김치유래 Lactobacillus sakei OPK2-59의 ${\\gamma}$-Aminobutyric Acid 생성 및 Glutamate Decarboxylase 활성 ${\\gamma}$-Aminobutyric Acid Production and Glutamate Decarboxylase Activity of Lactobacillus sakei OPK2-59 Isolated from Kimchi원문보기
김치로부터 분리한 유산균 Lactobacillussakei OPK2-59는 ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA) 생성능력과 glutamate decarboxylase(GAD) 활성을 보유하고 있음이 확인되었다. Lactobacillus sakei OPK2-59를 59.13 mM과 177.40 mM monosodium glutamate (MSG)가 함유된 MRS 배지에서 배양하면 균주의 성장을 위한 최적 온도범위와 pH는 각각 $25-37^{\circ}C$와 6.5였다. 59.13 mM과 177.40 mM MSG 함유 MRS 배지에서 배양온도 $25^{\circ}C$ 조건에서, 48시간 배양하였을 경우 MSG의 GABA 전환율은 각각 99.58%와 31.00%였다. 또한 Lactobacillus sakei OPK2-59 세포추출액을 이용하여 MSG를 GABA로 전환할 수 있었으며, 추출물에 의한 GABA 전환율은 $30^{\circ}C$, pH 5 조건에서 78.51%로 가장 높았다. 세포추출액에 의한 MSG의 GABA 전환에 미치는 무기염의 영향을 조사한 결과 $CaCl_2$, $FeCl_3$, $MgCl_2$를 첨가한 반응액에서 염을 넣지 않고 반응한 control보다 GABA 전환율이 2-3배 증진되는 것으로 조사되었다. 이러한 결과들은 김치 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59의 GABA 생성능은 유산균 세포 내에 존재하는 GAD에 의한 것이며, GAD에 의한 GABA 전환율은 무기염에 의하여 증진될 수 있음을 제안해 주는 것이다.
김치로부터 분리한 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59는 ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA) 생성능력과 glutamate decarboxylase(GAD) 활성을 보유하고 있음이 확인되었다. Lactobacillus sakei OPK2-59를 59.13 mM과 177.40 mM monosodium glutamate (MSG)가 함유된 MRS 배지에서 배양하면 균주의 성장을 위한 최적 온도범위와 pH는 각각 $25-37^{\circ}C$와 6.5였다. 59.13 mM과 177.40 mM MSG 함유 MRS 배지에서 배양온도 $25^{\circ}C$ 조건에서, 48시간 배양하였을 경우 MSG의 GABA 전환율은 각각 99.58%와 31.00%였다. 또한 Lactobacillus sakei OPK2-59 세포추출액을 이용하여 MSG를 GABA로 전환할 수 있었으며, 추출물에 의한 GABA 전환율은 $30^{\circ}C$, pH 5 조건에서 78.51%로 가장 높았다. 세포추출액에 의한 MSG의 GABA 전환에 미치는 무기염의 영향을 조사한 결과 $CaCl_2$, $FeCl_3$, $MgCl_2$를 첨가한 반응액에서 염을 넣지 않고 반응한 control보다 GABA 전환율이 2-3배 증진되는 것으로 조사되었다. 이러한 결과들은 김치 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59의 GABA 생성능은 유산균 세포 내에 존재하는 GAD에 의한 것이며, GAD에 의한 GABA 전환율은 무기염에 의하여 증진될 수 있음을 제안해 주는 것이다.
Lactobacillus sakei OPK2-59 isolated from kimchi was found to have ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA) producing ability and glutamate decarboxylase (GAD) activity. When the Lactobacillus sakei OPK2-59 was cultured in MRS broth with 59.13 mM and 177.40 mM monosodium glutamate (MSG), the o...
