[논문]젤 전기영동 및 액체 크로마토그래피 분리 방법을 이용하여 지방 세포로부터 분비되는 단백질들에 대한 프로테오믹스 연구 방법

황현호; 백문창

젤 전기영동 및 액체 크로마토그래피 분리 방법을 이용하여 지방 세포로부터 분비되는 단백질들에 대한 프로테오믹스 연구 방법
Intensive Proteomic Approach to Identify Secreted Peptides/Proteins from 3T3-L1 Adipocytes using Gel Electrophoresis and Liquid Chromatograph Separation Methods 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.55 no.3, 2011년, pp.203 - 212

황현호 (경북대학교 의과대학 분자의학교실) , 백문창 (경북대학교 의과대학 분자의학교실)

Abstract ▼ AI-Helper

Adipocytes have been known to secrete a number of important proteins called adipokines with roles in energy metabolism, reproduction, cardiovascular function and immunity. In this study we have attempted to identify intensively secretory proteins from 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 preadipocytes were differentiated into mature adipocytes and then the cells were left in serum-free medium. The supernatant was filtrated and dialyzed. Lyophilized secretome was fractionated by two different methods, 1-D SDS PAGE and RP-FPLC. The tryptic peptides from the gel slices and the FPLC fractions were analyzed by nanoLC/ESI-MS/MS. We identified a total of 303 identical proteins from two methods, 251 proteins from 1-D gel and 184 proteins from RP-FPLC. 86 of them were listed as a secretory protein Finally, we identified many known or unknown secreted proteins existed in the low level including adiponectin, angiotensinogen, bone morphogenetic protein-1 (BMP-1), macrophage migration inhibitory factor (MIF), insulin like growth factor-II (IGF-II), interleukin-6 (IL-6), follistatin-related protein-1, minecan, and resistin. The existence of some of secreted proteins has been confirmed in RNA level. This proteomic experiment is useful for the intensive screening of secretory proteins in many kinds of other cells.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

지방세포로부터 분비된 단백질의 확인은 새로운 항비만 인자발굴에 도움을 줄 수 있으며 지방세포의 내분비 기관으로서의 분자기작 이해를 도와 줄 것이다. 뼈 형성(BMP-1)과 지방세포 형성 및 비만에 관련된 성장인자(IGF-II)와 같이 분비성 펩타이드들은 낮은 농도로 존재하는 데 본 연구에서는 각 단계에서의 시료 소실을 최소화한 방법을 이용하여 효과적으로 이들 단백질들을 동정하였다. 더 나아가 이 연구에 사용된 연구 전략은 분비성 단백질과 펩타이드를 확인하는 다른 연구에 쉽게 적용될 수 있을 것이다.

가설 설정

²⁷⁾ 반면에 IGF-2는 세포성장, 생존, 분화에 중요한 촉진 요소이다.²⁸⁾ 출생 후 IGF-2는 대부분의 종에서 낮은 농도로 감소한다.²⁹⁾ 그러나 비만의 경우 혈청에서 IGF-2의 농도는 높게 나타난다.

