[논문]다양한 구조를 가진 알긴산-피브로인 비드 제조

이진실; 이신영; 허원

doi:10.7841/ksbbj.2011.26.5.422

[국내논문] 다양한 구조를 가진 알긴산-피브로인 비드 제조
Preparation of Alginate-fibroin Beads with Diverse Structures 원문보기

KSBB Journal, v.26 no.5, 2011년, pp.422 - 426

이진실 (강원대학교 공과대학 생물공학과) , 이신영 (강원대학교 공과대학 생물공학과) , 허원 (강원대학교 공과대학 생물공학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Alginate bead has been supplemented with various polymers to control permeability and to enhance mechanical strength. In this report, fibroin-reinforced alginate hydrogel was prepared, in which spatial localization of fibroin molecules was investigated. Confocal laser scanning microscopy revealed that fibroin molecules formed a fibrous network in the alginate-fibroin beads, which was expected to enhance mechanical strength as same as in many composite materials. Uniaxial compression test showed that fibroin-reinforced alginate beads had increased mechanical strength only after methanol treatment that caused ${\beta}$-sheet formation among fibroin molecules. Simultaneous curing and dialysis of alginate beads were carried out to remove excesscalcium but to retain fibroin in the dialysis chamber, which fabricated beads without internal fibrous fluorescent stains. Fibroin molecules were only found beneath the surface of the beads. The fibroin-diffused shell was further processed to form a thick wall after drying or was mobilizedto the centre of the bead by methanol treatment. Accordingly, the structure analyses provide processing methods of fibroin to form a wall or center clumps, which could be applied to design controlled delivery device.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

6에서는 염견용액에서 알긴산을 경화시키는 조건에 따라 다양한 구조를 가지는 알긴산-피브로인 비드 혹은 캡슐을 제조하는 방법을 도식화하였다. 따라서 본 연구는 알긴산-피브로인 비드와 캡슐의 구조를 조사하여 하이드로겔의 내부에 피브로인 분포를 변화시키는 제조방법을 개발하였다.
그러므로 알긴산의 경화과정에서 피브로인 분자는 자유롭게 확산하여 캡슐의 내부로 침투하지만 알긴산 하이드로겔의 내부에서 염농도가 낮아지거나 이후 세척과정에서 염농도가 낮아지면 불용성 거대 분자로 변할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 피브로인이 녹아있는 염화칼슘용액으로 알긴산을 경화시키거나, 투석을 병행하여 염농도를 조절하며 알긴산을 경화시키는 방법을 사용하여 알기산-피브로인 비드 혹은 캡슐을 제조하고, 다공성 알긴산 하이드로겔 내부로 피브로인 분자가 확산 침투하여 형성하는 미세구조와 하이드로겔의 기계적인 강도와의 상관관계를 밝히고자 하였다.
본 연구에서는 알긴산을 염견용액에서 투석과 동시에 경화시켜 하이드로겔의 표면으로 확산침투시키거나 이를 메탄올로 처리하여 피브로인을 하이드로겔의 표면에서 이동시킬 수 있음을 보였다. 알긴산 비드에서 관찰되는 초기 과량 방출은 피브로인을 혼합시켜 경화된 알긴산 비드에서는 관찰되지 않고 35일 동안 단백질을 지속적으로 방출시키는 것이 가능하였다고 보고되었으며 [16], 알긴산 하이드로겔을 피브로인 수용액에 담근 후 메탄올 처리와 질소 가스로 건조시켜 약 10 μm의 피브로인 외막을 형성시켜 단백질의 방출속도를 제어할 수 있다고 보고되었다 [17].
본 연구에서는 양잠 누에에서 얻어지는 실크섬유의 중심가닥을 구성하는 구조단백질인 피브로인이 녹아있는 염화칼슘용액을 이용하여 알긴산을 경화시키고, 이를 통하여 얻어지는 알긴산-피브로인 하이드로겔 복합체에 대하여 연구하였다. 피브로인은 이미 수술용 봉합사로 오랫동안 사용되어 생체적합성이 우수하며 최근에는 다양한 생체재료의 소재로 활용되고 있다 [8].

