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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 상기의 문제점을 보완하고 여러 가지 효능으로 주목받고 있는 바쿠치올을 함유하는 보골지 추출물의 피부 적용 가능성을 알아보기 위하여 보골지 추출물을 liposome, niosome 및 transfersome과 같은 생체 이용률 촉진 시스템 (BAES)에 적용하여 이들의 안정성을 평가하고 피부 투과에 미치는 영향을 평가하였다.
제안 방법
- Liposome, niosome 및 transfersome을 제조하여 안정한 상태를 유지하는 보골지 추출물의 농도를 결정하기 위하여 침전의 유무로 안정성을 관찰하였다.
- 5. The particle size of vesicles containing P. coryfolia extract after production, after storage for 3 months, and after storage for 6 months at 4, 25 and 40℃. Each value represents the mean ± S.
- 4. The viscosity change of vesicles containing P. coryfolia extract after production, after storage for 3 months, and after storage for 6 months at 4, 25 and 40℃. Each value represents the mean ± S.
- 각질층이 제거된 피부를 해부용 가위를 사용하여 잘게 자른 뒤 5~10 mL의 메탄올 또는 70% 에탄올을 첨가하여 5분간 혼합한 후 하룻밤 방치하고 90분간 sonication하였다. 15,000 rpm으로 10분간 원심분리 한 뒤에 상층액을 취하여 여과한 후, 여액을 직접 HPLC로 정량하여 피부 내 침적된 약물의 양을 정량하였다.
- 기기로는 magnetic stirrer & hot plate (Yhana Ins., Seoul, Korea), centrifuge (Hanil Science Industrial, Incheon, Korea), Franz diffusion cell (Labfine, Seoul, Korea), Ultra-Turrax homogenizer (IKA Inc., Werke, Germany), vortex mixer (Scientific Industries Inc., PA, USA), HPLC (Waters, MA, USA) 및 sonicator (Kodo Technical Research Co., Hwaseong, Korea), pH meter (Thermo Electronic Company Inc., NJ, USA), rheometer (Brookfield, MA, USA), Transmission electron microscopy (Hitachi LTD, Tokyo, Japan), 마이크로 플루다이저 (Microfluidics, MA, USA) 및 항온항습기 (Joeil Science, Seoul, Korea)를 사용하였다.
- 보골지 추출물은 항암, 항산화 작용을 가질 뿐만 아니라 광범위한 항균 작용을 가지므로 구강 세척제 등으로 사용되고 있다. 또한 최근에는 화장품 분야에서 여드름 치료제로서의 가능성이 검토되고 있는 보골지 추출물 (바쿠치올)의 피부 적용 가능성을 알아보기 위하여 liposome, niosome 및 transfersome에 봉입하여 이들의 안정성을 평가하고 피부 투과에 미치는 영향을 검토하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 즉, 피부 표면에 남아있는 물질의 양은 메탄올로 씻어내어 제거하여 측정하였다. 또한, 피부에 침적된 양을 측정하기 전에 각질에 침적된 약물의 양을 알아보기 위해 제제와 접촉하였던 피부 면적 2.54 cm2을 취하여 cellophane adhesive tape을 20-30회 반복하여 붙였다 떼어내어 각질층을 제거하여 이를 메탄올 또는 70% 에탄올을 적당량 넣어 90분간 sonication하였다. 10분간 원심분리 한 뒤에 상층액을 취하여 여과한 후, 여액을 직접 HPLC로 정량하여 각질층에 침적된 약물의 양을 정량하였다.
- 보골지 추출물을 포함한 vesicles 1 g을 피부 표면에 도포하고 1, 2, 4, 8, 12 및 24시간마다 0.2 mL씩 채취하여 HPLC에 직접 주입하여 Table 1의 조건으로 분석하였다. 채취된 양은 즉시 동량의 인산염 등장 완충액 (pH 7.