Lactobacillus sakei OPK2-59 isolated from kimchi was found to have ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA) producing ability and glutamate decarboxylase (GAD) activity. When the Lactobacillus sakei OPK2-59 was cultured in MRS broth with 59.13 mM and 177.40 mM monosodium glutamate (MSG), the optimum temperature range and pH for growth were $25-37^{\circ}C$ and pH 6.5, respectively. GABA conversion rates in MRS broth with 59.13 mM and 177.40 mM MSG were 99.58% and 31.00%, respectively at $25^{\circ}C$ and 48 h of cultivation. By using the cell free extract of Lactobacillus sakei OPK2-59, MSG was converted to GABA and the conversion rate was 78.51% at $30^{\circ}C$, pH 5. Conversion of MSG to GABA was enhanced by adding salts such as $CaCl_2$, $FeCl_3$, $MgCl_2$. These data suggest that the ability of Lactobacillus sakei OPK2-59 to produce GABA results from the activity of GAD in the cells and GABA conversion by the cell extract containing GAD can be enhanced by $CaCl_2$, $FeCl_3$, $MgCl_2$.
Lactobacillus sakei OPK2-59 isolated from kimchi was found to have ${\gamma}$-aminobutyric acid (GABA) producing ability and glutamate decarboxylase (GAD) activity. When the Lactobacillus sakei OPK2-59 was cultured in MRS broth with 59.13 mM and 177.40 mM monosodium glutamate (MSG), the optimum temperature range and pH for growth were $25-37^{\circ}C$ and pH 6.5, respectively. GABA conversion rates in MRS broth with 59.13 mM and 177.40 mM MSG were 99.58% and 31.00%, respectively at $25^{\circ}C$ and 48 h of cultivation. By using the cell free extract of Lactobacillus sakei OPK2-59, MSG was converted to GABA and the conversion rate was 78.51% at $30^{\circ}C$, pH 5. Conversion of MSG to GABA was enhanced by adding salts such as $CaCl_2$, $FeCl_3$, $MgCl_2$. These data suggest that the ability of Lactobacillus sakei OPK2-59 to produce GABA results from the activity of GAD in the cells and GABA conversion by the cell extract containing GAD can be enhanced by $CaCl_2$, $FeCl_3$, $MgCl_2$.
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문제 정의
또한 유산균의 GABA 생성능은 균주가 보유하고 있는 GAD의 활성화 정도에 따라서도 크게 달라질 수 있는 것으로 예측되고 있다. 따라서 본 연구는 우리고유의 김치로부터 분리한 유산균의 GABA 생성과 GAD 활성화에 관한 것으로 김치 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59를 이용한 효율적인 GABA 생성을 위한 기초자료를 마련하고자 수행 하였다.
제안 방법
1, 2차 회수한 상등액을 합하여 동결건조 하였고, 초 순수로 용해하여 0.45 μm PVDF 막을 통과시켜 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.
9×150 mm AccQ·TagTM (Nova-PakTM C18, Waters) 칼럼으로 유도체들을 분리하였다(31). GABA 및 glutamic acid 함량은 표준 GABA 및 glutamic acid (Sigma)의 HPLC 및 GABase 분석 결과를 토대로 작성한 표준곡선을 이용하여 산출하였다.
GABase를 이용한 GABA 정량은 GABA 표준 곡선(Abs=0.0004×X mM+0.028, R2=0.9878)을 이용하여 산출하였다(6).
GAD 분석을 위하여 기질 완충액[100 mM sodium acetate/100 mM acetate 완충액 (pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0), 59.13 mM glutamate, 0.01 mM PLP]를 조효소액과 2:1 (v/v)비율로 혼합하여 25, 30, 37, 40℃에서 각각 60분간 반응시킨 후 끓는물에 2분간 넣어 효소반응을 정지 시켰다. 반응이 종료된 효소 반응액을 0.
45 μm PVDF 막을 통과시켜 TLC와 GABase 분석 시료로 사용하였다(6). GAD 효소 활성에 미치는 pH, 온도의 영향을 조사하기 위하여 기질 완충액(100 mM sodium acetate/100 mM acetate 완충액)의 pH를 pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 온도를 25, 30, 37, 40℃ 범위에서 MSG를 첨가하여 반응시킨 반응액을 TLC와 GABase로 GABA를 측정하여 비교하였다. 무기염이 효소활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 MgCl2, NaCl, MnCl2, CaCl2, FeCl3을 각 반응액에 20 mM의 농도로 첨가하고 조효소액과 혼합 후 37℃, 60분간 반응하여 생성된 GABA를 GABase로 정량하였다(6, 13).