제안 방법

그러나 피브로인은 누에의 실샘에서 방사되는 동안에 β-sheet 형태의 분자간 수소결합을 형성하여 실크 섬유가 되며, 일반적으로 피브로인 분자 간 β-sheet 형성은 메탄올 처리를 통하여 가속화된다고 보고되어 있다 [13]. 따라서 두 시료를 메탄올로 처리한 후 다시 압축강도를 측정하였다. Fig.
비드의 내부에서 관찰되는 망상구조는 경화과정에서 고농도의 칼슘이온에 의하여 형성된 채널을 따라 유입된 피브로인 분자가 응집하여 선형의 거대분자를 형성한 것으로 판단되었다. 따라서 알긴산 하이드로겔을 형성시키는데 사용된 칼슘이온을 제외한 나머지 칼슘염을 투석으로 제거하고, 투석막을 빠져나가지 못하는 분자량이 큰 피브로인 분자는 알긴산하이드로겔 비드 내부로 확산되도록 하였다. 피브로인 17.
그러나 본 연구에서는 피브로인을 가용화시킨 염화칼슘용액 (이하 염견용액)을 사용하였다. 알긴산 나트륨 2% (w/v) 수용액을 피브로인 (1.31%, w/v) 및 CaCl₂ (7.74%, w/v)로 구성된 염견용액에 한 방울씩 투입하여 경화시켜 알긴산-피브로인 비드를 제조하였다. 제조된 알긴산-피브로인 비드와 대조구로서 염화칼슘용액만 사용하여 제조된 알긴산 비드를 FITC로 염색한 후 CLSM으로 비드 내부에 해당되는 초점면의 형광사진을 얻고 광학 현미경사진의 동일한 부분과 중첩시켜 Fig.
알긴산 비드와 캡슐의 내부 구조는 형광염색을 통하여 confocal laser scanning microscopy (CLSM FV300, Olympus, Japan)로 관찰하였다. Fluorescein isothiocyanate (FITC) 5 mg/mL 용액에 알긴산 비드를 넣고 2시간 동안 상온에서 혼합기에서 염색한 후 증류수로 3회 세척하고, 어두운 곳에 보관하였다.
알긴산 캡슐을 메탄올로 처리하고 건조시키거나, 혹은 먼저 건조시킨 후 메탄올을 처리하여 얻은 건조캡슐의 내부구조를 CLSM으로 관찰하고 표면을 SEM으로 관찰하였다. Fig.
알긴산-피브로인 비드의 압축시험을 위해 universal tester (Vitrodyne V1000, Chatillon, USA)를 사용하여, 동일한 크기의 하이드로겔 비드 5개를 각각 compression die (MLP-10)에 올려놓은 후, 상부의 compression die를 비드의 표면으로 접근시킨 후 50 μm/sec의 속도로 비드를 압축시켜 이동 거리에 대비한 힘의 변화를 측정하였다.
희석한 염견용액에 알긴산 나트륨 (1%, w/v)을 한 방울씩 떨어뜨리는 방법으로 알긴산 하이드로겔 비드 혹은 캡슐을 제조하고 체를 사용하여 증류수로 수 차례 세척한 후 회수하였다. 알긴산의 경화과정에 투석을 병행하는 경우는 알긴산을 투입하여 비드가 형성된 염견용액을 바로 투석막 (Dialysis tubing D9402, SIGMA, USA)에 옮기고 증류수로 투석하였다. 증류수는 2-3차례 교환하여 12시간 이상 투석시킨 후 회수하였다.
Fluorescein isothiocyanate (FITC) 5 mg/mL 용액에 알긴산 비드를 넣고 2시간 동안 상온에서 혼합기에서 염색한 후 증류수로 3회 세척하고, 어두운 곳에 보관하였다. 염색된 비드를 약 1/3 크기로 잘라 슬라이드글라스 위에 고정시킨 후 CLSM으로 관찰하였다. 형광은 505-525 nm에서 excitation시키고 488 nm에서 emission되는 조건에서 10, 50 또는 100배의 배율로 초점면을 이동시키며 시료를 관찰하였다.
이 용액을 실온으로 식힌 후, 체로 녹지 않은 섬유 찌꺼기들을 걸러냈다. 이 염견용액을 적당한 농도로 희석한 후 280 nm에서 흡광도를 측정하여 피브로인 농도를 정량하고 염도계로 염농도를 측정하였다. 희석한 염견용액에 알긴산 나트륨 (1%, w/v)을 한 방울씩 떨어뜨리는 방법으로 알긴산 하이드로겔 비드 혹은 캡슐을 제조하고 체를 사용하여 증류수로 수 차례 세척한 후 회수하였다.
