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문제 정의
- 실정이다. 따라서 본 연구에서는 벌꿀과 벌집채꿀의 항산화 성분과 활성을 측정하여 비교 분석함으로써 잠재적 천연물 기능성 식품 소재로서 벌집채꿀의 활용 가능성을 조사하였다.
제안 방법
- (1제주대학교 생명자원과학대학 바이오소재전공 독성학 실험실, 2제주대학교 아열대농업생명과학연구소) 본 연구에서는 야생화로부터 채밀한 제주 지역 벌꿀 및 벌집채꿀의 페놀성분 분석과 항산화 활성 비교평가를 시행하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과 물을 용매로 사용한 벌집채꿀에서 가장 높은 함량을 나타냈다.
- 4 mM DPPH 용액을 혼합하여 10분 동안 암반응 시켜주고 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료를 대조구와 비교하여 감소된 흡광도로부터 radical 제거율을 계산하였고, 50%의 DPPH radical을 소거하는 유효농도(EC50)를 계산하였다.
- 45 μm sy- ringe filter로 재차 여과하여 사용하였다[19]. 벌꿀의 경우 벌집채꿀 추출물과 같은 조건으로 시료를 제조하였고 왁스 성분을 제거할 필요가 없으므로 shaking incubator에서 제조를 마친 후 냉장보관한 뒤에 위와 동일한 방법으로 여과하였다.
- 0)에 녹인 10 mM sodium nitroprusside 50 μl를 첨가하여 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 여기에 griess reagent 100 μl를 가한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 무첨가군의 흡광도를 첨가군과 비교하여 NO. 소거 효과에 대하여 계산하였고, NO.
- 5분간 반응시킨 후 5% NaCO₃ 30 μl 를가하여 혼합하고 차광한 상태에서 1시간 동안 실온에 발색시킨 후 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 폴리페놀 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선을 통해 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 실온에서 10분간 반응시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측정하였다. 추출 용매를 대조구로 사용하여 시료와의 흡광도 차이를 통해 chelating 효과를 조사하였으며, ferrous ion chelating 50% 활성에 유효한 농도(EC50)를 계산하였다.
- 그 다음 1 M NaOH 60 μl 및 증류수 72 μl를 혼합하여 15분간 실온에서 반응시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 rutin을 사용하여 총 플라보노이드 함량(mg rutin equivalent/100 g dry weight)을 산출하였다.
- 1% ferric chloride 20 μl 를 혼합한 후 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 대조구의 흡광도와 비교하여 계산하였고, OD값이 0.5에 도달하는데 필요한 시료의 농도 (EC0.5)를 나타내었다.
대상 데이터
- 본 연구에서 사용된 벌꿀 및 벌집채꿀은 2014년도에 제주도지역 야생화로부터 채밀한 벌꿀 및 벌집채꿀을 ㈜한라산 식품으로부터 제공받아 사용하였다. 벌집채꿀은 잘게 분쇄하여 시료와 용매가 500 g/l가 되도록 물, 95% 에탄올을 첨가하여준 뒤 60℃의 shaking incubator에서 3시간 간격으로 3번 나누어서 추출하였다.
데이터처리
- 실험으로부터 측정된 결과치는 Student’s t-test 검정에 의한 평균값과 표준편차로 표시하였다.
이론/모형
- 2, 2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radical 소거 활성은 Kim 등[14]의 방법을 이용하였다. 0-10 mg/ml농도로 희석된 시료 100 μl를 96-well plate에 분주한 뒤 동량의 0.
- Chelating 활성은 Kim 등[15]에 의한 방법을 통해 측정하였다. 시료를 96-well plate에 250 μl 분주하고 2 mM ferrous chloride (FeCl2) 5 μl 을 첨가한 뒤 5 mM ferrozine[3-(2-pyr- idyl)-5, 6-diphenyl-1, 2, 4-triazine-p, p’-disulfonid acid mono- sodium salt hydrate] solution을 10 μl을 혼합하였다.
- Nitric oxide 소거능은 Kim 등[14]의 방법에 따라서 96-well plate에 농도 별로 희석한 시료 50 μl와 phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.0)에 녹인 10 mM sodium nitroprusside 50 μl를 첨가하여 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 여기에 griess reagent 100 μl를 가한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하여 무첨가군의 흡광도를 첨가군과 비교하여 NO.
- 총 폴리페놀 함량 측정은 Kim 등[17]의 방법에 의해 실행하였다. 시료용액 30 μl와 증류수 150 μl, 95% 에탄올 30 μl, 50% Folin-Ciocalteu reagent 15 μl를 첨가하여 잘 혼합하고 5분간 실온에 방치하였다.