HPLC (Waters, Milford, USA) 분석을 위해 시료는 6-aminoquioly-N-hydroxysuccinimidyl carbonate (AQC)로 유도체화 하였고, 3.9×150 mm AccQ·TagTM (Nova-PakTM C18, Waters) 칼럼으로 유도체들을 분리하였다(31).
MSG 농도에 따른 균주 성장 및 pH 변화를 조사하기 위하여 MSG가 0, 59.13, 177.40 mM 첨가된 MRS 배지(pH 6.5)에 균주를 접종한 후 25, 30, 37℃ 조건에서 0, 6, 12, 24, 30, 36, 48 시간 배양하면서 600 nm에서 흡광도를 측정하여 균주의 성장과 pH변화를 모니터링 하였다.
TLC를 이용한 분석을 위해 각 균주 배양액 혹은 효소 반응액 0.9 μl를 TLC 판에 분주하여 아래의 조건에서 분석을 실시하였다.
Lb. sakei OPK2-59 균주에 의한 GABA 생성능을 조사하기 위해 MSG가 0, 59.13, 177.40 mM 첨가된 MRS 배지(Difco, pH 6.5)를 이용하여 25, 30, 37℃ 조건에서 균주를 배양 후 TLC와 GABase를 이용하여 GABA 분석을 실시하였다. Lb.
김치로부터 분리한 Lb. sakei OPK2-59 균주의 성장을 위한 pH 및 온도의 영향을 조사한 결과 pH 6.5와 25℃, 30℃, 37℃에서 24시간 배양으로 다른 pH와 온도에 비하여 최적의 성장율을 기록하였다(Fig. 1). Lb.
9 μl를 TLC 판에 분주하여 아래의 조건에서 분석을 실시하였다. 각 시료를 TLC 판에 분주한 후 butanol:acetic acid:water=4:1:1를 전개용매로 사용하여 전개하였다. 전개된 TLC 판을 0.
균주 성장을 위한 최적 pH를 조사하기 위하여 100 mM sodium acetate/100 mM acetate 완충액(pH 3.0, 4.0, 5.0), 100 mM NaH2PO4/100 mM Na2HPO4 완충액(pH 6.5, 7.0), 100 mM Tris-HCl/200 mM HCl 완충액(pH 8.0), 100 mM glycine/200 mM NaOH 완충액(pH 9.0), 25 mM sodium bicarbonate/100 mM NaOH 완충액(pH 10.0)으로 modified MRS 배지를 조제하여 균주를 30℃에서 24시간 배양하였다. 최적온도를 조사하기 위하여 MRS 배지(Difco, pH 6.
기질용액과 조효소액을 혼합하여 각 온도 별로 pH를 달리하여 60분간 반응시킨 뒤 2분 끓여 반응 종료 후 GABA를 분석하였다. Fig.
0, 온도를 25, 30, 37, 40℃ 범위에서 MSG를 첨가하여 반응시킨 반응액을 TLC와 GABase로 GABA를 측정하여 비교하였다. 무기염이 효소활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 MgCl2, NaCl, MnCl2, CaCl2, FeCl3을 각 반응액에 20 mM의 농도로 첨가하고 조효소액과 혼합 후 37℃, 60분간 반응하여 생성된 GABA를 GABase로 정량하였다(6, 13). GAD 효소활성은 효소추출액 중의 단백질 mg당 GABA 생성량 혹은 무기염 무첨가군에 대한 상대적인 GABA 생성량으로 표기하였다.
세포 추출액을 제조하기 위하여 MSG가 59.13 mM 첨가된 MRS 배지(pH 6.5, 37℃)에서 48시간 배양하여 600 nm에서 흡광도를 측정하고 원심분리(4℃, 13,000×g, 15 min)하여 세포를 수집한 후 멸균수로 2회 이상 세척하였다.