제안 방법

19-21) 그 결과에 추가적으로 우리는 흔하게 발견되는 단백질을 포함하여 adiponectin, interleukin-6, plasminogen activator inhibitor-1, retinol binding protein-4, insulin like growth factor-II, angiotensinogen, macrophage migration inhibitory factors, resistin 등을 확인함과 동시에 몇 가지 기존의 단백체 연구기법에서 보고되지^14,21) 않은 분비성 단백질들을 확인하였다. IGF-I의 지방세포에서의 분비는 기존에 보고가 되었으나, IGF-II의 지방세포에서 분비는 기존의 단백체 연구기법에서는 확인하지 못하였다.
25 mM dexamethasone, and 1 mM insulin을 첨가하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 48시간 후 기존 배양액에 1 mM의 insulin이 첨가된 배양액으로 교체하였으며 이후 48시간에 한 번씩 배양액을 교체하였다. 분화과정은 세포내 지방낭 형성의 외형적인 모습으로 관찰되었으며, 분화된 지방세포로부터 분비된 단백체를 얻기 위하여 세포 손상을 극도로 조심하며 PBS로 세포를 세척한 후 혈청과 Phenol Red가 포함되지 않은 DMEM에서 4시간 세포를 굶긴 후 세포를 PBS를 이용하여 4회 세척하였다.
Thermo Finnigan's ProteomeX Workstation LTQ linear ion trap MS(Thermo Electron, San Jose, CA, USA)을 이용하여 액상 크로마토그래피 텐덤 질량 분석을 진행하였다.
RNA는 제조업체의 설명서에 따라 균질화된 세포로부터 준비되었다. cDNA 합성을 위하여 역전사 중합효소연쇄과정을 실행하였다. 중합효소연쇄과정은 1.
1% TFA in water, v/v)과 혼합한 뒤 100 µl 분석시료 호수에 주입하였다. 농도구배 구성은 용리를 위한 이동상 B(0.1% TFA in ACN, v/v)의 농도를 0~30% 8분, 30~100% 50분 2단계로 구성하여 유속 0.3 ml/min에서 총 58분 동안 분획하였다. 215 nm의 자외선 흡수량으로 각 단계의 단백질 양을 측정하였으며 분리된 단백질은 FRAC-950 분획 모집 자동화 장치를 통하여 96-deep well에 모집되었다.
9%로 설정하였다. 단백질 확인은 가장 일치하는 펩타이드의 확인에 기초하였으며 추가적인 신뢰도를 높이기 위하여 단백질 점수가 10 이상이 되는 것과 확인된 단백질에 대하여 2개 이상의 일치하는 펩타이드를 갖는 단백질들만 분석결과로 사용하였다.
추가적으로 세포 내의 단백질의 혼입을 확인하였는데, 이는 세포가 많이 부서지게 되면 세포 내 단백질이 많이 나오게 되어 분비 단백질 동정에 어려움을 준다. 따라서 Secretome을 얻은 후에, GAPDH(세포내 단백질의 표지인자)를 이용하여 Western blot 실험을 통하여 세포 내 단백질의 유무를 확인하였다. 분석에 이용할 Secretome으로부터 cell lysate에 비해 10배나 더 많은 단백질을 분석한 경우에도 GAPDH 단백질에 해당하는 신호는 잘 보이지 않았다(Fig.
3c). 또 다른 분획 방식으로 Secretome을 역상 고압 액상크로마토그래피 분석을 통하여 분리하였고, 이들 모든 분획을 자외선 흡수 정도에 따라 10개의 분획으로 다시 모은 뒤 트립신 절단 과정을 거친 후 나노 액상 크로마토그래피-텐덤 질량분석기로 펩타이드들을 분석하였다. 그 결과 액상 크로마토그래피 분획과정을 통하여 총 184개의 단백질을 확인하였다(Fig.
48시간 후 기존 배양액에 1 mM의 insulin이 첨가된 배양액으로 교체하였으며 이후 48시간에 한 번씩 배양액을 교체하였다. 분화과정은 세포내 지방낭 형성의 외형적인 모습으로 관찰되었으며, 분화된 지방세포로부터 분비된 단백체를 얻기 위하여 세포 손상을 극도로 조심하며 PBS로 세포를 세척한 후 혈청과 Phenol Red가 포함되지 않은 DMEM에서 4시간 세포를 굶긴 후 세포를 PBS를 이용하여 4회 세척하였다. 이후 혈청과 Phenol Red가 포함되지 않은 배양액에서 15시간 배양한 후 배양액을 수거하였다.
분비성 단백질을 포함한 상층액을 수거하기 전 Phosphate Buffer Solution(PBS)로 세척과정을 극도로 세밀하게 진행하였다. 세척과정의 질적인 변화는 1차원 단백질 전기영동 후 Coomassie Blue 염색으로 확인하였다. 배지의 영양성분으로 이용되는 FBS는 Bovine 혈청의 알부민과 혈청 단백질이 많이 존재한다.
