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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 밀원이 다른 꿀의 특성을 조사하기 위하여 회분함량, 무기물 조성, HMF 함량을 측정하였으며, 꿀에 존재하는 단백질을 SDS-PAGE로 분석하고 분자량을 조사하여 이들이 꿀의 밀원 판별이 될 수 있는지를 조사하였다.
가설 설정
- 2)ND, Not detected.
제안 방법
- 안정탄소동위원소비율(stable carbon isotope ratio, SCIR)은 GC-IR/MS(VGISOTECH, Isochrom II, UK)를 이용하여 분석하였다. 즉 시료의 전 처리는 벌꿀 5 mg을 tin capsule에 밀봉하여 EA(elemental analyser)에서 회화하고 CO2로 산화시켜 GC로 분리하여 He gas diluter로 희석하여 IR/MS로 12C와 13C를 측정하였다.
- 안정탄소동위원소비율(stable carbon isotope ratio, SCIR)은 GC-IR/MS(VGISOTECH, Isochrom II, UK)를 이용하여 분석하였다. 즉 시료의 전 처리는 벌꿀 5 mg을 tin capsule에 밀봉하여 EA(elemental analyser)에서 회화하고 CO2로 산화시켜 GC로 분리하여 He gas diluter로 희석하여 IR/MS로 12C와 13C를 측정하였다. 이때 표준물질인 Pee Dee Belemnite의 동위원소 비율에 대한 시료의 동위원소 비율을 측정하여 아래의 식에 의해 산출하였다.
- 준비된 용액을 여과하여 시험 용액으로 하였다. 시험 용액 각 5 mL를 시험관에 취하고 시험용액관은 증류수를, 공시험용액관에는 0.1% NaHSO3용액을 대조 액으로 하여 UV Spectrophotometer(U1100, Hitachi-Technologies Co., Japan)로 284 nm와 336 nm에서 각각의 흡광도를 측정하고 다음 식에 따라 HMF를 정량하였다. 이 식에서 A284−A336은 각 파장에서의 흡광도 값(시험용액-공시험용액)을 의미함(Food Code, KFDA, 2002).
- , 1998). 꿀 단백질의 분자량은 전기영동 후 molecular weight marker의 Rf값과 분자량 함수를 구하여 계산하였다.
- 밀원을 달리한 다양한 꿀의 특성을 조사하기 위하여 아카시아꿀 7개, 잡화꿀 9개, 밤꿀 5개, 토종꿀 5개의 시료를 이용하여, 회분 함량, 무기물 조성과 HMF(hydroxy methyl furfural)함량 및 꿀 단백질의 SDS-PAGE에 의한 단백질 분자량을 조사한 결과는 다음과 같다. 회분 함량은 아카시아꿀이 0.
- 45 µm-pore sized membrane filter (Millex-HV 13 mm, Millpore Corporation Bedfored, USA)로 여과한 여액을 ion chromatography용 시험용액으로 하였다. 분석용 표준물질은 ICP분석용을 사용하였으며 표준용액은 각 무기물의 표준물질(Accustandard Co. Ltd., USA)을 100 mL용량 flask에 취해 2.5% HNO3으로 희석하여 제조한 후 다시 희석하여 working solution을 각각 조제하여 분석하였다.
대상 데이터
- 본 연구의 시료는 (주)강원농원에서 전국의 양봉인(경북 왜관, 충북 괴산, 강원 양구, 경기 연천)에게서 수매한 벌꿀 중에서 아카시아꿀(Acacia honey, ACH) 7개, 잡화꿀(Poly floral honey, PFH) 9개, 밤꿀(Chestnut honey, CNH) 5개, 토종꿀(Native bee honey, NBH) 5개를 무작위로 선택하여 상온에서 40-90일간 보관하면서 실험하였다.
이론/모형
- 은 electronic grade를 사용하였고, 모든 물은 1차 증류 후 Millipore Q(Millipore Q system, Millpore Corporation, USA) 이온교환수지를 통과시켜 정제한 것을 사용하였다. 기기분석은 ICP-OES(inductively coupled plasma-optical emission spectrometry, PE/CIROS Vison, Varian Spectro, Australia)를 사용하였다. 기기 분석 조건은 power; 1.
- Laemmli의 SDS-PAGE 방법(1970)을 이용하였으며, molecular weight maker는 BIO-RAD(Bio-Rad Laboratories, CA, USA)의 제품을 이용하였다. Molecular weight maker는 myosin(200 kDa), β-galactosidase(116.