수집된 세포에 cell lysis 완충액[20 mM sodium phosphate buffer, 0.1 mM PLP (pyridoxal-5-phosphate), 1% triton X-100, 1 mM PMSF, pH 7.0]를 세포무게와 동일한 양 첨가하여 혼합 후 lysozyme (200 μg/ml)을 넣고 37℃에 30분간 lysis 하여 얼음에 5분간 정치 후 sonication (500 W, 1분, 5회)을 얼음에서 반복 실시하였다.
각 시료를 TLC 판에 분주한 후 butanol:acetic acid:water=4:1:1를 전개용매로 사용하여 전개하였다. 전개된 TLC 판을 0.2% ninhydrin을 이용하여 발색하여 생성물 GABA spot과 기질 glutamic acid spot을 확인하였다. GABase 를 이용한 GABA의 정량은 반응액(총 1 ml)에 시료 20 μl, 1 unit GABase [Pseudomonas fluorescens (Sigma)] 40 μl, 10 mM β-NADP+ (Sigma) 140 μl, 100 mM potassium pyrophosphate (pH 8.
0)으로 modified MRS 배지를 조제하여 균주를 30℃에서 24시간 배양하였다. 최적온도를 조사하기 위하여 MRS 배지(Difco, pH 6.5)를 이용하여 4, 10, 25, 30, 37, 40℃ 범위에서 균주를 배양하였다.
대상 데이터
반응이 종료된 효소 반응액을 0.45 μm PVDF 막을 통과시켜 TLC와 GABase 분석 시료로 사용하였다(6).
sakei OPK2-59는 김치유래의 유산균으로 균주의 형태학적 및 생화학적 특성이 조사된 바 있다(3, 26). 본 실험에 사용한 배지 및 배지 첨가 시약은 MRS broth (Difco, USA), monosodium glutamate (MSG) (Daeyoung Chemicals, Korea), CaCl2, FeCl3, MnCl2, MgCl2 (Sigma Chemical Co., USA) 등이다.
이론/모형
9878)을 이용하여 산출하였다(6). HPLC를 이용한 GABA 및 glutamate 정량은 Baum 등(4)이 사용한 아미노산 분석방법을 기초로 하여 약간 수정한 방법(27)을 사용하였다. 간략하게 methanol:chloroform:water가 12:5:3으로 혼합된 용매 800μl를 효소반응액 혹은 배양액 시료 200 μl에 가하여 vortex로 혼합하였다.
파괴된 세포에서 추출액을 회수하기 위하여 원심분리(4℃, 13,000×g, 15분)하여 상등액을 취한 뒤 세포추출액(조효소액)으로 사용하였으며, 얻어진 추출액은 Bradford 측정법(5)을 이용하여 단백질 양을 정량하였고, 각 분석에 사용하였다.
성능/효과
5와 같다. 20 mM 무기염 (MgCl2, FeCl3, CaCl2)을 첨가한 효소 반응액에서는 무기염 무 첨가 반응액에서 보다 GABA 생성량을 기준으로한 GAD 활성이 2-3배 가량 높은 것으로 조사되었다(Fig. 5). 또한 NaCl은 효소 활성을 약간 증진 시킨 반면 MnCl2는 감소시키는 것으로 조사되었다.
37°C 배양의 경우 25°C와 30°C 배양과 비교하여 균주 성장율에 있어서는 차이를 보이지 않는 것으로 조사되었기에(Fig. 2), 온도에 따른 GABA 전환율의 차이는 GABA 전환을 담당하는 효소인 GAD의 활성화에 온도가 영향을 주었을 것으로 판단된다.
59.13 mM MSG 첨가의 경우 25°C와 30°C 배양 조건에서 48시간 배양으로 각각 99.58%와 87.84% 전환율을 보임을 확인하였다.
5였다. 59.13 mM과 177.40 mM MSG 함유 MRS 배지에서 배양온도 25℃ 조건에서, 48시간 배양하였을 경우 MSG의 GABA 전환율은 각각 99.58%와 31.00%였다. 또한 Lactobacillus sakei OPK2-59 세포추출액을 이용하여 MSG를 GABA 로 전환할 수 있었으며, 추출물에 의한 GABA 전환율은 30℃, pH 5 조건에서 78.