알긴산-피브로인 비드에서 피브로인 분자가 자기조합을 통하여 섬유상의 구조를 형성한 것이라면 이로 인해 알긴산피브로인 캡슐의 기계적인 강도가 증가하였을 것으로 예상할 수 있다. 이를 확인하기 위하여 universal tester를 이용하여 알긴산 비드와 알긴산-피브로인 비드의 압축강도를 비교하였다 (Fig. 2). 알긴산 비드와 알긴산-피브로인 비드의 압축강도는 구형의 비드의 직경을 20%까지 압축시켜도 0.
74%, w/v)로 구성된 염견용액에 한 방울씩 투입하여 경화시켜 알긴산-피브로인 비드를 제조하였다. 제조된 알긴산-피브로인 비드와 대조구로서 염화칼슘용액만 사용하여 제조된 알긴산 비드를 FITC로 염색한 후 CLSM으로 비드 내부에 해당되는 초점면의 형광사진을 얻고 광학 현미경사진의 동일한 부분과 중첩시켜 Fig. 1에 나타내었다. 탄수화물로 구성된 알긴산 비드에서도 1∼10 μm의 크기의 막대 모양의 FITC로 염색되는 것이 관찰되는데, 이는 해조류에서 유래한 불순물로 생각된다 (Fig.
피브로인 17.1% (w/v) 및 CaCl2 · 2H2O 50% (w/v)으로 구성된 염견용액을 1/5, 1/10 및 1/20로 희석한 후 각각의 용액에 알긴산 나트륨 1% (w/v) 용액을 첨가하여 알긴산 캡슐을 형성시키고 바로 이 용액을 투석막에 이동하여 증류수로 투석하였다.
형광은 505-525 nm에서 excitation시키고 488 nm에서 emission되는 조건에서 10, 50 또는 100배의 배율로 초점면을 이동시키며 시료를 관찰하였다. 하이드로겔 캡슐의 표면과 형태는 주사 전자 현미경(SEM; S-4300, Hitachi, Japan)을 통하여 진공 상태에서 시료의 표면을 전도성 금속으로 코팅을 한 후 관찰하였다.
염색된 비드를 약 1/3 크기로 잘라 슬라이드글라스 위에 고정시킨 후 CLSM으로 관찰하였다. 형광은 505-525 nm에서 excitation시키고 488 nm에서 emission되는 조건에서 10, 50 또는 100배의 배율로 초점면을 이동시키며 시료를 관찰하였다. 하이드로겔 캡슐의 표면과 형태는 주사 전자 현미경(SEM; S-4300, Hitachi, Japan)을 통하여 진공 상태에서 시료의 표면을 전도성 금속으로 코팅을 한 후 관찰하였다.
증류수는 2-3차례 교환하여 12시간 이상 투석시킨 후 회수하였다. 회수된 비드와 캡슐은 1회용 플라스틱 플레이트에서 펼쳐놓은 후 48시간 동안 실온 건조시키거나 혹은 메탄올 처리를 위하여 50 mL 1회용 플라스틱 코니칼 튜브에 옮기고 비드가 잠기도록 메탄올로 채운 후 혼합기 (Cute mixer CM-1000, Tokoy kikakikai, Japan)에서 5분 동안 3회 반복하여 처리하였다.
1% (w/v) 및 CaCl₂ · 2H₂O 50% (w/v)으로 구성된 염견용액을 1/5, 1/10 및 1/20로 희석한 후 각각의 용액에 알긴산 나트륨 1% (w/v) 용액을 첨가하여 알긴산 캡슐을 형성시키고 바로 이 용액을 투석막에 이동하여 증류수로 투석하였다. 회수된 알긴산-피브로인 캡슐은 FITC로 염색하고 CLSM으로 캡슐의 단면을 통과하는 초점면의 사진을 얻었다. Fig.
이 염견용액을 적당한 농도로 희석한 후 280 nm에서 흡광도를 측정하여 피브로인 농도를 정량하고 염도계로 염농도를 측정하였다. 희석한 염견용액에 알긴산 나트륨 (1%, w/v)을 한 방울씩 떨어뜨리는 방법으로 알긴산 하이드로겔 비드 혹은 캡슐을 제조하고 체를 사용하여 증류수로 수 차례 세척한 후 회수하였다. 알긴산의 경화과정에 투석을 병행하는 경우는 알긴산을 투입하여 비드가 형성된 염견용액을 바로 투석막 (Dialysis tubing D9402, SIGMA, USA)에 옮기고 증류수로 투석하였다.