- 보골지 추출물을 함유하는 liposome, niosome 및 transfersome을 제조할 때 빛과 온도에 영향을 받는지 확인하기 위하여 바쿠치올의 함량 변화를 측정하는 안정성 실험을 실시하였다. 즉, 5%의 보골지 추출물을 함유하도록 제조 방법에 따라 liposome, niosome 및 transfersome을 제조하여 실온, 40 및 70℃에서 각각 30일 동안 보관하면서 0, 7, 15 및 30일 마다 검체를 취하여 바쿠치올의 함량 변화를 측정하였다.
- 보골지 추출물의 여러 가지 성분 중에서 바쿠치올을 지표물질로 사용하여 분석하였다. 분석조건으로는 컬럼은 phenylhexyl을, 온도는 35℃, 유속은 1.
- 보골지 추출물이 함유된 liposome, niosome 및 transfersome의 구조를 TEM을 이용하여 측정하였다.
- 본 연구에서도 보골지 추출물을 함유하는 niosome, liposome 및 transfersome을 Table 2와 같은 조성에 따라 특허의 방법을 약간 변형하여 제조하였다.
- 이때 광원으로 He-Ne laser, 측정 파장은 632.8 nm, 산란각도는 90°로 설정하고 25 ± 1℃, intensity 8000~14000 cps에서 3차 증류수로 10배 희석하여 측정하였다.
- 제조된 liposome, niosome 및 transfersome 분산액의 안정성 시험은 6개월 동안 4℃, 실온 (25℃, 빛에 노출) 및 40℃에 6개월간 보관하면서 0, 3 및 6개월 간격으로 검체를 취하여 점도, pH 및 성상의 변화를 측정하여 검토하였다. 이때 제조된 liposome, niosome 및 transfersome 분산액의 평균 입자 크기는 동적 광산란 기법을 이용하여 측정하였다 [21-23].
- 보골지 추출물을 함유하는 liposome, niosome 및 transfersome을 제조할 때 빛과 온도에 영향을 받는지 확인하기 위하여 바쿠치올의 함량 변화를 측정하는 안정성 실험을 실시하였다. 즉, 5%의 보골지 추출물을 함유하도록 제조 방법에 따라 liposome, niosome 및 transfersome을 제조하여 실온, 40 및 70℃에서 각각 30일 동안 보관하면서 0, 7, 15 및 30일 마다 검체를 취하여 바쿠치올의 함량 변화를 측정하였다.
- 피부 투과실험의 마지막 채취 시간인 24시간 이후에 피부 표면, 각질 및 각질이 제거된 피부에 침적된 양을 다음과 같이 처리하여 측정하였다. 즉, 피부 표면에 남아있는 물질의 양은 메탄올로 씻어내어 제거하여 측정하였다. 또한, 피부에 침적된 양을 측정하기 전에 각질에 침적된 약물의 양을 알아보기 위해 제제와 접촉하였던 피부 면적 2.
- 피부 투과 양상에 차이를 보이는 원인을 규명하기 위해 마우스 피부에 도포 24시간 이후 피부를 투과하지 않고 남아있는 바쿠치올의 양을 각질층과 각질층이 제거된 피부에서 각각 측정하였다. 각질층과 각질층이 제거된 피부에 남아있는 바쿠치올의 양을 정량한 결과 Fig.
- 피부 투과실험의 마지막 채취 시간인 24시간 이후에 피부 표면, 각질 및 각질이 제거된 피부에 침적된 양을 다음과 같이 처리하여 측정하였다. 즉, 피부 표면에 남아있는 물질의 양은 메탄올로 씻어내어 제거하여 측정하였다.
대상 데이터
- 따라서 vesicles이 안정하게 유지되는 보골지 추출물의 농도를 검토한 결과 세 가지 제형 모두 5~10%의 범위가 최적인 것으로 나타났다. 따라서 실험에 사용된 보골지 추출물의 농도는 임상 실험 결과 효능이 나타나기 시작한 바쿠치올의 농도 0.5%로 맞추어 주기 위하여 5%로 고정하여 vesicles을 제조하여 검체로 사용하였다.