기질용액과 조효소액을 혼합하여 각 온도 별로 pH를 달리하여 60분간 반응시킨 뒤 2분 끓여 반응 종료 후 GABA를 분석하였다. Fig. 4에서와 같이 30℃, pH 5.0 반응액의 조건에서 GABA 생성이 가장 많이 생성됨을 확인하였다(GABA 전환율 78.51%). 또한 기질용액에 첨가한 MSG는 30℃, pH 5.
TLC 분석을 통한 GABA 생성 패턴을 보면 59.13 mM MSG 첨가의 경우 25℃와 30°C 배양조건에서 24시간 동안 배양으로 MSG의 소모가 현저하고 GABA 생성이 뚜렷하게 관찰됨을 알 수 있었다.
Lb. sakei OPK2-59 균주는 배양 온도 및 MSG 첨가와는 상관없이 배양 시작 6시간을 기점으로 대수 증식기가 시작되었으며, 24시간을 기점으로 정지기에 접어드는 것으로 나타났다(Fig. 2). pH의 변화의 경우 배양 6시간을 기점으로 감소하여 정지기에 접어드는 24시간까지 감소하다가 MSG의 존재 유무와 함량에 따라서 약간씩 다른 변화 패턴을 보였다.
김치로부터 분리한 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59는γ-aminobutyric acid (GABA) 생성능력과 glutamate decarboxylase (GAD) 활성을 보유하고 있음이 확인되었다.
또한 177.40 mM MSG 첨가의 경우 25°C와 30°C 배양조건에서 48시간 배양으로 31.00%와 31.52% 전환율을 보임을 확인하였다(Table 1).
00%였다. 또한 Lactobacillus sakei OPK2-59 세포추출액을 이용하여 MSG를 GABA 로 전환할 수 있었으며, 추출물에 의한 GABA 전환율은 30℃, pH 5 조건에서 78.51%로 가장 높았다. 세포추출액에 의한 MSG의 GABA 전환에 미치는 무기염의 영향을 조사한 결과 CaCl2, FeCl3, MgCl2를 첨가한 반응액에서 염을 넣지 않고 반응한 control보다 GABA 전환율이 2-3배 증진되는 것으로 조사되었다.
51%). 또한 기질용액에 첨가한 MSG는 30℃, pH 5.0조건에서 상대적으로 적게 잔존하는 것으로 나타났다(자료 미제시). 유산균 유래의 GAD 활성에 미치는 최적 pH는 다양하게 나타나고 있다.
51%로 가장 높았다. 세포추출액에 의한 MSG의 GABA 전환에 미치는 무기염의 영향을 조사한 결과 CaCl2, FeCl3, MgCl2를 첨가한 반응액에서 염을 넣지 않고 반응한 control보다 GABA 전환율이 2-3배 증진되는 것으로 조사되었다. 이러한 결과들은 김치 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59의 GABA 생성능은 유산균 세포 내에 존재하는 GAD에 의한 것이며, GAD에 의한 GABA 전환율은 무기염에 의하여 증진될 수 있음을 제안해 주는 것이다.
이 결과를 통해 25°C와 30°C 배양조건에서는 59.13 mM과 177.40 mM MSG첨가의 경우 GABA로의 전환율이 큰 차이를 보이지 않고 있음을 알 수 있다.