세포배양은 5% 이산화탄소 37℃ 항온배양기에서 10%의 fetal bovine serum을 포함한 DMEM/high glucose배양액에서 배양하였다. 세포들이 완전히 배양 접시에 꽉차게(confluency) 자란 후 이틀 뒤 동일 배양액에 10% fetal bovine serum, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methyxanthine, 0.25 mM dexamethasone, and 1 mM insulin을 첨가하여 지방세포로의 분화를 유도하였다. 48시간 후 기존 배양액에 1 mM의 insulin이 첨가된 배양액으로 교체하였으며 이후 48시간에 한 번씩 배양액을 교체하였다.
이러한 방해 분자를 제거하기 위하여 여과와 투석과정을 진행하였다. 시료를 동결건조 과정을 통하여 배양액의 단백질은 농축하였으며 1차원 단백질 젤 전기영동과 역상 액상 고압 크로마토그래피 방법을 통해 단백질들을 분획하였다.
젤은 열 개의 조각으로 나누었으며 각각의 조각은 몇 개의 조각으로 더 절개되었다. 염색액을 제거하기 위하여 조각난 젤들은 25 mM의 ammonium bicarbonate 용액에서 3번 씻은 후 10 mM DTT로 환원과정을 진행한 후 100 mM의 iodoacetamide 용액에서 환원된 잔기의 알킬화 과정을 진행하였다. 이후 젤 조각의 수분을 제거한 뒤 50%의 acetonitrile을 포함한 20 mM ammonium bicarbonate 용액에서 세척한 후 다시 건조하였다.
3T3-L1 세포는 in vitro 비만연구에 아주 훌륭한 모델이다. 우리는 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 농축한 후 단백질을 정제한 뒤 1차원 단백질 전기영동 및 역상 고압 액상 크로마토그래피 방법을 이용하여 각 단백질을 분자량 및 소수성 정도에 따라 분획하였으며 각각의 분획을 트립신 절단후 나노 액상크로바토그래피 텐덤 질량분석기로 분석하였다. 이 같은 연구방법으로 통하여 우리는 adiponectin, angiotensinogen, bone morphogenetic protein-1(BMP-1), plasminogen activator inhibitor-1, retinol binding protein-4, insulin like growth factor-II(IGF-II), interleukin-6(IL-6), macrophage migration inhibitory factors(MIF), resistin 뿐만 아니라 지방세포로부터의 분비가 알려지지 않은 뼈 형성, adipogenesis 및 비만에 관련된 단백질들을 동정하였다.
좀 더 집약적인 단백질 확인을 위하여 단백체 분획화는 아주 중요한 과정이다. 우리의 실험은 분획화 방법을 통하여 좀 더 집약적인 지방세포 분비성 단백질의 분석에 초점을 맞추었다. 세포외재성 단백질을 확인하는 것은 아주 어려운 실험이다.
1%v/v의 formic acid를 포함하였다. 유속은 분당 200 nl로 일정하게 유지하였으며 농도구배는 2%의 이동상 B로 시작하여 50분 동안 점진적으로 이동상 B의 농도를 60% 올렸으며 그리고 나서 이동상 B의 농도를 80%로 급격히 올린 후 5분 100%에서 10분간 진행하였다.
우리는 분화된 3T3-L1 세포의 배양액을 농축한 후 단백질을 정제한 뒤 1차원 단백질 전기영동 및 역상 고압 액상 크로마토그래피 방법을 이용하여 각 단백질을 분자량 및 소수성 정도에 따라 분획하였으며 각각의 분획을 트립신 절단후 나노 액상크로바토그래피 텐덤 질량분석기로 분석하였다. 이 같은 연구방법으로 통하여 우리는 adiponectin, angiotensinogen, bone morphogenetic protein-1(BMP-1), plasminogen activator inhibitor-1, retinol binding protein-4, insulin like growth factor-II(IGF-II), interleukin-6(IL-6), macrophage migration inhibitory factors(MIF), resistin 뿐만 아니라 지방세포로부터의 분비가 알려지지 않은 뼈 형성, adipogenesis 및 비만에 관련된 단백질들을 동정하였다.
