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문제 정의
- 이러한 결과들로 이미 보고된 것처럼(5, 11, 13) leucine zipper motif의 도입이 소수성 결합에 의한 이량체를 형성하고, 이로 인한 항원 결합 부위 증가(bivalency)로 avidity 가 증가되어 항원 결합력이 단량체에 비해 3배 증가된 것을 알 수 있었다. 즉 다량체 형성(multimerization)으로 항원 결합 부위를 증가시켜 avidity를 향상시켜 전체 항원 결합 능력을 증가시키는 방법을 제시해 주고 있다.
제안 방법
- 1%의 Tween 20을 첨가한 PBS-T buffer로 세 번 세척하였고, 여기에 skim milk를 2%포함한 PBS-T buffer를 blocking에 이용하였다. Blocking이 끝난 후 정제된 ScFv 항체를 포함한 blocking buffer를 처리하였고, PBS-T를 이용한 3번의 세척 후 horseradish peroxidase가 conjugated polyhistidine monoclonal antibody (Sigma-Aldrich)를 처리하여 ABTS (Sigma-Aldrich)와 과산화수소로 발색 하였다. 발색된 plate는 Microplate reader (EXPERT 96, Asys, Austria)를 이용해 405 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
- Leucine zipper motif 유전자는 oligonucleotide를 이용한 유전자 합성방법으로 자체 제작하였으며 이를 이전 실험에서 구축했던 단량체 형태의 8C3 ScFv 항체 발현벡터에 NotI 제한효소를 이용해 클로닝하였다(Fig. 1) (8, 16).
- Slides를 PBS로 3회 세척 후 PBS에 mouse anti-polyhistidine tag antibody를 1:1,000 (v/v)로 희석해 준 항체용액을 100 μl 처리하여 1 h 동안 incubation한 다음 PBS를 이용해 3회 반복 세척해주고, 100 μl의 1:1,000 (v/v)으로 희석된 fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated goat anti-mouse IgG F(ab) (Sigma-Aldrich)를 처리하여 1 h 동안 incubation 하였다.
- 구축된 8C3 ScFv/Leucine zipper motif 발현벡터를 이용하여 E. coli를 형질 전환하고, IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도한 후 Ni-NTA affinity chromatography를 이용하여 이량체 8C3 ScFv 항체를 정제하였다. SDS-PAGE에서 이량체 분자량을 분석해 본 결과 leucine zipper domain이 첨가된 관계로 단량체 크기인 약 30 kDa 보다 큰 약 38 kDa으로 확인되었다(Fig.
- 3). 그리고, SDS-PAGE 분석에 의해서는 비공유결합에 의한 이량체 형성을 결정할 수 없으므로 비공유결합의 일종인 소수성결합 의한 이량체 형성을 확인하기 위해 정제된 ScFv 항체 단백질을 size exclusion chromatography를 통해 분획하였고, 이량체 및 단량체 8C3 ScFv 항체 단백질 분획의 용출 위치를 결정하기 위해 이미 분자량이 알려진 bovine serum albumin (67 kDa)와 carbonic anhydrase (30 kDa)을 동일 조건에서 분획하였다. 이량체 8C3 ScFv 항체는 67 kDa 크기의 BSA와 같은 분획에서 주로 용출되었고, 단량체 ScFv 항체가 분획되는 pattern은 30 kDa 크기의 carbonic anhydrase와 유사하였다(Fig.
- 또한 TES buffer 처리 후 수거된 세포덩어리를 초음파 파쇄를 위한 buffer (0.1 M Tris-Cl, 0.5 M NaCl, pH 7.5)에 재현탁 한 후 초음파 파쇄하여 원심분리 후 상등액을 수거하여 위와 같은 방법으로 정제하였다.
- 다시 위와 같은 방법으로 원심분리하여 수거된 상등액은 PBS를 이용해 밤새 투석하였다. 밤새 투석 된 단백질 샘플 용액을 Ni-NTA agarose에 결합시키고, Ni-NTA agarose 부피의 20배에 해당하는 TN buffer (0.1 M Tris-Cl, 0.5 M NaCl, pH 7.5 and pH 8.0)를 이용하여 세척하였다. 세척이 끝난 Ni-NTA agarose에 250 mM immidazole을 처리하여 재조합 단백질을 용출해 냈다.