세포추출액에 의한 MSG의 GABA 전환에 미치는 무기염의 영향을 조사한 결과 CaCl2, FeCl3, MgCl2를 첨가한 반응액에서 염을 넣지 않고 반응한 control보다 GABA 전환율이 2-3배 증진되는 것으로 조사되었다. 이러한 결과들은 김치 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59의 GABA 생성능은 유산균 세포 내에 존재하는 GAD에 의한 것이며, GAD에 의한 GABA 전환율은 무기염에 의하여 증진될 수 있음을 제안해 주는 것이다.
pH의 변화의 경우 배양 6시간을 기점으로 감소하여 정지기에 접어드는 24시간까지 감소하다가 MSG의 존재 유무와 함량에 따라서 약간씩 다른 변화 패턴을 보였다. 즉, MSG가 첨가되지 않은 배지의 경우 24시간부터 48시간까지 약간의 감소가 관찰되었고, 59.13 mM MSG 첨가의 경우는 첨가하지 않은 경우에 비하여 pH 감소폭이 줄었으며, 177.40 mM MSG 첨가의 경우는 24시간 이후 약간씩 증가하는 경향을 보였다(Fig. 2). 이와 같은 경향은 37℃보다는 25℃와 30℃에서 뚜렷하게 나타나고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
따라서 MSG 고함유 배지에서 Lb. sakei OPK2-59 균주의 GABA 전환율 증진을 위한 연구가 탄소원과 질소원 조절 등 배양조건 조절에 따른 영향 및 GAD 효소 특성 등과 연계하여 수행 된다면 균주의 활용가치를 더 높일 수 있을 것이다. Lb.
또한 Lactobacillus buchneri의 경우 1% NaCl의 첨가로 세포증식이 증가하고 MSG의 GABA로의 전환율도 NaCl 무첨가에 비하여 약간 증진되는 경향을 나타내는 것으로 보고 되었다(6). 식물 유래 GAD는 칼슘결합 단백질인 calmodulin에 의해서 활성화 되기 때문에 보편적으로 칼슘에 의한 활성화가 관찰되고 있지만(4, 23), 아직 유산균 유래의 GAD가 또 다른 결합 단백질에 의해서 활성화 되는지, 칼슘 등의 결합 부위를 가지고 있는지 등에 대한 보고는 없어 이들을 포함한 활성화 메커니즘 연구가 진행되어야 할 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
김치 내 유산균의 효능은?
이들 젖산균은 김치 발효과정 중 젖산을 포함하는 각종 유기산, γ-aminobutyric acid (GABA) 등의 생리 활성 물질을 분비하여 김치에 맛과 기능을 부여해 주는 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다(9, 11, 24). 또한 김치 내 풍부한 유산균은 장내의 유해 미생물의 생육을 억제하여 장내 균총을 개선하는 probiotic 효과와 항 avian influenza 효능을 갖는 것으로도 알려져 있다(16). 실제로 김치를 하루에 300 g 먹으면 안 먹은 사람에 비하여 대장에 유산균이 100배 가량 증가하는 것으로 알려져 있다(29).
GABA 생성 균주에 대한 다양한 연구가 수행된 이유는?
GABA는 세균, 곰팡이, 효모 등과 같은 미생물에 의해서도 생산된다. 최근 많은 연구자들이 GABA를 생성할 수 있는 유산균에 대한 연구를 수행한 바 있으며, 이는 유산균이 생리적인 활성을 가지고 있어 유제품, 김치, 빵과 같은 발효식품에서 스타터로 사용될 수 있기 때문이다(6, 27, 28, 29). GABA를 생산하는 특성이 있는 유산균에는 Lactobacillus strains (6, 27, 28, 33), Lactococcus strains (20, 21) 등이 보고되어 있으며, 이들 중 김치유래의 GABA 생성 균주는 Lactobacillus buchneri, Lactobacillus brevis, Lactobacillus sakei 등의 균주가 보고된바 있다(6, 28, 29, 31).
GABA의 기능은?
GABA는 자연계에 널리 분포하는 비 단백태 아미노산으로 동물의 경우 주요 흥분 억제성 신경전달물질이다(13, 15). 또한 GABA는 혈압상승억제, 시력증진, 항 불안, 항 경련 등 인체의 많은 생리적인 메카니즘의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있고, 성장호르몬의 분비 조절에도 관여하며 통증완화에도 효과가 있는 것으로 알려져 있어 약리적으로 매우 주목 받는 물질이다(15, 18). 이러한 GABA의 역할로 인해 최근에는 기능성 식품소재로서의 GABA에 대한 관심이 고조되고 있다(1, 2, 8, 19, 22, 32).
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