집약적인 지방세포 분비성 단백질의 확인을 위하여 우리는 1차원 단백질 전기영동과 역상 고압 액화 크로마토그래피의 두 가지 단백체 분획화 방법을 사용하였다. 이 방법을 통하여 낮은 농도로 존재하는 분비성 단백질과 분화된 3T3-L1로부터 유래된 펩타이드들을 확인하였다. 지방세포로부터 분비된 단백질의 확인은 새로운 항비만 인자발굴에 도움을 줄 수 있으며 지방세포의 내분비 기관으로서의 분자기작 이해를 도와 줄 것이다.
이 실험에서 많은 collagen alpha-1 type 3, collagen alpha-1 type 5, collagen alpha-1 type 6, collagen alpha-1 type 15, collagen alpha-2 type 1 chain 등의 콜라겐 유형의 단백질들을 확인하였다. 이 단백질들은 세포외부에 매트릭스에 존재하며 지방세포에서 두드러지게 존재한다.
이 연구에서 우리는 분화된 지방세포로의 배양액으로부터 분비된 단백질의 좀더 깊이 있는 검색에 초점을 맞추었다. 3T3-L1 세포는 in vitro 비만연구에 아주 훌륭한 모델이다.
215 nm의 자외선 흡수량으로 각 단계의 단백질 양을 측정하였으며 분리된 단백질은 FRAC-950 분획 모집 자동화 장치를 통하여 96-deep well에 모집되었다. 자외선 흡수량에 기초하여 각각의 분획은 10개의 표본으로 모았으며 진공 건조한 후 트립신 절단 과정을 진행하였다. 분비된 단백체를 포함한 분획은 50 mM ammonium bicarbonate 용액상에서 90℃에서 10분 동안 변성과정을 거친 후 10 mM DTT 에서 환원, 100 mM iodoacetamide에서 20분 동안 알킬화 과정을 거친 후 200 ng의 trypsin을 넣은 후 37℃ 항온 배양기에서 12시간 동안 trypsin 절단을 진행하였다.
3a는 배양액으로부터 농축된 전체 분비성 단백질이 젤 상에서 염색된 것을 보여 준다. 전체 젤을 10개 (G1부터 G10까지)로 나누고, 각각을 trypsin을 이용하여 펩타이드로 절단하였고, 이들 절단 된 펩타이드들은 나노 액상 크로마토그래피-텐덤 질량분석기를 통하여 분석하였다. 분석 결과, 1차원 단백질 전기영동에서 251개의 단백질을 확인하였다(Fig.
24)에서 확인하였다. 정보 분석 과정에서 cysteine 잔기(carboxyamidomethylation, 57 Da)를 고정된 변형잔기로 methionine 잔기를(oxidation, 16 Da) 유동형 변형 잔기로 설정하였다. 모 펩타이드(parent peptide) tolerance 값을 1.
정제된 배양액으로부터 얻어진 단백체를 분석하기 위하여 Vydac C18 RP column(25×0.21 cm)이 장착된 KTA basic chromatography system(GE Healthcare Life Sciences) 역상 고압 액상 크로마토그래피 장치를 사용하였다.
이 후 50 mM ammonium bicarbonate, 5 mM CaCl₂ 용액에서 젤을 부풀게 한 뒤 200 mg trypsin을 처리한 후 37℃ 항온 배양기에서 12시간 동안 trypsin 절단 과정을 진행하였다. 젤 속에 잘려진 펩타이드들은 20 mM ammonium bicarbonate, 5% formic acid 용액과 50% ACN용액을 번갈아 사용하여 추출하였으며 각각의 조각으로부터 추출된 추출액은 감압 건조기로 건조한 후 -20℃에 보관하였다.
중합효소연쇄과정은 1.5 µl의 용해된 cDNA, 40 mM KCl, 10 mM TrisHCl, pH 9.0, 1.5 mM MgCl2, 250 mM dNTP 그리고 1 unit Taq polymerase를 포함하는 20 µl의 부피에서 진행하였다.
지방 세포로부터 얻어진 모든 분비성 단백질을 확인하기 위하여 우리는 Fig. 1에 나와 있는 계획대로 연구를 진행하였다. 지방세포를 분화시킨 후, 이로부터 세포외액(Secretome)을 얻었다.
집약적인 지방세포 분비성 단백질의 확인을 위하여 우리는 1차원 단백질 전기영동과 역상 고압 액화 크로마토그래피의 두 가지 단백체 분획화 방법을 사용하였다. 이 방법을 통하여 낮은 농도로 존재하는 분비성 단백질과 분화된 3T3-L1로부터 유래된 펩타이드들을 확인하였다.
추가적으로, 본 연구에서 발굴된 7개 단백질들(BMP-1, resistin, angiotensiongen, Folistatin-related protein-1, Macrophage migration inhibitory factor, Mimecan, IGF-II)에 대해서 유전자 발현을 확인하기 위하여 RT-PCR을 이용하여 그 존재를 확인하였다(Fig. 4).