성능/효과
- 밀원을 달리한 다양한 벌꿀의 회분 함량을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 밤꿀과 토종꿀의 평균 회분함량은 각각 0.889%, 0.570%로 아카시아꿀과 잡화꿀의 평균 회분 함량인 0.076%, 0.228%보다 높게 나타났으며 아카시아 꿀과 잡화꿀의 평균 회분 함량이 낮았다. Kim 등(1994)은 강원지역에서 수확한 꿀의 분석 연구에서 토종꿀의 회분 함량이 0.
- 5배 높았다고 하였다. 본 연구 결과에서도 밤꿀이 잡화꿀의 회분 함량에 비해 높았다. Chang 등(1987)의 연구에서도 밤꿀이 아카시아꿀보다 회분 함량이 높았다고 하여 본 실험의 결과와 일치하였다.
- 이상의 무기물 분석에서 K함량은 밤꿀>토종꿀>잡화꿀>아카시아꿀 순으로 높게 존재하였으며, 밤꿀의 K 함량이 아카시아꿀의 8배, 잡화꿀의 3배 정도 많이 함유하여 월등한 차이를 나타냈으나 토종꿀과 밤꿀의 차이는 적게 나타났다.
- 6% 이하였으며, adulterated honey의 회분 함량이 가장 낮았다고 하였다. 이상의 결과로 볼 때 회분 함량만으로는 순수한 꽃 꿀임을 구별할 수 없으며, 같은 밀원인 아카시아와 밤꿀의 회분 함량도 지역이나 기후조건 등에 따라 다양하게 나타남으로 밀원을 구별할 수 없는 것으로 생각된다.
- 밀원이 다른 각각의 벌꿀에 함유되어 있는 무기물을 측정한 결과는 Table 2 및 3에서와 같이 아카시아꿀의 무기물은 Ca 함량이 가장 높았으며, 그 다음으로 Na, K, Mg 함량 순으로 높았다. 밤꿀의 경우는 K 함량이 가장 높았고, Ca, Na, Mg, P 함량 순으로 높았고 Fe 함량이 가장 낮아 0.
- 6으로 양봉 꿀이 토종꿀보다 높게 나타났으며 자연 밀원 중 토종꿀과 양봉꿀을 식별할 수 있는 방법의 하나로 생각할 수 있다고 하였다. 그러나, 본 실험에서는 토종꿀이 양봉꿀보다 낮게 나타났지만 밤꿀 2, 3, 4, 5와 잡화꿀 2, 3, 5, 6은 토종꿀과 비슷하거나 더 낮게 나타나서 밀원의 종류나 토종과 양봉의 구별에 적용하기에는 부적절한 것으로 생각된다.
- 03으로 나타나 그 차이가 가장 컸다. 이상의 실험에서 토종꿀과 밤꿀의 K/Na ratio가 높게 나타나 Na 함량보다 K 함량이 높았음을 알 수 있었다. Kim과 Rhee(1996)는 토종꿀은 K/Na ratio가 10 이상을 보였으며, 특정지역의 꿀은 무려 170.
- 6의 높은 수치를 보였으나, 반면 양봉꿀은 1에 가까운 ratio를 보임으로써 토종꿀을 판별할 수 있는 중요한 지표로 이용될 수 있을 것으로 판단된다고 하였다. 그러나 본 실험에서는 양봉꿀인 아카시아꿀은 0.51-1.09, 밤꿀은 4.7-6.25, 잡화꿀은 0.84-43.03, 토종꿀은 1.95-4.58로 양봉꿀인 아카시아꿀과 잡화꿀은 잡화 2를 제외하고 토종꿀보다 낮게 나타났으나 토종꿀, 양봉 꿀 모두 10 이하였다. 양봉꿀인 밤꿀은 토종꿀보다 높게 나타났고 양봉꿀인 잡화꿀 2는 43.
- 75 mg/kg이였다. 토종꿀의 HMF 함량도 9.70-33.5 mg/kg로 나타났는데 그 중 토종꿀 2의 HMF 함량은 33.5 mg/kg으로 다른 시료에 비하여 매우 높았으며, 잡화꿀의 HMF 함량은 6.25-21.50 mg/kg으로 나타났다. Kim 등(1994)의 연구에서는 토종꿀의 HMF 함량이 0.
