[논문]활성슬러지내의 전기화학적활성 박테리아 분포 특성

손형식; 손희종; 김미아; 이상준

doi:10.7841/ksbbj.2011.26.5.407

활성슬러지내의 전기화학적활성 박테리아 분포 특성
Distribution of Electrochemically Active Bacteria in Activated Sludge Characteristics 원문보기

KSBB Journal, v.26 no.5, 2011년, pp.407 - 411

손형식 (부산대학교 미생물학과) , 손희종 (부산광역시 상수도사업본부 수질연구소) , 김미아 (부산대학교 미생물학과) , 이상준 (부산대학교 미생물학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Microbial fuel cell (MFC) wes enriched using sludge in wastewater treatment. The microbial community of activated sludge and enriched MFC were analyzed by FISH (fluorescent in situ hybridization) and 16S rDNA sequencing. Bacteroidetes group were pre-dominant in activated sludge by FISH. ${\alpha}$ group, ${\gamma}$ group and Acintobacter group were dominant and they were similar to distribution. The average value of 10 peak of MFC is 0.44C. When MFC wase enriched by sludge, ${\gamma}$-Proteobacteria, Plantomycetes group increased 70% and 60%, respectively. In results of 16S rDNA sequencing, Sphiringomonas sp. was comprised in ${\alpha}$ proteobacteria and Enterobacter sp., Klebsiella sp., Acinetobacter sp., Bacillus sp. were comprised in ${\gamma}$ proteobacteria and Chryseobacterium sp. was comprised in Flavobacteria were isolated from sludge.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 여러 가지 probe를 이용하여 실제 배양으로 확인할 수 없는 미생물들을 비배양적인 방법인 fluorescent in situ hybridization (FISH)를 이용하여 활성슬러지 중에 서식하는 EAB들을 MFC에서 농화배양 후의 미생물 군집의 계통학적 분석이 미생물 다양성 관찰을 위해 수행되었다. 또한, 이를 배양적 방법인 16S rRNA sequencing을 이용하여 종 동정을 함으로써 EAB 종별 MFC에서의 전류생산 능을 파악하기 보다는 MFC에 적합한 미생물 종을 파악하여 MFC 성능을 향상시키기 위한 것이 그 목적이다.
현재 알려진 대표적인 EAB들로는 철 환원 미생물 (Fe(III)-reducing bacteria, FRB)인 Closrtidium butyricum [5], Enterococcus gallinarum [6], Rhodoferax ferrireducens [7], Geobacter [8-10], Shewanella [11-12] 및 Sulfate-reducing bacterium인 Desulfotomaculum reducens [13] 등이 많이 알려져 있으며, MFC내의 미생물 군집에 대해서 배양적인 방법과 비배양적인 방법으로 현재 여러 연구 그룹에서 진행 중이다. 본 연구에서는 여러 가지 probe를 이용하여 실제 배양으로 확인할 수 없는 미생물들을 비배양적인 방법인 fluorescent in situ hybridization (FISH)를 이용하여 활성슬러지 중에 서식하는 EAB들을 MFC에서 농화배양 후의 미생물 군집의 계통학적 분석이 미생물 다양성 관찰을 위해 수행되었다. 또한, 이를 배양적 방법인 16S rRNA sequencing을 이용하여 종 동정을 함으로써 EAB 종별 MFC에서의 전류생산 능을 파악하기 보다는 MFC에 적합한 미생물 종을 파악하여 MFC 성능을 향상시키기 위한 것이 그 목적이다.