대상 데이터

3T3-L1 비분화 지방세포는 하버드 의과대학의 김영범 박사로부터 제공되었다. 세포배양 배양액은 Hyclon에서 구입하였다.
Bone morphogenetic proteinI(BMP-1), 5'-ACAAGTACCCCAGCAAGAAG-3'과 5'-TGTCTGAGTAGAAGCGCAAG-3'; Macrophage migration inhibitory factor(MIF) 5'-CCACCATGCCTATGTTCATC-3'과 5'-TACTGTAGTTGCGGTTCTGG-3'; Mimecan 5'-GACCATAACGACCTGGAATC-3'과 5'-GCACTGATGGGGTTAGAAGT-3'; Resistin 5'-CACGGGATGAAGAACCTTTC-3'과 5'-TCAAGACTGCTGTGCCTTCT-3'; Angiotensinogen 5'-GAACTCAAAGCAGGAGAGGA-3'과 5'-GTGACAGCACTGAGTTTTGC-3'; Follistatinrelated protein-1 5'-ATTCCAGATGGCTGGTTCTC-3'과 5'- GTTTCCAGTCAGCGTTCTCA-3'; Insulin like growth factorII(IGF-II) 5'-GTCCCCACATTTGCAGTTCT-3'과 5'-TGAGTTGAGGCAAACACCTG-3'을 이용하였다.
염기 분석용 트립신은 Promega에서 구입하였다. Dithiothreitol, Idoacetamide, Dexametasone 및 인슐린은 Sigma사로부터 구입하였다. 액상 크로마토그래피 분석용 증류수는 J.
Trifluoroacetic acid(TFA)는 Pierce Biotechnology 에서 구입하였다. Formic acid는 Fluka 사에서 구입하였다. 염기 분석용 트립신은 Promega에서 구입하였다.
액상 크로마토그래피 분석용 Acetonitrile(ACN)은 Merck 사에서 구입하였다. Trifluoroacetic acid(TFA)는 Pierce Biotechnology 에서 구입하였다. Formic acid는 Fluka 사에서 구입하였다.
사용된 모든 액상은 필터를 이용한 정제과정과 기포 제거과정을 거쳤다. 모든 유기용매는 액상 크로마토그래피 분석용 등급의 용매를 사용하였다. 정제된 배양액으로부터 얻어진 단백질 200 mg 을 이동상 A(0.
3T3-L1 비분화 지방세포는 하버드 의과대학의 김영범 박사로부터 제공되었다. 세포배양 배양액은 Hyclon에서 구입하였다. 액상 크로마토그래피 분석용 Acetonitrile(ACN)은 Merck 사에서 구입하였다.
세포배양 배양액은 Hyclon에서 구입하였다. 액상 크로마토그래피 분석용 Acetonitrile(ACN)은 Merck 사에서 구입하였다. Trifluoroacetic acid(TFA)는 Pierce Biotechnology 에서 구입하였다.
Dithiothreitol, Idoacetamide, Dexametasone 및 인슐린은 Sigma사로부터 구입하였다. 액상 크로마토그래피 분석용 증류수는 J. T. Baker사에서 구입하였다.
Formic acid는 Fluka 사에서 구입하였다. 염기 분석용 트립신은 Promega에서 구입하였다. Dithiothreitol, Idoacetamide, Dexametasone 및 인슐린은 Sigma사로부터 구입하였다.

