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제안 방법
- mirabilis)의 atpase (8) 프로모터(copper-translocating P-type ATPase gene)와 PMTR 단백질 사이의 결합을 관찰하였다. 그리고 DNase I protection 실험으로 P. mirabilis의 atpase 프로모터에서 PMTR 단백질의 결합부위와 단백질 결합에 따른 DNA 구조적 변화를 관찰하였다.
- 단백질 결합 부위와 단백질 결합에 따른 DNA의 구조 변화를 관찰하기 위하여 DNase I protection 실험을 수행하였다. 먼저 증폭에 필요한 한 가닥의 프라이머를 γ32P ATP가 존재하는 상태에서 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)를 처리한 이후에 PROT1 플라즈미드(12)로부터 atpase 프로모터를 PCR로 증폭하였다.
- 6에 도달된 후, PMTR 단백질은 isopropyl β-D-thiogalactopyranoside (IPTG)를 부가하여 25°C에서 4시간 동안 유도되었다. 단백질 분리는 Ni-NTA 아가로스(agarose) 수지(Qiagen)와 이미다졸(imidazole) 농도 기울기를 이용하여 단백질을 분리하였다. 순수하게 분리된 PMTR 단백질은 15% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 확인하였으며, 95% 이상의 순도를 갖는다(자료 미제시).
- 먼저 증폭에 필요한 한 가닥의 프라이머를 γ32P ATP가 존재하는 상태에서 폴리뉴클레오티드 키나제(polynucleotide kinase)를 처리한 이후에 PROT1 플라즈미드(12)로부터 atpase 프로모터를 PCR로 증폭하였다.
- 본 연구는 겔 시프트 법(gel shift assay)을 이용하여 E. coli의 copA (copper-translocating P-type ATPase gene) (14)와 zntA (zinc-translocating P-type ATPase gene) (13) 프로모터 그리고 Proteus mirabilis (P. mirabilis)의 atpase (8) 프로모터(copper-translocating P-type ATPase gene)와 PMTR 단백질 사이의 결합을 관찰하였다. 그리고 DNase I protection 실험으로 P.
- 위의 각 가닥과 상보적인 가닥을 동일한 몰수로 취하여 10 mM sodium cacodylate (pH 6.5) 용액에서 80°C에서 10분 동안 중탕한 후 서서히 실온으로 냉각시킴으로써, 겔 시프트 법에 필요한 duplex DNA를 준비하였다.
- 이 결과를 토대로 세포 내·외 조건에서 구축된 재조합 유전자를 이용한 전사실험(transcription assay)을 통하여 중금속에 의한 유전자의 전사과정 조절을 관찰한다.
- 이와 동일한 실험 결과(14)가 CueR 단백질에도 관찰되었으며, CueR 단백질만 존재할 때 보다 Cu(II)와 Cu(I) 이온이 존재할 때 DNA 결합에 필요한 단백질의 농도가 증가함을 보였다. 이런 PMTR 단백질의 DNA 결합력이 높은 중금속 농도에서 중금속과의 결합으로 인한 단백질의 구조적인 변화 가능성을 CD (circular dichroism) 스펙트럼으로 관찰하였다(미발표 자료). CD 스펙트럼에 의하면 100 μM 중금속이 존재할 때 먼 UV 파장 범위(far UV region)에서 PMTR 단백질의 알파 나선이 59.
- 앞에서 언급되었듯이, pmtR 유전자를 포함한 재조합 플라즈미드로 형질 전환된 대장균에서 PMTR 단백질이 어떤 작용을 통하여 아연 이온 저항성을 증가시켰는지 지금은 설명할 수 없다. 하지만 이를 설명하기 위하여, 우선 구리 이온 뿐만 아니라 아연 이온의 단백질 결합을 확인하기 위하여 1-5 mM DTT (dithiothreitol) 조건에서 하나의 subunit에 결합하는 이온 수를 ICP (Inductively Coupled Plasma) mass spectrometer로 확인 중이다. 이 결과를 토대로 세포 내·외 조건에서 구축된 재조합 유전자를 이용한 전사실험(transcription assay)을 통하여 중금속에 의한 유전자의 전사과정 조절을 관찰한다.
대상 데이터
- 이렇게 준비된 반응 용액을 TAE 완충용액(Tris-Acetate EDTA)에서 12% 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 겔은 건조하여 470 nm 들뜬(excitation) 파장과 535 nm 방출(emission)파장에서 코닥 이미지 스캐너(Kodak image scanner)로 자료를 얻었다. 겔 시프트 법(Fig.
- DNase I 실험의 반응 조건은 겔 시프트 법과 동일한 조건을 사용하였다. 전기영동이 끝난 겔은 건조하여 포스포 이미지 스캐너(phosphoimager scanner, Kodak)를 사용하여 자료를 얻었다. 그리고 DNA 염기 서열 결정 반응은 Maxam과 Gilbert 방법(10)을 사용하였다.
이론/모형
- Dot lines (----) shown above DNA sequences indicate the protected region by PMTR protein. G and A sequencing reactions were conducted by Maxam and Gilbert sequencing methods. + and - symbols denote either in the presence or absence of PMTR, respectively.
- 전기영동이 끝난 겔은 건조하여 포스포 이미지 스캐너(phosphoimager scanner, Kodak)를 사용하여 자료를 얻었다. 그리고 DNA 염기 서열 결정 반응은 Maxam과 Gilbert 방법(10)을 사용하였다. Fig.
- 순수하게 분리된 PMTR 단백질은 15% SDS-PAGE (sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis)에 의하여 확인하였으며, 95% 이상의 순도를 갖는다(자료 미제시). 단백질의 농도는 계산에 의한 몰 흡광계수 값(6)과 BSA단백질을 이용한 Lowry 방법으로 결정된 농도를 비교하여 결정되었다.
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