- 총 플라보노이드 함량은 Kim 등[17]에 의한 방법을 이용하여 측정하였다. 실험에 앞서 준비한 시료 30 μl를 증류수 120 μl, 5% NaNO2 9 μl와 함께 혼합하여 6분간 방치한 후 10% AlCl3 9 μl를 첨가해 6분간 반응시킨다.
- 환원력은 Kim 등[15]에 의한 방법으로 측정하였다. 농도별로 준비한 벌꿀 및 벌집채꿀 시료 300 μl를 취하고, 200 mM sodium phosphate buffer (pH 6.
성능/효과
- 값으로 나타낸 것이다[4, 20]. 0-10 mg/ml 에서 벌꿀 및 벌집채꿀 추출물에 대한 환원력을 측정한 결과, 농도 의존적으로 환원력이 증가함을 보였다(Fig. 4). 벌꿀과 벌집채꿀추출물 모두 1 mg/ml까지는 농도별 흡광도 증가는 미미하였으나 5 mg/ml부터는 흡광도가 급격하게 증가하면서 환원력이 유의적으로 커지는 것을 알 수 있었으며, 700 nm에서의 OD 값이 0.
- 1에서 보여지듯이 시료의 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거 활성이 점진적으로 증가하는 것을 알 수 있으며, 가장 높은 농도인 10 mg/ml에서 벌꿀은 30%, 벌집채꿀은 60%의 소거활성을 보였다. DPPH radical을 50% 소거하는 유효농도(EC50) 값에서도 벌집채꿀은 7.3 mg/ml로 벌꿀(17.4 mg/ ml)에 비해 우수한 DPPH radical 소거 능력을 보였다 (p<0.05) (Fig. 1). 이 결과는 Kim 등[12]의 지역별 밤꿀과 벌집 채 꿀을 비교했을 때 순창지역의 밤꿀이 우수한 DPPH radical 소거능을 가지는 것과 유사한 결과이다.
- 3). EC50값을 비교한 결과, 벌집채꿀이 6.94 mg/ml로 벌꿀 (18.23 mg/ml)에 비해 우수한 chelating 활성을 가진 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- Fig. 1에서 보여지듯이 시료의 농도가 증가함에 따라 DPPH 소거 활성이 점진적으로 증가하는 것을 알 수 있으며, 가장 높은 농도인 10 mg/ml에서 벌꿀은 30%, 벌집채꿀은 60%의 소거활성을 보였다. DPPH radical을 50% 소거하는 유효농도(EC50) 값에서도 벌집채꿀은 7.
- 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과 물을 용매로 사용한 벌집채꿀에서 가장 높은 함량을 나타냈다. 또한 벌꿀 및 벌집채꿀 모두 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 양상을 보였으며, 이를 EC50 및 EC0.5 값으로 환산한 결과 벌집채꿀이 벌꿀에 비해 통계적으로 유의하게 높은 항산화 활성을 나타내었다. 상기의결 과를 종합하여 봤을 때 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성간의 높은 연관성이 있다는 것을 추측해볼 수 있었고 이를 상관관계를 통해 분석한 결과, 총 페놀 및 플라보노이드 성분의 함량과 항산화 활성이 통계적으로 유의한 상관관계를 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 이 결과는 Kim 등[12]의 지역별 밤꿀과 벌집 채 꿀을 비교했을 때 순창지역의 밤꿀이 우수한 DPPH radical 소거능을 가지는 것과 유사한 결과이다. 또한 본 연구결과는 7가지 밀원별 벌꿀의 DPPH 소거활성에 대한 EC50 값을 비교한 Bertoncelj 등[2]의 연구결과 가장 높은 소거능을 보인 포리스트 꿀(7.2 mg/ml)과 유사한 EC50 값을 보였다.
- 항산화 활성이 증가할수록 EC50 값이 감소하는 양상을 띄므로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 EC50 간에는 모두 음의 상관관계를 보이고 있고, 모든 상관계수가 절대값 1에 가까운 r2 값을 나타내어 성분함량이 증가함에 따라 항산화 활성이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있다(Table 2). 또한 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성 간의 상관관계에서 모두 0.05, 0.01 수준에서 유의함을 나타냈는데, 총 폴리페놀 함량과 환원력 간의 상관관계에서 r2=-0.989로 가장 높은 상관관계를 나타내었다(Table 2). 플라보노이드 함량과 항산화 활성간의 상관관계 역시 r2 값이 모두 0.
- 벌꿀과 벌집채꿀의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 증가함에 따라 항산화 활성이 증가하는 것을 추측해 볼 수 있고, 여타 연구결과들과 비교했을 때 특히 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성간의 높은 상관관계를 가지고 있다는 것을 알 수 있었다[12, 13]. 이에 따라 벌꿀 및 벌집 채 꿀의 항산화 성분 함량과 항산화 활성(EC50) 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 2와 같다.