이론/모형

모든 텐덤 질량분석 정보는 BioWorks 소프트웨어(버전 3.2)와 연동된 SEQUEST 알고리즘을 이용하여 국제 단백질 색인의 쥐단백질 정보(버전 3.24)에서 확인하였다. 정보 분석 과정에서 cysteine 잔기(carboxyamidomethylation, 57 Da)를 고정된 변형잔기로 methionine 잔기를(oxidation, 16 Da) 유동형 변형 잔기로 설정하였다.
확인된 단백질들의 세포내에서의 위치를 확인하기 위하여 Swiss-Prot database(http://ca.expasy.org/), Locate(http://locate.imb.uq.edu.au/), 그리고 Gene Ontology의 정보를 참고하였으며 각각의 분류는 제1위치에 기초하였다.

성능/효과

^9,10)쥐 모델을 이용한 연구에서 resistin은 간에서 인슐린의 작용을 상쇄하는 것으로 확인되었다.¹¹⁾ 최근 pre-B cell colony-enhancing factors로 알려졌었던 visfatin의 경우 내장 지방세포의 cDNA 검색에서 확인되어 그 역할이 인슐린과 같으며 인슐린과 동일 수용체를 통해 혈중 당의 농도를 낮추는 것으로 확인되었다.¹²⁾ 이러한 연구결과를 볼 때 좀 더 집약적으로 지방세포로부터 분비되는 단백질의 확인이 필요하며 그 연구결과는 대사과정에 중요한 역할을 하는 새로운 adipokine 후보를 우리에게 제시해 줄 것이다.
14) 반면에 Wang과 그의 동료들은 2차원 단백질 전기영동을 통하여 41개의 지방세포 분비성 단백질을 염색된 점을 통하여 확인하였다.¹⁵⁾ 추가적으로 몇몇 연구 그룹에서 인간 지방세포의 분비성 단백체의 특성을 밝혀 내었다.
또 다른 분획 방식으로 Secretome을 역상 고압 액상크로마토그래피 분석을 통하여 분리하였고, 이들 모든 분획을 자외선 흡수 정도에 따라 10개의 분획으로 다시 모은 뒤 트립신 절단 과정을 거친 후 나노 액상 크로마토그래피-텐덤 질량분석기로 펩타이드들을 분석하였다. 그 결과 액상 크로마토그래피 분획과정을 통하여 총 184개의 단백질을 확인하였다(Fig. 3c). 이들 중 132개 단백질은 1차원 전기영동 후 분석에서 공통으로 얻어진 단백질이었다.
5). 또한 단백질들의 세포내 위치는 각 단백질의 Entrez gene ID에 기초하여 Gene Ontology 정보에 있는 DAVID bioinformatics를 사용하여 확인한 결과 86개의 단백질이 세포외재성 단백질로 확인되었다.
전체 젤을 10개 (G1부터 G10까지)로 나누고, 각각을 trypsin을 이용하여 펩타이드로 절단하였고, 이들 절단 된 펩타이드들은 나노 액상 크로마토그래피-텐덤 질량분석기를 통하여 분석하였다. 분석 결과, 1차원 단백질 전기영동에서 251개의 단백질을 확인하였다(Fig. 3c). 또 다른 분획 방식으로 Secretome을 역상 고압 액상크로마토그래피 분석을 통하여 분리하였고, 이들 모든 분획을 자외선 흡수 정도에 따라 10개의 분획으로 다시 모은 뒤 트립신 절단 과정을 거친 후 나노 액상 크로마토그래피-텐덤 질량분석기로 펩타이드들을 분석하였다.
