선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 본 연구는 감귤 당유자의 과실유래의 LUGT의 생화학적 특성을 연구하기 위하여, 유전자를 대장균에서 과발현시켜 LUGT 단백질을 분리정제하였으며 이의 결과를 보고하고자 한다.
- 그러나 성분 자체의 쓴맛으로 인하여 기호성이 저하되므로 이를 해결하는 노력이 필요하며 제품 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이러한 쓴맛을 제거할 수 있는 훌륭한 효소로써 LUGT가 주목되고 있으며, 이에 효소의 특성화 연구를 위하여 분리 및 정제를 시도하였다. Plasmid vector 인 pET30a(+)을 사용하여 대장균에서 효소 생성을 위한 최적 발현조건을 검토한 결과, 0.
제안 방법
- 하였다. Column에 충진하여 충분한 양의 buffer로 세척한 후, 10 mM Pvyclodextrin을 함유한 buffer를 사용하여 단백질의 refolding e- 유도하였으며 0.25 M imidaz並le을 사용하여 단백질을 용출한 후 SDS-PAGE 한 결과, Fig. 3의 lane 5에서 보는 바와 같이 순수한 LUGT 단백질을 회수하였다. Ni-NTA column으로 정제한 LUGT 단백질은 C-terminal 부분에 6개의 histidine으로 tagging되어 있으므로 His-Tag 항체를 사용하여 Western blotting 방법으로 확인한 결과, 동일한 크기의 위치에서 단일의 단백질 밴드를 확인하였다 (lane 5).
- LUGT 단백질의 분리를 위하여, LUGT 유전자를 함유한 형질전환 대장균을 LB (kanamycin 함유) 배지에서 하룻밤 배양하고, 1 liter LB (kanamycin 함유) 배지에 접종하여 0.5 mM IPTG 첨가한 후 37 ℃ 에서 5시간 동안 유도하여 배 양액을 원심분리 하였다. 회 수한 균체를 LUGT 단백질 정제에 사용하였다.
- LUGT/pET30a(+) vector를 지닌 형질전환체 E coli BL21(DE3) 세포내에서 LUGT의 발현을 유도 및 최적화하기 위하여 IPTG의 농도, 온도^ 시간을 조절하여 최적 조건을 발견하였다. 그 결과로서 LUGT 유도발현 최적 조건으로 0.
- 3의 lane 5에서 보는 바와 같이 순수한 LUGT 단백질을 회수하였다. Ni-NTA column으로 정제한 LUGT 단백질은 C-terminal 부분에 6개의 histidine으로 tagging되어 있으므로 His-Tag 항체를 사용하여 Western blotting 방법으로 확인한 결과, 동일한 크기의 위치에서 단일의 단백질 밴드를 확인하였다 (lane 5).
- 대장균에서 LUGT 발현을 위한 cloning vector 는 pET30a(+) (Novagen)를 사용하였으며, PCR를 위한 primerse N-말단 부위에는 Ndel site를 갖는 54-ggcatatggg- aactgaatctcttg-3'를, C-말단부위에는 Sall site 를 갖는 5'-ccgtcgacaatactgtacacgtgtcca-3'를 각각 사용하였다. PCR 조건은 95℃ 5분, 95℃ 1분, 55 ℃ 1분, 68℃ 1분 30초(30 cycles), 68t 10분으로 수행하였으며, 그 결과 Fig. 1와 같이 약 1.5 kb 크기의 DNA 단편을 회수하여 DNA 염기 배열을 결정하였다.
- 당유자 LUGT는 1, 536 bp (511 amino acids)로 약 56 kDa이 었다. Plasmid vector인 pET30a(+) vector에 클로닝 하여 재조합 plasmid DNA을 얻었으며, E coli BL21 (DE3) 에 형질전환하였다.
- (Novagen)를 이용하였다. pET30a(+)와 RT-PCR 산물들을 제한효소 Nde:[과 SalL으로 각각 double digestion 하여 T4 DNA Ligase 을 사용하여 ligation 한 후 E. coll BL21 (DE3)에 형 질전환하여 Kanamycin 함유된 LB agar plate에서 배양하였다.
- 분리 한 당유자의 total RNA I U g을 cDNA 합성에 사용하였으며, 합성과정은 Imftom- II reverse transcription system (Promega) 의 방법에 준하여수행하였다. 대장균에서 LUGT 발현을 위한 cloning vector 는 pET30a(+) (Novagen)를 사용하였으며, PCR를 위한 primerse N-말단 부위에는 Ndel site를 갖는 54-ggcatatggg- aactgaatctcttg-3'를, C-말단부위에는 Sall site 를 갖는 5'-ccgtcgacaatactgtacacgtgtcca-3'를 각각 사용하였다. PCR 조건은 95℃ 5분, 95℃ 1분, 55 ℃ 1분, 68℃ 1분 30초(30 cycles), 68t 10분으로 수행하였으며, 그 결과 Fig.
- 5 mM 이 되도록 첨가하여 3 7 ℃ 에서 5시간동안 배양하였다. 배양이 종료된 대장균은 얼음에서 10분간 방치한 후, 원심분리 (6, 000 rpm, 10 min, 4©하여 대장균을 모으며, PBS 용액으로 1회 세척하여 LUGT 단백질 정제에 사용하였다.
