 무너질 때 암을 비롯한 여러 질병의 발병에 관여하므로 이를 감소시킬 수 있는 항산화물질을 탐색하고자 식물추출물 38종에 대해 항산화활성을 검색하였으며 그 결과는 Table 2에 나타내었다.8-9) DPPH 라디칼에 대한 소거능(IC50)을 분석한 결과, 소사나무(가지), 산딸나무(꽃), 산수유나무(가지) 등의 식물이 각각 21 ± 2, 18 ± 1, 10 ± 0 μg/ ml를 보여 우수한 활성을 나타낸 것을 알 수 있었다.
- 선발된 8종의 시료에 대해서는 다시 농도별로 세포증식에 대한 효과, iNOS, COX-2의 발현 및 NF-κB 전사에 대한 영향, peroxynitrite, ROS, nitric oxide 생성에 대한 IC50 값을 분석하여 보다 가능성이 있는 식물을 유망후보자원으로 선발하고자 하였다.
- 식물자원 추출물 38종의 nitric oxide 생성, tumor necrosis factor-alpha(TNF-α) 및 interleukin-6(IL-6)의 분비, inhibitor of nuclear factor kappa-B alpha(Iκ-Bα), iNOS 및 COX-2 단백질 발현에 대한 영향을 예비적으로 실험하기 위해 아래와 같이 분광광도계 겸용 효소면역분석기(SpectraMaxm2, Molecular Device, USA)를 사용하여 분석하였다(Lee et al., 2011).
- 식물자원 추출물의 cell proliferation에 미치는 영향을 예비적으로 분석하기 위해 RAW 264.7 cells을 96-well plate에 3 × 104/well이 되도록 분주하고 16 시간 배양한 후 각 식물 추출물을 최종 농도가 5 μg/ml가 되게 처리하여 24 시간 동안 배양하고 Cell Titer 96® AQueous One Solution Assay를 수행하였다.
- 항염증인자에 대한 식물추출물의 활성을 1차 (예비) 탐색하기 위해 수행한 실험에는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 각 식물자원 추출물을 5 mg/ml의 농도로 용해하여 stock solution을 만든 후 세포독성실험에서 최소 저해농도였던 시료의 최종농도인 5 μg/ml로 가하여 실험하였다. 예비검색실험으로 선발한 8종의 식물추출물은 다시 여러 농도로 조제한 후 RAW 264.7 cells에서 cytokine 분비에 대한 농도별 저해능과 세포증식에 미치는 영향과 peroxynitrite, reactive oxygen species(ROS) 소거능 및 nitric oxide 분석을 통해 추가실험에 사용하였으며 그 결과는 IC50로 나타내었다.
- 예비실험 후 선발된 8종 식물추출물에 대해서는 iNOS, COX-2 및 nuclear factor-kappa B(NF-κB)의 함량을 western blot assay로 측정한 후 AlphaEase FC Software(Alpha Innotech Co., An Leandro CA, USA)를 사용하여 결과를 분석하였다.
- 7 cells을 96-well plate에 3 × 104/well이 되도록 분주하고 16 시간 배양한 후 각 식물 추출물을 최종 농도가 5 μg/ml가 되게 처리하여 24 시간 동안 배양하고 Cell Titer 96® AQueous One Solution Assay를 수행하였다. 예비실험으로부터 선발된 8종 식물추출물에 대한 농도별 세포증식에 대한 효과는 fluorescence microplate reader (Synergy HT, BIO-TEK, USA)를 사용하여 분석하였다(Lee et al., 2011).
- 이를 위해 식물추출물 38종을 대상으로 세포증식에 대한 영향, 염증 관련지표(nitric oxide, TNF-α, IL-6, IκBα, iNOS, COX-2) 및 항산화항목(DPPH 라디칼 소거능, LDL 산화저해능) 및 총페놀 함량에 대한 효과를 탐색하고 결과로부터 8종의 시료를 1차로 선발하였다.
- 항염증인자에 대한 식물추출물의 활성을 1차 (예비) 탐색하기 위해 수행한 실험에는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 각 식물자원 추출물을 5 mg/ml의 농도로 용해하여 stock solution을 만든 후 세포독성실험에서 최소 저해농도였던 시료의 최종농도인 5 μg/ml로 가하여 실험하였다.