- 이전 연구에서는 조류에서 Coccidiosis를 일으키는 Eimeria 속(genus)에 속하는 Protozoa의 sporozoite가 숙주 세포에 침투하는 과정에 관여하는 Conoid에 특이적으로 결합하는 단일 클론항체를 분비하는 8C3 hybridoma로 부터 variable heavy chain (VH)과 variable light chain (VL) 유전자를 RT-PCR에 의해 클로닝하여 12개의 아미노산으로 이루어진 soluble linker (GSTSGKPSEGKG)에 의해 연결된 재조합 ScFv 항체를 제조하여 항원 결합력을 확인하였다(10, 16). 본 실험에서는 이미 만들어진 단량체 형태의 8C3 ScFv 항체에 amphipathic alpha helix가 융합 되도록 ScFv 항체의 C-terminus에 leucine zipper motif를 도입하여, 이량체 형태의 재조합 8C3 ScFv 항체 발현을 E. coli를 숙주로 하여 시도하였다. 정제된 이량체 형태의 재조합 8C3 ScFv 항체는 size exclusion chromatography에 의해 이량체임을 확인하였고 ELISA 분석을 이용하여 단량체 8C3 ScFv 항체에 비해 avidity 증가로 인하여 항원 결합력이 3배 정도 증가됨을 확인 할 수 있었다.
- 이렇게 모아진 분획들을 위에서 언급한 방법대로 SDS-PAGE를 통해 정제하여 단백질의 분자량을 측정한다. 분자량의 비교를 위해 크기가 알려진 단백질인 bovine serum albumin (67 kDa)과 carbonic anhydrase (30 kDa)을 같은 조건에서 column을 통과시켜 분획하였다.
- 수용성의 Eimeria tenella antigen을 전기영동방법으로 SDS-PAGE하고 PVDF membrane (Millipore, USA)으로 transfer 하였다. 그리고 transfer 된 membrane을 2% (w/v) skim milk를 포함한 PBS-T buffer를 이용하여 실온에서 1 h 동안 blocking한 다음, PBS-T로 2회 세척하였다.
- 이량체 형태의 single chain Fv 항체는 2개의 항원 결합부위를 갖게 되므로 단량체 형태의(monomer) single chain Fv 항체에 비해 항원 결합력(Avidity)이 증가 될 것이다. 이 개념에 기초하여 이전 연구에서 제조된 단량체 형태인 닭 single chain Fv 항체인 8C3 ScFv 항체의 C‐terminus에 leucine zipper motif를 도입하여 이량체 형태의 8C3 ScFv 항체를 개발하였다. 이량체 8C3 ScFv 항체는 가금류의 대표적인 기생충 질병인 coccidiosis를 유발하는 Eimerian sporozoite에 특이적으로 결합하는 기능을 나타내었다.
- 5 ml/min의 속도로 통과시켜 각 분획당 1 ml씩 모아주었다 (Model 2128, BioRad, USA). 이렇게 모아진 분획들을 위에서 언급한 방법대로 SDS-PAGE를 통해 정제하여 단백질의 분자량을 측정한다. 분자량의 비교를 위해 크기가 알려진 단백질인 bovine serum albumin (67 kDa)과 carbonic anhydrase (30 kDa)을 같은 조건에서 column을 통과시켜 분획하였다.
- 즉 8C3 Fv 항체의 아미노산 배열을 입력하면 그와 가장 유사한 아미노산 배열을 가지면서 이미 3차 구조가 알려진 항체를 RCSB PDB (http://www.rcsb.org/pdb/)에서 찾아내어 이를 주형으로 하여 8C3 Fv 항체의 항원결합부위인 complementarity determining region (CDR)의 loop와 항체의 안정화 역할을 담당하는 framework (FR)의 β-sheet의 3차 구조를 결정하였다.
- 1). 즉, leucine zipper motif 유전자의 upstream에 ScFv 항체 유전자를 SfiI과 NotI의 제한효소를 이용하여 클로닝하면 자동적으로 leucine zipper motif와 융합된 발현벡터가 구축되도록 고안되었다(Fig. 1). 예측된 8C3 Fv 항체 3차 구조를 보면 VH 및 VL의 각각 세 CDR 부위가 고유한 loop 구조를 나타내며(Fig.
- Slides를 PBS로 3회 세척 후 PBS에 mouse anti-polyhistidine tag antibody를 1:1,000 (v/v)로 희석해 준 항체용액을 100 μl 처리하여 1 h 동안 incubation한 다음 PBS를 이용해 3회 반복 세척해주고, 100 μl의 1:1,000 (v/v)으로 희석된 fluorescein isothiocyanate (FITC) conjugated goat anti-mouse IgG F(ab) (Sigma-Aldrich)를 처리하여 1 h 동안 incubation 하였다. 최종적으로 Slides를 PBS로 3회 반복 세척하고 공초점 주사 현미경 (Nikon, Japan)을 사용하여 sporozoites 항원의 이량체 8C3 ScFv 항체에 의한 형광염색정도를 관찰하였다.