- 이상의 실험에서 아카시아꿀의 평균 HMF 함량은 11.07 mg/kg, 밤꿀의 평균 HMF 함량은 17.65 mg/kg, 토종꿀의 평균 HMF 함량은 16.40 mg/kg, 잡화꿀의 평균 HMF 함량은 10.49 mg/kg로 나타나 모두 규격 보다 월등히 낮았으며, 토종꿀이 아카시아 꿀과 잡화꿀보다 평균 HMF 함량이 다소 높게 나타난 것은 1년에 한번 채밀하므로 다른 양봉 꿀보다 긴 숙성기간을 갖게 되기 때문이라 생각된다. 밤꿀이 높은 HMF 값을 나타낸 것은 높은 fructose/glucose ratio(Jung et al.
- 135 mg%이었다고 하였다. 또한 가열처리를 했던 시료와 가열처리를 하지 않은 시료를 20℃에서 120일간 저장하였던 결과 가열처리 했던 꿀은 초기에 많이 생성되었는데 유채꿀은 0.029에서 0.195 mg%로 아카시아꿀이 0.059에서 0.225 mg%로 밤꿀이 0.059에서 0.135 mg%로 증가하였으며 저장과정에서 가열처리의 유무에 상관없이 HMF가 증가하는 기울기는 거의 같은 경향을 보였다고 하였다. 이상의 결과들을 검토해 볼 때 HMF 함량만으로 밀원의 구별은 어렵지만, adulterated bee honey의 경우 HFCS가 혼입되어 지면 HMF함량이 혼입여부를 구분할 수 있을 것으로 생각된다.
- 135 mg%로 증가하였으며 저장과정에서 가열처리의 유무에 상관없이 HMF가 증가하는 기울기는 거의 같은 경향을 보였다고 하였다. 이상의 결과들을 검토해 볼 때 HMF 함량만으로 밀원의 구별은 어렵지만, adulterated bee honey의 경우 HFCS가 혼입되어 지면 HMF함량이 혼입여부를 구분할 수 있을 것으로 생각된다.
- 그러나 Anklam 등(1998)의 연구에서는 설탕의 원료인 사탕무(C3식물)의 carbon isotope ratio가 C4식물의 당(옥수수, 사탕수수)보다 낮은 벌꿀의 밀원이 되는 대부분의 꽃 꿀과 유사한 carbon isotope ratio를 나타내서 C3식물인 사탕무 당의 오입은 구별하지 못했다고 하였다. 이상의 결과들을 고려해 볼 때 SCIR만으로는 벌꿀에 꽃 꿀 이외의 당 오입 여부, 특히 밀원의 종류를 구별하는 것은 어렵다고 판단된다.
- 밀원의 차이에 따른 벌꿀에 함유되어 있는 단백질의 분자량 차이를 조사하기 위하여 꿀 단백질의 SDS-PAGE pattern을 조사하여 각각의 벌꿀에서 나타난 단백질의 SDSPAGE에 의한 band의 분자량을 측정한 결과는 Table 7과 같다. 아카시아꿀 단백질의 SDS-PAGE에 의한 band의 분자량은 46.1-89.6 kDa이었고, 밤꿀의 단백질 band의 분자량은 31.9-117.9 kDa, 토종꿀 단백질 band의 분자량은 32.3-103.2 kDa, 잡화꿀의 단백질 band의 분자량은 band가 전혀 나타나지 않은 잡화 8번을 제외하고 33.5-100 kDa으로 다양하게 나타났다. Lee 등(1998)은 토종꿀에는 토종꿀만의 주요 단백질(56 kDa)이, 서양종 벌(Apis mellifera)에 의해 생산된 양봉꿀에는 양봉꿀만의 주요 단백질(59 kDa)이 각각 존재하는 것으로 나타났다고 하였다.
- 무기물 분석에서 K함량은 밤꿀>토종꿀>잡화꿀>아카시아꿀 순으로 높았으며, Ca함량은 아카시아꿀과 잡화꿀에서 가장 높았다.
- Lee 등(1998)은 토종꿀에는 토종꿀만의 주요 단백질(56 kDa)이, 서양종 벌(Apis mellifera)에 의해 생산된 양봉꿀에는 양봉꿀만의 주요 단백질(59 kDa)이 각각 존재하는 것으로 나타났다고 하였다. 본 연구에서도 양봉꿀 군 특이적인 단백질인 59 kDa의 단백질이 존재했으나 각 벌꿀 시료마다 약간의 차이가 있었으며, 토종꿀에서도 56 kDa과 유사한 57.3, 57.6 kDa의 단백질이 나타났다.