대상 데이터
- (USA) 제품을 한국지사를 통해 구입하여 사용하였고 세포배양에 필요한 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) 및 10% fetal bovine serum(10% FBS)은 Invitrogen(USA)의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용된 Ailanthus altissima(Mill.) Swingle 등 38종의 식물추출물 시료는 농촌진흥청 국립원예특작과학원 인삼특작부 추출물은행(PJ007437201003)에서 문헌검색을 통해 연구되지 않았거나 미흡한 것을 제공받아 사용하였으며 식물의 산지, 추출부위, 추출조건 등은 Table 1에 나타낸 바와 같다.
- 항염증효과 분석에는 대식세포주(murine mouse macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행으로부터 분양받아 사용하였다. 세포배양은 10% FBS, 100 U/ml penicillin, 그리고 100 mg/ml streptomycin을 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 37 °C와 5% CO2를 유지한 배양기에서 수행되었다(Lee et al.
데이터처리
- 단일농도에서 실험된 식물추출물 38종의 세포증식에 대한 영향, nitric oxide 생성에 대한 저해능, TNF-α 및 IL-6 분비량에 미치는 영향을 측정한 실험 결과는 평균과 표준편차(means ± SD)로 나타내었고, 자료의 유의성은 GraphPad Prism 4.0 software(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 ANOVA-test를 통해 검정하였다.
- , San Diego, CA, USA)를 이용하여 ANOVA-test를 통해 검정하였다. 또한, 예비 검색실험에서 선발된 식물자원 8종에 대한 실험 결과는 prism5 for windows(Graph Pad Inc., CA, USA)의 Newman-Keuls Multiple Comparison Test에 의한 one way ANOVA를 이용하여 유의성을 분석하였다.
이론/모형
- Enzymelinked immunosorbent assay(ELISA) kit는 eBioscience (San Diego, USA), Iκ-Bα, iNOS, COX-2에 대한 specific antibodies, horseradish peroxidase(HRP) attached secondary antibody는 Cell Signaling Technology(USA)의 것을 사용하였다.
- 식물 추출물 38종의 DPPH 라디칼, LDL 산화에 대한 저해능 및 총페놀 함량은 분광광도계(Cary 300 spectrophotometer, Varian, Australia)를 사용하여 Lee 등의 방법에 따라 분석하였다. 본 실험결과에서 총페놀 함량은 각 추출물 100 g에 대한 총페놀 함량을 백분율로 나타내었다(Lee et al.
- 예비실험으로부터 선발된 8종 시료에 대한 농도에 따른 항산화활성을 확인하기 위해 peroxynitrite 소거능과 ROS 소거능을 Lee 등의 방법으로 분석하였다(Lee et al., 2011). Peroxynitrite 소거능 분석은 96-well microplate에 여러 농도의 추출물을 분주하고, 90 mM NaCl, 5 mM KCl 및 100 mM diethylenetriaminepenta acetic acid와 10 mM dihydrorhodamine 123을 함유하는 sodium phosphate 완충액(pH 7.
성능/효과
- 7 cells의 증식에 미치는 식물추출물의 영향을 확인한 결과, 어저귀(잎) 116.6 ± 5.6%이 유의하게 세포증식을 증가시켰으며 이외에도 10종의 시료가 100% 이상의 세포증식을 나타내었다.
- 8-9) DPPH 라디칼에 대한 소거능(IC50)을 분석한 결과, 소사나무(가지), 산딸나무(꽃), 산수유나무(가지) 등의 식물이 각각 21 ± 2, 18 ± 1, 10 ± 0 μg/ ml를 보여 우수한 활성을 나타낸 것을 알 수 있었다.
- Cytokine 발현에 대한 8종 선발 식물의 영향을 분석한결과, iNOS 발현에 대한 저해효과는 개모시풀(뿌리), 소사나무(가지) 및 등골나물(잎) 등의 시료가 농도 의존적으로 저해하는 것을 알 수 있었고, COX-2 발현에 대한 저해효과는 등골나물(잎)이 우수하였으며, NF-κB 발현에 대한 저해효과는 개모시풀(뿌리) 및 왕벗나무(가지)가 높았다(Fig. 2).