- 사 (NJ, USA)에서, Amphisol®은 DSM사 (JH Heerlen, Netherlands)에서, lysolecithin은 Lucas Meyer Cosmetics사 (Champlan, France)에서 glycerine과 methyl pyrrolidone은 Lipo Chemicals Inc.사 (NJ, USA)에서, Brassica campestris (rapeseed) sterol과 PEG-5 rapeseed sterol은 Cognis사 (Duesseldorf, Germany)에서 그리고 ceteth-3과 5는 Nihon emulsion사 (Tokyo, Japan)에서 각각 구입하여 사용하였으며, 그 외의 시약과 용매는 특급 또는 1급을 사용하였다.
- 실험에 사용된 검체는 보골지 추출물 5%를 함유하는 niosome, liposome 및 transfersome 분산액을 각각 제조하여 사용하였다.
- 피부 투과 및 침적 실험에 사용된 마우스는 6주령의 웅성 누드 마우스로 다물 사이언스 (Daejeon, Korea)에서 구입하여 20~23℃, 상대습도 55 ± 5%, 명암 교대시간 12시간을 유지하는 조건에서 실험 중을 제외하고는 먹이와 물을 충분히 공급하여 1주일간 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 모든 결과는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 투과되거나 침적된 양의 통계처리는 SPSS 12.0 program을 사용하여 one-way ANOVA에서 유의한 F값의 항목을 Scheffe’s test를 이용하여 p < 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 제조된 liposome, niosome 및 transfersome 분산액의 안정성 시험은 6개월 동안 4℃, 실온 (25℃, 빛에 노출) 및 40℃에 6개월간 보관하면서 0, 3 및 6개월 간격으로 검체를 취하여 점도, pH 및 성상의 변화를 측정하여 검토하였다. 이때 제조된 liposome, niosome 및 transfersome 분산액의 평균 입자 크기는 동적 광산란 기법을 이용하여 측정하였다 [21-23]. 이때 광원으로 He-Ne laser, 측정 파장은 632.
성능/효과
- 24시간 동안 마우스 피부를 투과한 바쿠치올의 양을 측정한 결과 Fig. 7에 나타낸 바와 같이 niosome과 transfersome에서는 투과되는 바쿠치올의 양이 24시간 이후에 유의성있게 증가되었으나, liposome에서는 투과되는 바쿠치올의 양이 적은 것으로 나타났다 (p < 0.05).
- pH 변화를 측정한 결과 Fig. 6에 나타낸 바와 같이 모든 vesicles에서 pH 6.1~6.2 사이로 큰 변화 없이 안정한 것으로 나타났다. 또한, 성상 변화를 관찰한 결과 제조 6개월 동안 침강 및 분리와 같은 특이적인 성상변화는 관찰되지 않았다 (data not shown).
- ① Liposome, niosome 및 transfersome에 적용할 수 있는 보골지 추출물의 최대 농도는 각각 24, 22, 27%로 나타났으며, 모든 vesicles에서 5~10% 농도가 가장 적절한 것으로 나타났다.
- ② 보골지 추출물 자체로는 빛과 열에 불안정하였으나 vesicles에 적용할 경우 안정성이 유지되는 것으로 나타났다
- ③ 24시간 동안 마우스 피부를 투과한 바쿠치올의 양을 측정한 결과 niosome과 transfersome에서는 24시간 이후에 유의성 있게 증가된 것으로 나타난 반면에 liposome의 경우는 투과되는 바쿠치올의 양이 적은 것으로 나타났다. 특히, niosome의 경우 투과된 바쿠치올의 양이 360.