따라서 Secretome을 얻은 후에, GAPDH(세포내 단백질의 표지인자)를 이용하여 Western blot 실험을 통하여 세포 내 단백질의 유무를 확인하였다. 분석에 이용할 Secretome으로부터 cell lysate에 비해 10배나 더 많은 단백질을 분석한 경우에도 GAPDH 단백질에 해당하는 신호는 잘 보이지 않았다(Fig. 2b). 이 결과로 부터 다음 실험에 이용한 Secretome에는 세포내 단백질 및 혈청 단백질이 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있었다.
⁶⁾ 이러한 결과는 음식 섭취량이 아닌 에너지 소비의 증가에 의한 결과였다. 심장에서 adiponectin은 심장보호기능과 함께 cardiac ischemic reperfusion model 에서 심근경색을 감소시키는 것으로 나타났다.^7,8)
2b). 이 결과로 부터 다음 실험에 이용한 Secretome에는 세포내 단백질 및 혈청 단백질이 효과적으로 제거되었음을 확인할 수 있었다.
이 단백질은 프로콜라겐 1, 2, 3의 C 말단의 프로펩타이드 부분을 절단하며 연골과 뼈의 형성을 위하여 BMP-2를 활성화하는 역할을 한다. 이 연구에서 확인된 BMP-1은 다른 BMP 종류들과는 관련 없이 골격세포의 성장과 분화 조절에 관여하지 않는 것으로 보인다. 흥미롭게도 BMP-2는 골 형성과 지방세포 형성 신호를 다른 종류의 수신자 유형 IB와 IA를 통해서 보내는데²⁵⁾ BMP-2는 생체내에서 thiazolidinedione와 연관되었을 때에는 강력하게 지방형성을 촉진하는 것으로 알려져 있다.
이들 중 132개 단백질은 1차원 전기영동 후 분석에서 공통으로 얻어진 단백질이었다. 참고로, 분획 L1(Fig. 3b)은 높은 자외선 흡수량을 보여줬지만 이 분획에서 얻어진 단백질들은 모두 keratin과 albumin이었으며 단백질 분석 결과 단백질 점수도 낮게 나와 의미 있는 결과에는 포함되지 않았다.
Adipokins의 경우 adiponectin, angiotensinogen, plasminogen activator inhibitor-1, retinol binding protein-4, interleukin-6, macrophage migration inhibitory factors(MIF), resistin 등의 단백질이 동정되었다(Table I). 추가적으로 호르몬인 insulin like growth factor-II(IGF-II)가 지방세포로부터 분비되는 것을 확인하였다. 이 연구에서 확인된 다른 분비성 단백질들은 지방세포에서 중요한 역할을 할 것이며 더 나아가 이들의 기능 분석되어야 할 것이다.
확인된 단백질들은 온라인 단백질 정보에 따라 그 위치가 분류되었으며 303개의 확인된 단백질들 중 28.7%가 단백질 정보와 문헌정보에 기초하여 분비성 단백질로 확인되었다(Fig. 5). 또한 단백질들의 세포내 위치는 각 단백질의 Entrez gene ID에 기초하여 Gene Ontology 정보에 있는 DAVID bioinformatics를 사용하여 확인한 결과 86개의 단백질이 세포외재성 단백질로 확인되었다.