- 항체 3차구조 모델링을 위한 web site인 WAM (http://anti body.bath.ac.kr/)을 이용하여 8C3 Fv 항체(VH and VL complex)의 3차 구조 모델링을 시도하였다. 즉 8C3 Fv 항체의 아미노산 배열을 입력하면 그와 가장 유사한 아미노산 배열을 가지면서 이미 3차 구조가 알려진 항체를 RCSB PDB (http://www.
데이터처리
- org/pdb/)에서 찾아내어 이를 주형으로 하여 8C3 Fv 항체의 항원결합부위인 complementarity determining region (CDR)의 loop와 항체의 안정화 역할을 담당하는 framework (FR)의 β-sheet의 3차 구조를 결정하였다. 예측된 3차 구조는 PyMol (Delano Scientific, USA) 프로그램을 이용하여 형상화하여 분석하였다.
이론/모형
- 25% Coomassie Brilliant Blue R-25 용액을 이용하여 염색하였다. 정제된 ScFv 항체 단백질은 Bradford protein assay (Thermo scientific, USA)를 이용해 정량하고 실험에 이용하였다.
성능/효과
- coli를 형질 전환하고, IPTG를 이용하여 단백질 발현을 유도한 후 Ni-NTA affinity chromatography를 이용하여 이량체 8C3 ScFv 항체를 정제하였다. SDS-PAGE에서 이량체 분자량을 분석해 본 결과 leucine zipper domain이 첨가된 관계로 단량체 크기인 약 30 kDa 보다 큰 약 38 kDa으로 확인되었다(Fig. 3). 그리고, SDS-PAGE 분석에 의해서는 비공유결합에 의한 이량체 형성을 결정할 수 없으므로 비공유결합의 일종인 소수성결합 의한 이량체 형성을 확인하기 위해 정제된 ScFv 항체 단백질을 size exclusion chromatography를 통해 분획하였고, 이량체 및 단량체 8C3 ScFv 항체 단백질 분획의 용출 위치를 결정하기 위해 이미 분자량이 알려진 bovine serum albumin (67 kDa)와 carbonic anhydrase (30 kDa)을 동일 조건에서 분획하였다.
- 이량체 8C3 ScFv 항체가 Figure 6B와 같은 다특이성(multispecificity)을 나타내는 것은 이량체 8C3 ScFv 항체가 직접 결합하는 부위(peptides: epitope)가 55 kDa과 60 kDa항원에 공통적으로 존재하거나, 또는 인지하는 항원이 55 kDa과 60 kDa 항원에 존재하는 구조적으로 유사성이 높은 당(carbohydrate)일 가능성을 암시해 주고 있다. 또한 Immunocytochemistry를 통해 이량체 8C3 ScFv 항체가 Eimeria tenella sporozoites의 conoid 구조에 특이적으로 결합하여 형광을 나타내는 것으로 이량체 8C3 ScFv 항체의 항원 결합능력을 재확인 할 수 있었다(Fig. 7). 이러한 결과들로 이미 보고된 것처럼(5, 11, 13) leucine zipper motif의 도입이 소수성 결합에 의한 이량체를 형성하고, 이로 인한 항원 결합 부위 증가(bivalency)로 avidity 가 증가되어 항원 결합력이 단량체에 비해 3배 증가된 것을 알 수 있었다.
- 정제된 이량체 형태의 재조합 8C3 ScFv 항체는 size exclusion chromatography에 의해 이량체임을 확인하였고 ELISA 분석을 이용하여 단량체 8C3 ScFv 항체에 비해 avidity 증가로 인하여 항원 결합력이 3배 정도 증가됨을 확인 할 수 있었다. 또한 Western-blot 분석과 immunocytochemistry 등을 통해서도 이량체 8C3 ScFv 항체의 항원결합력을 재확인 할 수 있었다.
- 이 결과는 정제된 이량체 8C3 ScFv 항체가 leucine zipper motif간의 비공유결합인 소수성 결합에 의해 성공적으로 이량체를 형성하는 것을 보여주고 있다. 또한 발현된 단백질의 회수율(yield)을 분석한 결과 이량체 형태의 ScFv 항체는 leucine zipper motif를 구성하는 수용성 아미노산 잔기에 의한 수용성 증가 효과로 단량체일 때의 0.21 mg/L에 비해 2배 정도 발현율이 증가된 0.42 mg/L로 발현되었다(Fig. 5). 수용성 증가효과를 확인하기위해 leucine zipper motif의 소수성 정도를 Web-based 프로그램(http://web.