제안 방법

Glucose를 기질로 사용한 이전의 미생물 분포는 [27] Proteobacteria가 가장 많은 분포를 나타낸 것과 비교해서 본 논문에서는 glucose, glutamic acid를 기질로 사용하여 실험하였으며, 미생물 생체량이 γ proteobacteria > α proteobacteria > Firmicutes > Bacteroidetes의 순으로 나타나므로, glucose만을 사용한 결과와 일정부분 유사한 결과를 나타내었다.
MFC 시스템의 구성은 MFC, 저항기 (resister, Korbi Co. Ltd, Anyang, Korea), multimeter (Model 2700, Keithley Co. Cleveland, Ohio, USA), 데이터 수집기 및 인공폐수를 공급하는 펌프로 구성하였고, MFC는 음극, 양극 및 양이온 교환 막으로 구성되며, 전극은 graphite felts (GF series, Electrosynthesis, Lancaster, NY, USA)를 사용하였고, 양이온 교환 막은 Nafion 424 (30 × 70 mm; Dupont, Wilmington, DE, USA)를 사용하였다.
MFC의 농화배양 후 전극에 부착되어 있는 EAB들의 동정을 위해 전극에 부착된 미생물들을 LB agar plate에 배양한 후 colony PCR로 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 universal primer set (27F, 1492R, Solgent, Korea)를 이용하여 PCR분석기 (PCR Thermal cycler, Takara, Japan)를 사용하여 분석하였다.
MFC의 농화배양 후 전극을 전처리 하고 백금으로 코팅을 한 후 [5], S3500N (Hitachi, Japan)을 이용하여 측정하였다.
S 하수처리장에서 채집한 활성슬러지를 이용하여 MFC 농화배양 전·후의 전기 활성 박테리아 분포 특성을 FISH와 농화배양 후 단일 종을 분리하여 16S rDNA를 이용하여 조사한 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
각각의 probe를 균체가 부착된 polycarbonate membrane에 떨어뜨린 후 46℃에서 90분 동안 혼성화시켰다. 그 후 48℃에서 미리 예열된 washing buffer에서 15분 동안 세척시킨 후 건조시켜 confocal laser scanning microscopy (LSM 510, ZEISS, Germany)를 통해 확인하였다.
인공폐수는 15 mg/L KH2PO4, 30 mg/L (NH4)2SO4, 50 mg/L MgSO4․ 7H2O, 3.75 mg/L CaCl2, 0.25 mg/L FeCl3․ 6H2O, 5.0 mg/L MnSO4․ H2O, 105 mg/L NaHCO3의 basal solution과 trace mineral solution (10 mL/L)으로 구성되며, 여기에 glucose와 glutamic acid의 양을 조절하여 BOD 농도를 220 ± 20 mg/L 및 pH를 7.0 ± 0.2로 조절하였다 [14].
전기신호는 120초에 한번씩 multimeter와 DMM monitoring program (Korbi, Seoul, Korea)을 이용하여 PC에서 측정·저장하였다.
고정된 시료를 4℃, 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상등 액을 제거를 PBS로 세척하였고, 그 작업을 3회 반복하였다. 전처리를 거친 고정된 시료 각 1 mL 씩을 polycarbonate membrane(diameter, 47 mm; pore size, 0.20 mm; type GTTP 4700; Millipore, Eschborn, Germany)으로 여과하여 50%, 80%, 100%의 에탄올에 순차적으로 각 3분씩 처리한 후 공기 중에서 건조시켰다. Table 1에는 FISH 관찰을 위해 13개의 probe들을 사용하였으며, 총 10개의 그룹들이 측정된다.
MFC의 농화배양 후 전극에 부착되어 있는 EAB들의 동정을 위해 전극에 부착된 미생물들을 LB agar plate에 배양한 후 colony PCR로 DNA를 추출하였다. 추출된 DNA를 universal primer set (27F, 1492R, Solgent, Korea)를 이용하여 PCR분석기 (PCR Thermal cycler, Takara, Japan)를 사용하여 분석하였다.
하수처리장에서 채취된 활성슬러지를 MFC의 음극부에 각각 주입한 후 약 24시간 동안 open circuit 상태로 발생되는 전기량을 모니터링 하였으며, 24시간 후 저항기를 이용하여 200 Ω의 저항을 음극과 양극에 연결한 후 음극에는 BOD 220 mg/L (pH 6.8∼7.2)의 인공폐수 [15]를 1 mL/min의 유속으로 매 시간당 20분 동안 간헐적으로 주입하였고, 양극부에는 1 mL/min의 유속으로 공기로 포화된 증류수를 주입하여 음극과 양극의 전압차를 일정하게 유지하면서 실험기간동안 농화 배양하였다.
활성슬러지를 MFC에 주입한 후에 open circuit 상태에서 나타난 최대전압 (V)은 약 0.3 V로 나타나, 활성슬러지 내 EAB들의 존재를 확인할 수 있었고, 활성슬러지를 MFC에 주입하고 36시간 후부터 음극과 양극 사이에 200 Ω의 저항을 걸어주고, 배지공급을 하며 농화배양을 시작하였다. 이후의 실험기간 동안 농화배양이 진행될수록 전류의 생산량이 점진적으로 증가하는 것을 current profile을 통해 볼 수 있다.

대상 데이터

2009년 6월에 부산 S 하수처리장의 활성슬러지를 채취하여 MFC의 접종원으로 사용하였으며, MFC의 작동을 위해 인공폐수를 사용하였다.
20 mm; type GTTP 4700; Millipore, Eschborn, Germany)으로 여과하여 50%, 80%, 100%의 에탄올에 순차적으로 각 3분씩 처리한 후 공기 중에서 건조시켰다. Table 1에는 FISH 관찰을 위해 13개의 probe들을 사용하였으며, 총 10개의 그룹들이 측정된다. 각각의 probe를 균체가 부착된 polycarbonate membrane에 떨어뜨린 후 46℃에서 90분 동안 혼성화시켰다.