- Nitric oxide 생성에 대한 저해정도는 개모시풀(뿌리), 등골나물(잎) 및 황칠나무(잎/가지) 등의 시료가 각각 98.5 ± 0.9, 27.1 ± 0.9 및 17.0 ± 2.8%로 다른 시료들에 비해 우수하였다.
- 또한, nitric oxide 생성에 대해서는 양성대조물질인 trolox의 저해능(IC50)이 2.4 ± 0.4 μg/ml인 점을 감안할 때 어저귀 (잎), 개모시풀(뿌리), 소사나무(가지)와 등골나물(잎)가 각각 6.9 ± 0.8 μg/ml, 1.1 ± 0.1 μg/ml, 3.3 ± 0.0 μg/ml 및 3.6 ± 0.0 μg/ml로 우수한 nitric oxide 생성에 대한 저해활성을 나타내었다(Table 3).
- 선발 식물들의 peroxynitrite에 대한 소거능(IC50)을 분석한 결과, 소사나무(가지) 및 왕벗나무(가지) 등의 시료(0.6 ± 0.0 μg/ml, 0.5 ± 0.0 μg/ml)가 양성대조물질인 penicillamin(0.7 ± 0.0 μg/ml)과 비슷한 수준으로 우수한 효과를 보인 것을 비롯해 대부분의 시료들이 좋은 효과를 나타내었다.
- 세포증식에 대한 선발식물의 처리 농도별 영향을 살펴보았을 때, 어저귀(꽃/종자), 어저귀(잎)이 20 μg/ml의 농도에서도 독성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
- 식물추출물을 13.2 μg/ml의 최종농도에서 인간 저밀도지단백(LDL)의 산화에 대한 저해능을 분석한 실험에서는 소사나무(가지), 산딸나무(꽃), 사스레피나무(가지), 왕벗나무(가지), 피나무(열매) 및 마삭줄(잎) 등의 시료가 80% 이상의 높은 산화저해효과를 나타내었다.
- 염증관련 단백질인 iNOS의 발현에 대해서는 족제비싸리(꽃) 등의 시료가 control에 비해 50%이하의 발현을 나타내었고, COX-2의 발현에 대해서는 으름(꽃)과 어저귀(꽃/종자)가 70%미만의 비교적 낮은 발현정도를 보였으며, Iκ-Bα의 발현이 15%이상 되는 식물은 족제비싸리(꽃), 등골나물(잎)으로 확인되었다.
후속연구
- 선발된 8종의 시료에 대해서는 다시 농도별로 세포증식에 대한 효과, iNOS, COX-2의 발현 및 NF-κB 전사에 대한 영향, peroxynitrite, ROS, nitric oxide 생성에 대한 IC50 값을 분석하여 보다 가능성이 있는 식물을 유망후보자원으로 선발하고자 하였다. 그 결과, 소사나무(가지), 등골나물(잎), 으름(꽃) 및 개모시풀(뿌리)은 항염증 혹은 항산화활성이 우수하나 농도에 따라 세포독성을 나타내었으므로 활용에 주의가 필요해보였으며, 어저귀(잎)은 항염증활성과 항산화활성이 비교적 우수하고 실험된 처리농도에서 세포독성이 없어 향후 in vivo 활성 검정 등 심화연구를 통해 그 활용 가능성을 검토할 필요가 있다고 사료되었다.
- 최근 국내외를 막론하고 고령화와 참살이에 대한 관심이 높아 건강유지와 관련된 제품에 대한 수요가 증가하고 있으며 이러한 경향은 건강기능식품 관련 여러 자료를 통해 알 수 있다. 또한, 근래에 이르러 기능성 관련 유용 소재 발굴을 위한 원천으로 천연물이 주목받고 있으며, 오랜 기간 인류가 이용해 온 식물은 유용한 생리활성과 주요 약효 성분을 보유하고 있어 이를 활용한 기능성 소재 개발 가능성이 높을 것으로 기대된다(Chung and Shin, 1990).
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