후속연구

¹¹⁾ 최근 pre-B cell colony-enhancing factors로 알려졌었던 visfatin의 경우 내장 지방세포의 cDNA 검색에서 확인되어 그 역할이 인슐린과 같으며 인슐린과 동일 수용체를 통해 혈중 당의 농도를 낮추는 것으로 확인되었다.¹²⁾ 이러한 연구결과를 볼 때 좀 더 집약적으로 지방세포로부터 분비되는 단백질의 확인이 필요하며 그 연구결과는 대사과정에 중요한 역할을 하는 새로운 adipokine 후보를 우리에게 제시해 줄 것이다.
²⁹⁾ 그러나 비만의 경우 혈청에서 IGF-2의 농도는 높게 나타난다.³⁰⁾ 앞으로 비만과 뼈 형성의 연관성은 더 많은 연구를 필요로 한다. 뼈 형성에 관련되며 BMP-I에 의하여 활성화되는 TGF-beta-1 또는 TGF-beta-2과 깊은 관련이 있는 mimecan이 연구에서 확인되었다.
뼈 형성(BMP-1)과 지방세포 형성 및 비만에 관련된 성장인자(IGF-II)와 같이 분비성 펩타이드들은 낮은 농도로 존재하는 데 본 연구에서는 각 단계에서의 시료 소실을 최소화한 방법을 이용하여 효과적으로 이들 단백질들을 동정하였다. 더 나아가 이 연구에 사용된 연구 전략은 분비성 단백질과 펩타이드를 확인하는 다른 연구에 쉽게 적용될 수 있을 것이다.
추가적으로 호르몬인 insulin like growth factor-II(IGF-II)가 지방세포로부터 분비되는 것을 확인하였다. 이 연구에서 확인된 다른 분비성 단백질들은 지방세포에서 중요한 역할을 할 것이며 더 나아가 이들의 기능 분석되어야 할 것이다.
이 방법을 통하여 낮은 농도로 존재하는 분비성 단백질과 분화된 3T3-L1로부터 유래된 펩타이드들을 확인하였다. 지방세포로부터 분비된 단백질의 확인은 새로운 항비만 인자발굴에 도움을 줄 수 있으며 지방세포의 내분비 기관으로서의 분자기작 이해를 도와 줄 것이다. 뼈 형성(BMP-1)과 지방세포 형성 및 비만에 관련된 성장인자(IGF-II)와 같이 분비성 펩타이드들은 낮은 농도로 존재하는 데 본 연구에서는 각 단계에서의 시료 소실을 최소화한 방법을 이용하여 효과적으로 이들 단백질들을 동정하였다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	모든 텐덤 질량분석 정보는 무엇을 이용하여 확인했는가?	모든 텐덤 질량분석 정보는 BioWorks 소프트웨어(버전 3.2)와 연동된 SEQUEST 알고리즘을 이용하여 국제 단백질 색인의 쥐단백질 정보(버전 3.24)에서 확인하였다.
	RNA는 무엇을 이용하여 추출하는가?	RNA는 100 mm 그릇에 있는 단백체를 얻은 동일한 분화된 지방세포로부터 1ml의 Trizol 을 이용하여 추출하였다. RNA는 제조업체의 설명서에 따라 균질화된 세포로부터 준비되었다.
	이들 혈청 단백질을 제거하기위하여 세포를 PBS로 1회, 4회 및 6회 세척과정을 통하여 세포외 액에 존재하는 단백질들을 확인하였을 때, 4회 이상 세척하였을 경우 대부분의 혈청 단백질이 제거된 이유는?	분비성 단백질을 포함한 상층액을 수거하기 전 Phosphate Buffer Solution(PBS)로 세척과정을 극도로 세밀하게 진행하였다. 세척과정의 질적인 변화는 1차원 단백질 전기영동 후 Coomassie Blue 염색으로 확인하였다. 배지의 영양성분으로 이용되는 FBS는 Bovine 혈청의 알부민과 혈청 단백질이 많이 존재한다. 이들을 제거해야 원하는 지방 세포로부터 분비되는 단백질들을 동정할 수 있다. 따라서 이들 혈청 단백질을 제거하기

참고문헌 (31)

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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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