- 피부 투과 양상에 차이를 보이는 원인을 규명하기 위해 마우스 피부에 도포 24시간 이후 피부를 투과하지 않고 남아있는 바쿠치올의 양을 각질층과 각질층이 제거된 피부에서 각각 측정하였다. 각질층과 각질층이 제거된 피부에 남아있는 바쿠치올의 양을 정량한 결과 Fig. 8에 나타낸 바와 같이 각질층에는 liposome, niosome, transfersome 순으로 많이 남아있는 것으로 나타났고, 각질층이 제거된 피부에서는 niosome, transfersome, liposome 순으로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 niosome과 transfersome에서는 각질층에 침적되어 있는 양보다 각질이 제거된 피부에 침적되거나 피부를 투과하는 양이 더 많은 반면에 liposome의 경우에는 각질층에 머무르는 양이 더 많아 피부를 투과하는 양이 적은 것으로 사료된다.
- Liposome, niosome 및 transfersome을 제조하여 안정한 상태를 유지하는 보골지 추출물의 농도를 결정하기 위하여 침전의 유무로 안정성을 관찰하였다. 그 결과 응집이나 침강이 일어나지 않고 liposome, niosome 및 transfersome을 안정하게 제조할 수 있는 보골지 추출물의 최대 농도는 각각 24, 22 및 27%로 나타났으나, 보골지 추출물을 높게 함유하는 경우 48시간 이후 침강 등의 현상이 나타났다 (data not shown). 따라서 vesicles이 안정하게 유지되는 보골지 추출물의 농도를 검토한 결과 세 가지 제형 모두 5~10%의 범위가 최적인 것으로 나타났다.
- 그 결과 응집이나 침강이 일어나지 않고 liposome, niosome 및 transfersome을 안정하게 제조할 수 있는 보골지 추출물의 최대 농도는 각각 24, 22 및 27%로 나타났으나, 보골지 추출물을 높게 함유하는 경우 48시간 이후 침강 등의 현상이 나타났다 (data not shown). 따라서 vesicles이 안정하게 유지되는 보골지 추출물의 농도를 검토한 결과 세 가지 제형 모두 5~10%의 범위가 최적인 것으로 나타났다. 따라서 실험에 사용된 보골지 추출물의 농도는 임상 실험 결과 효능이 나타나기 시작한 바쿠치올의 농도 0.
- 이러한 결과로 볼 때 niosome과 transfersome에서는 각질층에 침적되어 있는 양보다 각질이 제거된 피부에 침적되거나 피부를 투과하는 양이 더 많은 반면에 liposome의 경우에는 각질층에 머무르는 양이 더 많아 피부를 투과하는 양이 적은 것으로 사료된다. 따라서 원료 자체를 용해하거나 현탁하여 적용하면 피부를 통과하기보다 머무르지만 niosome과 transfersome과 같은 vesicles을 제조하여 피부에 적용하면 각질층에 머무르는 양보다 피부를 투과하는 양이 더 많아지는 것을 알 수 있다. 또한, niosome 또는 transfersome과 같은 생체 이용률 촉진 시스템 (BAES)으로 제형화하여 적용할 경우 이러한 vesicles 제조시 사용되는 계면활성제와 피부 각질층의 세포간질 성분과 유사한 지질로 구성되어 생체 친화력이 우수할 것으로 사료된다.
- 따라서 원료 자체를 용해하거나 현탁하여 적용하면 피부를 통과하기보다 머무르지만 niosome과 transfersome과 같은 vesicles을 제조하여 피부에 적용하면 각질층에 머무르는 양보다 피부를 투과하는 양이 더 많아지는 것을 알 수 있다. 또한, niosome 또는 transfersome과 같은 생체 이용률 촉진 시스템 (BAES)으로 제형화하여 적용할 경우 이러한 vesicles 제조시 사용되는 계면활성제와 피부 각질층의 세포간질 성분과 유사한 지질로 구성되어 생체 친화력이 우수할 것으로 사료된다. 또한, 유효성분인 바쿠치올이 피부를 통과하는데 도움을 줄 수 있으므로 즉시적인 효능을 발휘할 수 있다는 면에서 우수할 것으로 기대되어진다.