- 4). 벌꿀과 벌집채꿀추출물 모두 1 mg/ml까지는 농도별 흡광도 증가는 미미하였으나 5 mg/ml부터는 흡광도가 급격하게 증가하면서 환원력이 유의적으로 커지는 것을 알 수 있었으며, 700 nm에서의 OD 값이 0.5에 도달하기 위한 농도(EC0.5)를 비교한 결과 벌집 채 꿀이 8.2 mg/ml로 벌꿀(17.7 mg/ml)에 비해 환원력이 우수하다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5).
- 3). 벌꿀은 0.5 mg/ml 농도에서 4%의 미미한 활성을 보였으나 10 mg/ml에서는 28%로 약 7배의 활성 증가를 보였고, 벌집채꿀 또한 9%에서 63%로 7배의 급격한 활성 증가를 보였다(Fig. 3). EC50값을 비교한 결과, 벌집채꿀이 6.
- 결과는 Table 1과 같다. 벌집채꿀의 총 폴리페놀은 물 추출 시 268.9±10.45 mg/100 g으로 에탄올 추출물(229.5±3.11 mg/100 g) 보다 유의적으로 높은 함량을 보였는데(p<0.05), 이는 추출 용매에 대한 용해력의 차이로 기인되었다 생각된다. 또한 본 연구에서 벌집채꿀이 벌꿀과 비교하여 128% 이상 높은 총 폴리페놀 함량을 보였는데(Table 1), 이는 벌집채꿀이꿀 외에도 프로폴리스, 천연밀랍, 로열젤리, 벌집, 화분 등 많은 활성물질을 함유하고 있기 때문이라 생각되며 향후 벌집채꿀의 개별성분에 대한 보다 구체적이고 상세한 연구가 필요하다 사료된다.
- 벌집채꿀의 총 플라보노이드 함량은 물 추출물이 54.2 mg/100 g, 에탄올 추출물이 50.6 mg/100 g으로 용매에 따른 통계적 유의차를 보이지 않았으며, 벌꿀 역시 같은 경향을 보였다(Table 1).
- 환원력이 더 우수함을 입증하였다. 본 연구에서 사용한 벌집 채 꿀이 벌꿀보다 좀 더 짙은 색을 띄는 것으로 보았을 때 상기의 연구 결과와 같은 경향을 보이는 것을 알 수 있었다.
- Ferrozinee 금속과 결합하여 색깔이 변하는 발색제로 ferrozine과 ferrous ion의 chelat- ing 작용이 억제되는 정도를 측정함으로써 항산화 활성을 나타낸다[18]. 본 연구에서 야생화로부터 채밀한 벌꿀 및 벌집채꿀 시료의 chelating 활성을 측정한 결과, 0.5-10 mg/ml까지 농도 의존적으로 그 활성이 증가함을 알 수 있었다(Fig. 3). 벌꿀은 0.
- 5 값으로 환산한 결과 벌집채꿀이 벌꿀에 비해 통계적으로 유의하게 높은 항산화 활성을 나타내었다. 상기의결 과를 종합하여 봤을 때 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성간의 높은 연관성이 있다는 것을 추측해볼 수 있었고 이를 상관관계를 통해 분석한 결과, 총 페놀 및 플라보노이드 성분의 함량과 항산화 활성이 통계적으로 유의한 상관관계를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 잠재적 천연식품소재로의 벌집채꿀의가능성을 시사하며 향후 이에 대한 체계적인 연구가 필요하다 사료된다.
- 5 mg/ml에서 NO. 소거능은 벌꿀이 18%, 벌집채꿀은 23%로 큰 차이를 보이지 않았지만 10 mg/ml에서 그 소거능이 각각 1.6배, 3배 증가하였다(Fig. 2). 벌집채꿀의 EC50값은 6.
- 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량 측정 결과 물을 용매로 사용한 벌집채꿀에서 가장 높은 함량을 나타냈다. 또한 벌꿀 및 벌집채꿀 모두 농도 의존적으로 항산화 활성이 증가하는 양상을 보였으며, 이를 EC50 및 EC0.
- 총 폴리페놀 함량 결과와 마찬가지로 벌집채꿀 물과 에탄올 추출물들(54.2 mg/100 g과 50.6 mg/100 g)이 벌꿀 추출물들 (42.3 mg/100 g과 44.4 mg/100 g)에 비해 유의적으로 높은 총 플라보노이드 함량을 보였다(Table 1). 일반적으로 벌꿀의 폴리페놀 및 플라보노이드 함량은 색이 진할수록 높은 것으로 알려져 있는데[13], 본 연구에서 사용된 벌꿀은 비교적 맑은 편이나 벌집채꿀은 진한 암갈색을 띠어 이와 부합된 결과를 보이고 있다.