성능/효과

따라서 두 시료를 메탄올로 처리한 후 다시 압축강도를 측정하였다. Fig. 2는 메탄올로 처리된 경우 모두 압축강도가 증가하였음을 나타내고 있으며, 비드를 원래의 모양에서 20% 압축시키는데 가해지는 힘은 알긴산 비드와 알긴산-피브로인 비드의 경우 선형적으로 증가하여 각각 0.76 g (745 dyne) 및 1.12 g (1098 dyne) 으로 나타났다. 여기서 알긴산-피브로인 비드의 압축강도가 144% 증가한 것은 캡슐 내에 형성된 섬유상 망구조의 피브로인 분자들이 메탄올 처리과정을 통하여 서로 β-sheet를 형성하여 기계적 강도를 가진 섬유상 망구조로 변하여 비드의 강도의 증가에 기여하게 된 것으로 추정된다.
그리고 메탄올 처리 후에는 0.7∼0.9 g 사이의 값을 나타내어 캡슐의 내부에 피브로인이 망상구조를 가진 시료의 압축강도가 메탄올 처리 후 1.12 g이 있었던 점과 비교하면 기계적인 강도의 증가가 크지 않았다.
따라서 건조 과정을 통하여 캡슐의 직경이 15%에서 20% 수준으로 감소하였으며, 따라서 atomizer 등을 통하여 50 μm의 직경을 가진 액적을 사용하면 건조 후 10 μm 내외의 알긴산-피브로인 마이크로캡슐을 제조할 수 있을 것으로 판단된다.
3의 사진 A-D는 각각의 사진 E-H에 표시된 캡슐 시료의 표면을 100배의 비율로 확대시켜 관찰한 것으로, FITC로 염색된 부분이 1 μm 이하의 크기를 가지는 미세한 입자로 관찰되었다. 따라서 본 실험에서는 투석을 통해 칼슘이온을 제거하면서 알긴산을 경화시킨 결과, 캡슐 내부에 망상구조로 FITC로 염색된 부분은 관찰되지 않고 표면에서만 FITC로 염색된 부분이 관찰되었다. 이것은 피브로인 분자가 확산을 통하여 하이드로겔의 표면으로 침투하고 있음을 나타내며, 투석을 통하여 칼슘이온이 제거되면 하이드로겔 내부에 칼슘채널을 형성하지 않는 것으로 판단할 수 있다.
메탄올 처리를 통하여 캡슐의 표면에 인접한 피브로인 분자들이 β-sheet를 형성하여 자기 조합으로 피브로인 피막을 형성하기를 기대하였으나, 캡슐의 표면에 인접한 영역에서는 오히려 FITC로 염색된 형광강도가 약해지고 캡슐의 중심부분에 FITC 형광의 강도가 높은 영역이 관찰되었다.
3의 사진 F, G 및 H는 각각 20, 10 및 5배로 희석된 염견용액에서 투석과 동시에 경화된 캡슐을 10배 배율로 관찰한 것이다. 이 사진들은 염견용액의 농도가 높을수록 FITC로 염색된 부분이 캡슐의 표면에 집중적으로 존재하여 피브로인 분자가 캡슐 내부로 확산 침투하고 있음을 보여주고 있다. Fig.