- 즉, 30일 이후에 40℃와 70℃에서 5~10% 정도 분해되는 것을 확인하였다. 또한, 빛에 대해서도 불안정하여 3% 정도 분해되는 것을 확인하였다. 반면에 liposome, niosome 및 transfersome으로 제형화할 때 열과 빛에 대한 안정성도 제제화의 중요한 인자라 할 수 있는데 보골지 추출물을 제제화하여 관찰한 결과 열과 빛에 대해서 아주 안정한 것으로 관찰되었다 (Fig.
- 2 사이로 큰 변화 없이 안정한 것으로 나타났다. 또한, 성상 변화를 관찰한 결과 제조 6개월 동안 침강 및 분리와 같은 특이적인 성상변화는 관찰되지 않았다 (data not shown).
- 보골지 추출물을 30일 동안 실온, 40℃ 및 70℃에 각각 보관하면서 빛과 열에 대한 바쿠치올의 안정성을 측정한 결과 제형화하지 않은 원료 자체에서는 빛과 열에 대해서 약간 불안정한 것으로 나타났다. 즉, 30일 이후에 40℃와 70℃에서 5~10% 정도 분해되는 것을 확인하였다.
- 보골지 추출물을 함유하는 liposome, niosome 및 transfersome을 제조한 후 TEM을 이용하여 형태를 관찰한 결과 vesicles이 양호하게 형성된 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3).
- 4℃에서는 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 결과로 보아 liposome, niosome 및 transfersome의 입자 크기는 모든 보관 조건에서 6개월 동안 160~300 nm 사이의 안정한 나노 크기의 입자가 유지되는 것으로 나타났다.
- 40℃에서는 niosome과 마찬가지로 유의적인 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 결과로 보아 liposome, niosome 및 transfersome의 점도는 모든 보관 조건에서 6개월 동안 30~90 cP 사이에서 점도가 유지되는 것으로 나타났다.
- 8에 나타낸 바와 같이 각질층에는 liposome, niosome, transfersome 순으로 많이 남아있는 것으로 나타났고, 각질층이 제거된 피부에서는 niosome, transfersome, liposome 순으로 나타났다. 이러한 결과로 볼 때 niosome과 transfersome에서는 각질층에 침적되어 있는 양보다 각질이 제거된 피부에 침적되거나 피부를 투과하는 양이 더 많은 반면에 liposome의 경우에는 각질층에 머무르는 양이 더 많아 피부를 투과하는 양이 적은 것으로 사료된다. 따라서 원료 자체를 용해하거나 현탁하여 적용하면 피부를 통과하기보다 머무르지만 niosome과 transfersome과 같은 vesicles을 제조하여 피부에 적용하면 각질층에 머무르는 양보다 피부를 투과하는 양이 더 많아지는 것을 알 수 있다.
- 이상의 실험 결과로부터 niosome 및 transfersome과 같은 생체 이용률 촉진 시스템 (BAES)을 이용할 경우 보골지 추출물 자체보다 유의성 있게 피부를 투과하는 것으로 나타나 피부 적용 제제로의 개발 가능성을 확인하였다.
- 입자 크기 변화를 측정한 결과 Fig. 5에 나타낸 바와 같이 liposome의 경우 25℃에서 제조 직후 196.5 ± 17.19 nm에서 3개월 후 227.4 ± 5.45 nm로 약간 증가되었다가 6개월 후 219.7 ± 25.54 nm로 제조 직후 수준으로 회복되었다.
- 제조된 vesicles의 안정성을 측정하기 위하여 6개월 동안 4℃, 실온 (25℃) 및 40℃에서 보관하면서 0, 3 및 6개월 간격으로 검체를 취하여 점도, pH, 성상의 변화 및 입자크기를 측정한 결과 모든 vesicles은 안정한 것으로 나타났다.