- 9 이상으로 매우 높은 상관관계를 보였다. 특히 주목해야 할 것은 플라보노이드 함량과 chelating 활성과의 상관관계에서 r2= -0.957로 0.01 수준에서 유의함을 나타냈는데, 폴리페놀과 의상관 관계에서 r2= -0.875로 0.05 수준에서 유의한 것과 비교했을 때 chelating 활성은 총 폴리페놀 화합물 중 비 플라보노이드 물질보다는 플라보노이드 물질과 더 큰 상관관계가 있다는 것을 추측해 볼 수 있다.
- 이에 따라 벌꿀 및 벌집 채 꿀의 항산화 성분 함량과 항산화 활성(EC50) 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 2와 같다. 항산화 활성이 증가할수록 EC50 값이 감소하는 양상을 띄므로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 EC50 간에는 모두 음의 상관관계를 보이고 있고, 모든 상관계수가 절대값 1에 가까운 r2 값을 나타내어 성분함량이 증가함에 따라 항산화 활성이 유의적으로 증가하는 것을 알 수 있다(Table 2). 또한 총 폴리페놀 함량과 항산화 활성 간의 상관관계에서 모두 0.
후속연구
- 또한 Kim 등[13]의 연구에서, 메밀꿀(171 μg GAE/g)이 유채꿀(126 μg GAE/g) 보다 높은 총 폴리페놀 함량을 보인 반면 메밀꿀(99 μg quercetin equivalent/g)의 총 플라보노이드는 유채꿀(102 μg quercetin equivalent/g)에 비해 낮은 함량을 보여, 유채꿀이 가지는 폴리페놀성 화합물 중 플라보노이드 성분이 매우 큰 비중을 차지하고 있는 것으로 나타났는데, 본 연구에서 높은 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량을 나타낸 벌꿀과 벌집채꿀 추출물들의 성분 비율을 비교하였을 때 총 폴리페놀 화합물 중 플라보노이드 함량이 약 20-24%의 낮은 비율을 가지는 상반된 결과를 보였다(Table 1). 따라서 향후 본 연구에서 사용된 야생화 채밀 벌꿀과 벌집 채 꿀의 어떤 비 플라보노이드 성분이 플라보노이드와 함께 항산화 활성과 상관관계가 있는지에 대한 구체적인 연구가 필요하다고 사료된다.
- 05), 이는 추출 용매에 대한 용해력의 차이로 기인되었다 생각된다. 또한 본 연구에서 벌집채꿀이 벌꿀과 비교하여 128% 이상 높은 총 폴리페놀 함량을 보였는데(Table 1), 이는 벌집채꿀이꿀 외에도 프로폴리스, 천연밀랍, 로열젤리, 벌집, 화분 등 많은 활성물질을 함유하고 있기 때문이라 생각되며 향후 벌집채꿀의 개별성분에 대한 보다 구체적이고 상세한 연구가 필요하다 사료된다.
- 소거능 차이를 확인할 수 있었는데, 실온 보관에서는 1개월 이내에 소거활성이 감소하였고 4℃에서 보관한 경우 6개월 이후부터 소거활성이 감소한 반면에, -20℃에서는 유의적인 감소의 차이를 보이지 않았다[7]. 본 연구의 벌집채꿀 또한 온도나 보관 기간에 따른 항산화 활성 및 생리활성물질의 변화를 보일 수 있으므로 이와 같은 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
- 상기의결 과를 종합하여 봤을 때 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량과 항산화 활성간의 높은 연관성이 있다는 것을 추측해볼 수 있었고 이를 상관관계를 통해 분석한 결과, 총 페놀 및 플라보노이드 성분의 함량과 항산화 활성이 통계적으로 유의한 상관관계를 나타냄을 확인할 수 있었다. 이러한 결과들은 잠재적 천연식품소재로의 벌집채꿀의가능성을 시사하며 향후 이에 대한 체계적인 연구가 필요하다 사료된다.
- 20 mg/ml) 이 수치들과 비교했을 때 높은 폴리페놀 함량을 지니고 있음을 알 수 있었다(Table 1). 이와같이 벌꿀 및 벌집채꿀에 대한 총 폴리페놀 성분 및 함량은 생산지역 및 시기뿐만 아니라 밀원에 따라 차이가 발생할 수 있기에 향후 이에 대한 비교연구가 수행되어야 할 것으로 사료된다.
- Johnston 등[11]의 연구에서 소고기 패티에 꿀을 첨가하여TBARS 값을 측정한 결과 클로버꿀과 야생화꿀이 패티의 지방산화를 저해한다는 연구결과를 발표하였다. 현재 식품에 첨가되는 합성 항산화제의 안전성 문제를 해결하기 위한 천연 항산화제 개발 연구가 활발하게 이루어지고 있는데[22], 본 연구결과는 우수한 chelating 활성을 나타낸 벌집 채 꿀의 잠재적 식품산화방지제로서 활용가능성을 제시하고 있다.
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