후속연구

알긴산 비드에서 관찰되는 초기 과량 방출은 피브로인을 혼합시켜 경화된 알긴산 비드에서는 관찰되지 않고 35일 동안 단백질을 지속적으로 방출시키는 것이 가능하였다고 보고되었으며 [16], 알긴산 하이드로겔을 피브로인 수용액에 담근 후 메탄올 처리와 질소 가스로 건조시켜 약 10 μm의 피브로인 외막을 형성시켜 단백질의 방출속도를 제어할 수 있다고 보고되었다 [17]. 따라서 본 연구에서 제안된 방법은 알긴산 하이드로겔의 방출 특성을 개선할 수 있는 새로운 방법으로 사용할 수 있을 것으로 예상된다.
특히 단백질 분해 효소에 의하여 내부물질의 방출도 가능하므로 방출제어의 목적으로 활용될 수 있다. 반면 피브로인 단백질이 주로 내부에 있는 알긴산-피브로인 캡슐의 경우 포괄법이 아닌 피브로인 분자와 공유결합 상태로 약물을 고정화하여 서방형으로 방출하는 시스템으로 개발 할 수 있을 것으로 예상된다.
외부에 피브로인 피막을 가진 알긴산-피브로인 비드는 피막의 두께에 따라 투과율을 조절가능한 약물전달체를 설계하고 개발하는데 활용될 수 있다. 특히 단백질 분해 효소에 의하여 내부물질의 방출도 가능하므로 방출제어의 목적으로 활용될 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	알긴산이란?	알긴산은 ß-1,4 결합의 D-mannuronic acid와 α-1,4 결합의 L-guluronic acid로 구성된 다당폴리머로 바륨 혹은 칼슘이온같은 다가 양이온에 의하여 다공성 하이드로겔을 형성하며 L-guluronic acid의 조성비와 점도에 따라 생체적합성이 결정되는 것으로 보고되었다 [1]. 다공성이 높은 알긴산 하이드로겔의 투과율을 조절하기 위하여 양이온성 폴리머인 polylysine이나 chitosan 등으로 외막을 형성시켜 유산균의 생존율을 높이거나 [2], 캡슐화된 헤모글로빈의 유출을 억제하고 [3], 장내에서 집중적으로 항생물질을 방출하는 [4] 등의 연구가 최근에도 지속되고 있다.
	알긴산 하이드로겔의 투과율을 조절하기 위해 어떤 연구가 이루어지고 있는가?	알긴산은 ß-1,4 결합의 D-mannuronic acid와 α-1,4 결합의 L-guluronic acid로 구성된 다당폴리머로 바륨 혹은 칼슘이온같은 다가 양이온에 의하여 다공성 하이드로겔을 형성하며 L-guluronic acid의 조성비와 점도에 따라 생체적합성이 결정되는 것으로 보고되었다 [1]. 다공성이 높은 알긴산 하이드로겔의 투과율을 조절하기 위하여 양이온성 폴리머인 polylysine이나 chitosan 등으로 외막을 형성시켜 유산균의 생존율을 높이거나 [2], 캡슐화된 헤모글로빈의 유출을 억제하고 [3], 장내에서 집중적으로 항생물질을 방출하는 [4] 등의 연구가 최근에도 지속되고 있다. 뿐만 아니라 알긴산 비드의 내부에 마이크로리저버의 역할을 하는 magnesium aluminum silicate를 첨가하여 propranolol의 초기방출을 억제하고 [5], 콜라겐 분자쇄와 interpenetrated network를 형성시킨 생체소재를 개발하거나 [6], Poly(ethyleneimine)를 사용하여 비드의 강도를 증가시키는 [7] 등 여러 종류의 물질들이 알긴산의 기능을 보완하기 위하여 사용됨을 알 수 있다.
	외부에 피브로인 피막을 가진 알긴산-피브로인 비드는 약물 전달체 개발을 제외하고 어떤 용도로 활용될 수 있는가?	외부에 피브로인 피막을 가진 알긴산-피브로인 비드는 피막의 두께에 따라 투과율을 조절가능한 약물전달체를 설계하고 개발하는데 활용될 수 있다. 특히 단백질 분해 효소에 의하여 내부물질의 방출도 가능하므로 방출제어의 목적으로 활용될 수 있다. 반면 피브로인 단백질이 주로 내부에 있는 알긴산-피브로인 캡슐의 경우 포괄법이 아닌 피브로인 분자와 공유결합 상태로 약물을 고정화하여 서방형으로 방출하는 시스템으로 개발 할 수 있을 것으로 예상된다.

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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