- 즉, 보골지 추출물이 함유된 liposome, niosome 및 transfersome의 점도 변화를 측정한 결과 Fig. 4에 나타낸 바와 같이 liposome의 경우 4℃에서 제조 직후 67.6 ± 2.75에서 3개월 후 87.2 ± 2.75로 증가되었다가 6개월 후 79.3 ± 2.11로 제조 직후 수준으로 회복되었다.
- 특히, niosome에서 투과된 바쿠치올의 양은 360.96 ± 132.09 μg/mL으로 적용된 vesicles 중에서 피부 투과율이 가장 높은 것으로 나타났다.
- 한방 생약 성분류는 주요 성분 이외에도 사포닌, 배당체의 일종인 탄닌, 플라보노이드, 카로티노이드 및 그 밖에 단당류, 다당류, 다당류 섬유질, 아미노산, 단백질, 비타민류, 미네랄 등과 기타 미확인 물질이 많이 존재하므로 화장품에의 적용시 사용 함량과 원료 선택 및 제품의 안정성 확보면에서 문제점이 있었으며, 또한 한방 생약 성분류는 오랜 임상경험을 통해 안정성은 인정되었으나 고유의 약리 작용은 완만하여 빠른 효과를 얻기 어렵다는 문제가 있었다. 따라서 기존의 방법으로는 미용 성분의 방출 및 침투가 순간적으로 이루어져 피부 활성 성분의 고유 기능 및 효과를 충분히 발휘할 수 없다는 문제점이 제기되므로 이를 해결하기 위해서는 피부 각질층의 세포간 지질성분과 유사한 세라마이드, 시토스테롤, 콜레스테롤을 이용하여 미세다중 소구체화 함으로써 함유된 피부활성 성분의 본래의 기능 및 효과를 증진시키는 동시에 성분 보존력을 향상시켜 보다 안정한 상태로 유지될 수 있다는 것으로 알려져 있다 [19,20].
후속연구
- 또, 제품의 효능과 효과에 대한 소비자들의 적극적인 조사와 요구에 의해 일반 화장품에 비해 높은 수준의 제품을 원하고 화장품 업계에서도 뛰어난 소재에서 나아가 소재를 안정하고 효능 효과를 증진할 수 있는 차별화된 기술을 접목 하려고 시도하고 있다. 기능 성분과 제형의 고유특성에 따라 붕해 (disintegration), 용해 (dissolution), 투과 (permeability) 특성에 영향을 미치는 변동인자를 조절하여 인체 내 흡수율을 높여 생체 이용률을 증가시키는 한편 열, 빛, 산화 안정성은 물론 천연 성분의 독특한 맛의 마스킹을 통하여 소비자의 다양한 요구에 부합되는 제품 개발기술이 필요하다. 이 중 BAES (bioavailability enhancement system)는 “생체 이용률 촉진 시스템”으로 천연물의 주요 효능, 효과를 부가 시키려는 독창적인 제제화 기술의 일종으로서 화장품 분야에서 사용되는 용어이다 [1].
- 또한, niosome 또는 transfersome과 같은 생체 이용률 촉진 시스템 (BAES)으로 제형화하여 적용할 경우 이러한 vesicles 제조시 사용되는 계면활성제와 피부 각질층의 세포간질 성분과 유사한 지질로 구성되어 생체 친화력이 우수할 것으로 사료된다. 또한, 유효성분인 바쿠치올이 피부를 통과하는데 도움을 줄 수 있으므로 즉시적인 효능을 발휘할 수 있다는 면에서 우수할 것으로 기대되어진다. 그러나 적용된 양에 비해 소량만이 피부에 침적되거나 투과되므로 이러한 vesicle에 적용하는 유효성분의 농도를 적당히 조절하여 대부분의 보골지 추출물을 BAES 안으로 봉입시키는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
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