- 5 kDa의 단백질 band가 존재하였다. 그리고 밤꿀 4는 46.7 kDa, 밤꿀 5와 잡화꿀 9에서는 46.1 kDa를 나타내는 단백질이 있음을 확인할 수 있었다. Leonhardt(1996)는 immunoblotting을 이용하여 chestnut honey, forest honey, locust honey, sunflower honey의 단백질을 분리하였는데 꿀마다 공통되는 단백질과 다른 꿀과 구분되는 특정 단백질이 나타났다.
- 이상의 결과로 볼 때 꿀 속의 단백질이 소화액 기원의 효소류 단백질 외에 밀원식물의 기원 단백질도 존재하는 것으로 생각되어진다. 이는 다른 종류의 단백질이 존재하는 것이므로 밀원이 되는 식물이 다른 것으로 생각할 수 있다.
- 51이었다. 또한 HMF 함량은 밀원의 종류에 관계없이 다양하게 나타나, 아카시아꿀이 9.60-12.85 mg/kg, 밤꿀은 10.15-25.75 mg/kg, 토종꿀은 9.7-33.5 mg/kg, 잡화꿀은 6.25-21.5 mg/kg 이었으며, 토종꿀에서 가장 높았다. SDS-PAGE에 의한 단백질 band의 분자량 분석에서 양봉꿀의 특이적인 59 kDa 단백질이 모든 시료에서 나타났다.
- 5 mg/kg 이었으며, 토종꿀에서 가장 높았다. SDS-PAGE에 의한 단백질 band의 분자량 분석에서 양봉꿀의 특이적인 59 kDa 단백질이 모든 시료에서 나타났다. 밤꿀과 토종꿀에서 양봉꿀의 특이성을 나타내는 59.
- SDS-PAGE에 의한 단백질 band의 분자량 분석에서 양봉꿀의 특이적인 59 kDa 단백질이 모든 시료에서 나타났다. 밤꿀과 토종꿀에서 양봉꿀의 특이성을 나타내는 59.0 kDa의 단백질 band 이외에 31.9-33.5 kDa 단백질의 존재가 확인되었다. 72 kDa의 단백질 band도 몇 종의 밤꿀(71.
- 안정탄소동위원소 비율을 조사한 본 실험에서 아카시아꿀, 밤꿀, 잡화꿀, 토종꿀 대부분이 -24.0 ~-26.1‰의 분포를 보였으나 아카시아꿀 2와 잡화꿀 4의 안정 탄소 동위원소비율이 다소 낮았다.
후속연구
- 이상의 무기물 분석에서 K함량은 밤꿀>토종꿀>잡화꿀>아카시아꿀 순으로 높게 존재하였으며, 밤꿀의 K 함량이 아카시아꿀의 8배, 잡화꿀의 3배 정도 많이 함유하여 월등한 차이를 나타냈으나 토종꿀과 밤꿀의 차이는 적게 나타났다. 또한 아카시아꿀, 밤꿀, 토종꿀, 잡화꿀의 Ca 함량도 아카시아꿀과 잡화꿀이 비슷하게 함유하였고, 밤꿀과 토종꿀이 비슷하게 나타나서 밀원에 따른 차이로 규정하기에는 한계가 있다고 생각된다. Kim과 Rhee(1996)는 토종꿀의 무기성분 중 K의 함량이 가장 높았다고 하였으며, Chung 등(1984)도 유채꿀, 아카시아꿀, 밤꿀, 메밀꿀, 클로버꿀의 무기성분을 분석한 결과 K와 Na의 함량이 가장 높았으며 무기성분의 조성과 함량은 꿀의 종류에 따라 현저한 차이를 나타내었고 무기성분 중에서 K의 함량은 아카시아꿀이 13.
- 이는 다른 종류의 단백질이 존재하는 것이므로 밀원이 되는 식물이 다른 것으로 생각할 수 있다. 따라서 꿀벌뿐 아니라, 밀원 식물의 단백질도 SDSPAGE pattern에 영향을 주어 꿀 단백질의 SDS-PAGE에 의한 band의 분리와 분자량을 심도 있게 연구하여 이를 이용하면 토종꿀과 양봉꿀의 구별뿐 아니라 밀원별 구별이 가능하며 벌꿀 생성에 꿀벌의 관여 여부의 판별도 가능할 것으로 생각되어진다.
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