- 불용성인 재조합 LUGT 단백질의 분리와 정제를 위히여대장균에서 발현된 단백질을 변성시킨 후, refolding 하는 방법을 이용하였다 (13). 배양액을 원심분리하여 얻은 균체를 buffer (20 mM Tris-HCl, 0.
- 0)에서 세척한 후, 원심분리 (18, 000 rpm, lOmin, 4℃)하여 균체를 회수하였다. 회수된 균체에 cold buffer (2M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.5M Nad, pH 8.0, 2% Triton X-100)에서 현탁하여 초음파처리로 용균처리를 하였다. 파쇄된 용액을 원심분리 (18, 000 rpm, 10 min, 4 ℃)하여 얻은 침 전물에 가용화 buffer (8M urea, 20 mM Tris-HCl, 0.
대상 데이터
- 제조회사가 지정되지 않은 시 약들은 Sigma Aldrich Co (MO) 에서 구입하여 사용하였다.
- 제주 재래 감귤인 당유자 (Citrus grandis Osbeck) 는 서귀포시 남원읍 하예리에 위치한 농촌진흥청 난지 농업연구소 감귤시험장 시험포에서 생육중인 묘목으로부터 2008년 11 월에 과실을 채취하여 -70 ℃ 에 500 g을 보관하여 voucher specimen으로 하였으며, 본 시험재료로 사용하였다. 제조회사가 지정되지 않은 시 약들은 Sigma Aldrich Co (MO) 에서 구입하여 사용하였다.
- 5 mM IPTG 첨가한 후 37 ℃ 에서 5시간 동안 유도하여 배 양액을 원심분리 하였다. 회 수한 균체를 LUGT 단백질 정제에 사용하였다.
이론/모형
- 1g 을 microhibe로 옮긴 후, Trizole reagent (Invitrogen) 을 사용하여 total RNA를 분리하였다. 분리 한 당유자의 total RNA I U g을 cDNA 합성에 사용하였으며, 합성과정은 Imftom- II reverse transcription system (Promega) 의 방법에 준하여수행하였다. 대장균에서 LUGT 발현을 위한 cloning vector 는 pET30a(+) (Novagen)를 사용하였으며, PCR를 위한 primerse N-말단 부위에는 Ndel site를 갖는 54-ggcatatggg- aactgaatctcttg-3'를, C-말단부위에는 Sall site 를 갖는 5'-ccgtcgacaatactgtacacgtgtcca-3'를 각각 사용하였다.
성능/효과
- 2). IPTG 농도는 0.5 tnM IPTG 농도에서 최적이었으며, 특히 37℃ 배양온도 0.5 mM IPTG 농도에서 배양 시간을 3, 4, 5시 간동안 변화를 주어 검토한 결과, 5시간이 최적이었다. 그리고 1 mM과 0.
- 이러한 쓴맛을 제거할 수 있는 훌륭한 효소로써 LUGT가 주목되고 있으며, 이에 효소의 특성화 연구를 위하여 분리 및 정제를 시도하였다. Plasmid vector 인 pET30a(+)을 사용하여 대장균에서 효소 생성을 위한 최적 발현조건을 검토한 결과, 0.5 mM IPTG 조건에서 37℃ 에서 5시간동안 배양하는 것이 최적 과발현 조건이었다. 그러나 세포 내 효소 발현은 불용성의 inclusion bo世로 존재하므로 단백질 변성제인 urea와 재생제인 ©cyclodextrin을 사용하여 순수분리가 가능하였다.
- 그 결과로서 LUGT 유도발현 최적 조건으로 0.5 mM ffTG 조건에서 37℃에서 5시간동안 배양하는 것이 최적이었다 (Fig. 2). IPTG 농도는 0.
- 대부분이 불용성inclusion body 상태인 것으로 확인되었다. 즉, 균체파쇄하여 원심분리한 후, 원심 상등액과 침전물을 각각 회수하여 SDS-PAGE한 결과, 원심상등액(lane 4)에서 는 LUGT가 확인이 되지 않는 반면, 침 전물 Qane 3)에서 LUGT가 확인되었다. 즉, 대장균에서 발현되는 대부분의 LUGT는 inclusion body로 존재하는 것으로 확인되었다.
- 즉, 균체파쇄하여 원심분리한 후, 원심 상등액과 침전물을 각각 회수하여 SDS-PAGE한 결과, 원심상등액(lane 4)에서 는 LUGT가 확인이 되지 않는 반면, 침 전물 Qane 3)에서 LUGT가 확인되었다. 즉, 대장균에서 발현되는 대부분의 LUGT는 inclusion body로 존재하는 것으로 확인되었다.
후속연구
- 그러나 세포 내 효소 발현은 불용성의 inclusion bo世로 존재하므로 단백질 변성제인 urea와 재생제인 ©cyclodextrin을 사용하여 순수분리가 가능하였다. 이러한 방법은 LUGT의당단백질의 특성연구는 물론 이를 이용한 제주 감귤의 고부가가치를 위한 기초연구에 많은 도움을 줄 것으로 판단된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.