성능/효과

α proteobacteria은 농화배양 전후의 생체량이 큰 변화가 없었으며, β proteobacteria는 약 10%정도 감소를 보였으며, γ proteobacteria는 70%정도 증가를 보여, 6.5 × 109 cells/g로 가장 많은 생체량을 보였다.
Acintobacteria는 77% 감소를 보였으며, Plantocycetes는 약 60% 증가를 하였지만, 실제 생체량을 8 × 108 cells/g로 낮았다.
Bacteroidetes가 5.5 × 109 cells/g로 가장 우점을 보였고, α proteobacteria, β proteobacteria, γ proteobacteria, Acintobacter와 Firmicutes가 각각 3.5 × 109 cells/g, 2.4 × 109 cells/g, 3.8 × 109 cells/g, 3.9 × 109 cells/g, 3.1 × 109 cells/g 정도로 많이 분포하였으며, Desulfovibrio도 1.5 × 109 cells/g 정도의 생체량을 나타내었으며, Plantomycetes 와 Acidobacteria은 5.0 × 108 cells/g, 2 × 108 cells/g정도로 낮은 분포를 나타내었으며, Cyanobacteria는 1 × 108 cells/g로 가장 낮은 분포를 보였다.
3에 나타내었다. Fig. 3에서 볼 수 있듯이 최대 생산 전류 값은 0.24 mA이었고, 단위 시간 당 전류 생산 능을 나타내는 지표인 coulombic yield (CY)는 0.44 C로 나타났고, 편차가 거의 없어 전극에 부착된 EAB들이 정상상태에 도달한 것을 확인할 수 있었다.
① 활성슬러지의 미생물 군집을 FISH 분석을 통하여 조사한 결과, Bacteroidetes가 가장 높은 분포비율을 보였으며, α proteobacteria, Acintobacter와 Acintobacter가 유사한 분포 특성을 나타냈었다.
② 활성슬러지를 접종한 MFC 농화배양 이후의 coulombic yield는 0.44 C로 나타났으며, 농화배양 완료 후의 미생물 군집분포는 γ proteobacteria와 Flantomycetes가 농화배양 전보다 각각 70%, 60% 정도 생체량의 증가를 보였으며, 실제 생체량은 γ proteobacteria, α proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes의 순으로 각각 6.5 × 109 cells/g, 3.7 × 109 cells/g, 3.7 × 109 cells/g, 3.1 × 109 cells/g로 나타났다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	전기화학적 활성미생물에는 어떤 것이 있는가?	이런 매개체 없이 전자전달이 가능한 미생물을 전기화학적 활성미생물 (electrochemically active bacteria, EAB)이라고 한다 [5-6]. 현재 알려진 대표적인 EAB들로는 철 환원 미생물 (Fe(III)-reducing bacteria, FRB)인 Closrtidium butyricum [5], Enterococcus gallinarum [6], Rhodoferax ferrireducens [7], Geobacter [8-10], Shewanella [11-12] 및 Sulfate-reducing bacterium인 Desulfotomaculum reducens [13] 등이 많이 알려져 있으며, MFC내의 미생물 군집에 대해서 배양적인 방법과 비배양적인 방법으로 현재 여러 연구 그룹에서 진행 중이다. 본 연구에서는 여러 가지 probe를 이용하여 실제 배양으로 확인할 수 없는 미생물들을 비배양적인 방법인 fluorescent in situ hybridization (FISH)를 이용하여 활성슬러지 중에 서식하는 EAB들을 MFC에서 농화배양 후의 미생물 군집의 계통학적 분석이 미생물 다양성 관찰을 위해 수행되었다.
	미생물 연료전지란?	미생물 연료전지 (Microbial fuel cell, MFC)는 전기활성 미생물을 촉매로 이용하여 하 · 폐수에 포함된 유기물의 화학적 에너지를 전기에너지로 전환할 수 있는 장치이다 [1]. 금속염을 전자수용체로 사용하는 혐기성 미생물인 금속염 환원세균(metal reducing bacteria)이 매개체 없이 전자전달이 가능하다는 것 [2-4]이 알려진 이후 이에 관한 연구가 많이 진행되어왔다.
	S 하수처리장에서 채집한 활성슬러지를 이용하여 MFC 농화배양 전 · 후의 전기 활성 박테리아 분포 특성을 FISH와 농화배양 후 단일 종을 분리하여 16S rDNA를 이용하여 조사한 결과, 활성 슬러지의 미생물 군집은 어떠한 분포를 나타내는가?	① 활성슬러지의 미생물 군집을 FISH 분석을 통하여 조사한 결과, Bacteroidetes가 가장 높은 분포비율을 보였으며, α proteobacteria, Acintobacter와 Acintobacter가 유사한 분포 특성을 나타냈었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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