- 이량체 8C3 ScFv 항체는 가금류의 대표적인 기생충 질병인 coccidiosis를 유발하는 Eimerian sporozoite에 특이적으로 결합하는 기능을 나타내었다. 또한 이량체 8C3 ScFv 항체는 avidity 증가로 인하여 단량체에 비해 항원 결합력이 약 3배 증가됨을 확인할 수 있었으며 단백질 회수율 또한 2배 증가되는 부수적인 효과를 얻을 수 있었다.
- 5). 수용성 증가효과를 확인하기위해 leucine zipper motif의 소수성 정도를 Web-based 프로그램(http://web.expasy.org/protscale/)을 이용하여 분석한 결과, leucine zipper motif는 그 자체로 매우 높은 친수성을 보여주었다. 그리고 leucine zipper motif는 소수성과 친수성을 동시에 갖는 특징(amphipathic nature)을 띄고 있다.
- 4). 이 결과는 정제된 이량체 8C3 ScFv 항체가 leucine zipper motif간의 비공유결합인 소수성 결합에 의해 성공적으로 이량체를 형성하는 것을 보여주고 있다. 또한 발현된 단백질의 회수율(yield)을 분석한 결과 이량체 형태의 ScFv 항체는 leucine zipper motif를 구성하는 수용성 아미노산 잔기에 의한 수용성 증가 효과로 단량체일 때의 0.
- 이 개념에 기초하여 이전 연구에서 제조된 단량체 형태인 닭 single chain Fv 항체인 8C3 ScFv 항체의 C‐terminus에 leucine zipper motif를 도입하여 이량체 형태의 8C3 ScFv 항체를 개발하였다. 이량체 8C3 ScFv 항체는 가금류의 대표적인 기생충 질병인 coccidiosis를 유발하는 Eimerian sporozoite에 특이적으로 결합하는 기능을 나타내었다. 또한 이량체 8C3 ScFv 항체는 avidity 증가로 인하여 단량체에 비해 항원 결합력이 약 3배 증가됨을 확인할 수 있었으며 단백질 회수율 또한 2배 증가되는 부수적인 효과를 얻을 수 있었다.
- 이량체 8C3 ScFv 항체의 주된 기능인 항원 결합 능력을 측정하고 단량체의 결합력과 비교하기 위해 ELISA 분석을 시도한 결과 이량체 형태의 8C3 ScFv 항체가 단량체에 비해 대략 3배 정도의 항원 결합능력을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 6A). 그리고 Western blot 분석결과에서는 이량체 8C3 ScFv 항체가 55 kDa과 60 kDa의 sporozoites 항원을 특이적으로 탐지하는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 7). 이러한 결과들로 이미 보고된 것처럼(5, 11, 13) leucine zipper motif의 도입이 소수성 결합에 의한 이량체를 형성하고, 이로 인한 항원 결합 부위 증가(bivalency)로 avidity 가 증가되어 항원 결합력이 단량체에 비해 3배 증가된 것을 알 수 있었다. 즉 다량체 형성(multimerization)으로 항원 결합 부위를 증가시켜 avidity를 향상시켜 전체 항원 결합 능력을 증가시키는 방법을 제시해 주고 있다.
- coli를 숙주로 하여 시도하였다. 정제된 이량체 형태의 재조합 8C3 ScFv 항체는 size exclusion chromatography에 의해 이량체임을 확인하였고 ELISA 분석을 이용하여 단량체 8C3 ScFv 항체에 비해 avidity 증가로 인하여 항원 결합력이 3배 정도 증가됨을 확인 할 수 있었다. 또한 Western-blot 분석과 immunocytochemistry 등을 통해서도 이량체 8C3 ScFv 항체의 항원결합력을 재확인 할 수 있었다.
후속연구
- 본 연구의 내용을 요약하면 가금류의 대표적 질병인 Coccidiosis를 일으키는 Eimerian sporozoite에 특이적으로 결합하는 닭의 재조합 이량체 8C3 ScFv 항체를 제조하여 avidity를 증가시킴으로써 단량체 ScFv 항체의 단점을 극복하였으며 또한 Eimerian sporozoite항원의 성공적인 탐지 및 염색결과는 이량체 8C3 ScFv 항체의 가금류 Coccidiosis 질병의 진단 및 치료제로 사용 할 수 있는 가능성을 제시해주고 있다.
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