선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 구절초 조추출물 분획물중 diethyl ether 분획이 담배연기응축물에 대하여 돌연변이 억제 효과가 가장 높게 나타났기 때문에 이 diethyl ether 분획을 농도별로 처리했을 때의 돌연변이 억제효과 정도를 조사하였다. Table 7은 Salmonella typhimurium TA 98 균주에 대하여 간접 돌연변이원인 담배연기응축물을 plate 당 200 ㎍ 처리하고, S-9 mix와 함께 diethyl ether 분획물 농도를 31.
- 구절초 조추출물 용매분획물 그 자체도 돌연변이 유발 효과가 있는지 조사하였다. Salmonella typhimurium TA 98 균주가 접종된 시험배지에 구절초 조추출물 용매분획물을 125 ㎍에서 2000 ㎍까지 처리했을 때 복귀 돌연변이 집락수의 변화는 Table 3과 4에 나타나 있다.
- 또한 Maron과 Ames방법 (1983)에 준하여 구절초 조추출물과 각각의 용매 분획물이 담배연기응축물에 대한 돌연변이를 억제하는 효과가 있는지 조사하였다. 즉 Salmonella typhimurium TA 98 균주를 멸균된 시험관에 넣고 14~16시간 배양한 균주 100 µL (1~2 × 109 cells/mL), 담배연기응축물 200 ㎍, S-9 mixture 500 µL, 구절초 조추출물 및 용매분획물 50 µL를 cap tube에 넣고 가볍게 3~5초 vortex한 다음, 37℃ shaking incubator에서 30분간 예비 배양하였다.
제안 방법
- 5 mM histidine/biotin 1 mL의 비율로 첨가하여 예비 배양이 끝난 cap tube에 2 mL씩 분주하고, 3~5초 가볍게 voltex한 후 최소한천배지에 도말하여 37℃ incubator에서 48시간 배양하였다. 각각의 plate에서 복귀 돌연변이 집락수를 계수하고, inhibition rate (%)를 계산하였다.
- 5 mM histidine/biotin 1 mL 의 비율로 첨가하여 예비 배양이 끝난 cap tube에 2 mL씩 분주하고, 3~5초 가볍게 vortex한 후 최소한천배지에 도말하여 37℃ incubator에서 48시간 배양하였다. 각각의 plate에서 복귀돌연변이 집략수 (revertant colony)를 계수하여 돌연변이원성을 평가하였다.
- 구절초 조추출물과 용매 분획물이 돌연변이 억제효과가 있는지 조사하기 위하여 시험배지에 투여할 담배연기응축물의 농도를 결정하였다. 3R4F 표준담배 40개피에서 담배연기응축물 0.
- 먼저 조추출물을 증류수 200 mL에 현탁시킨 다음, 동량의 diethyl ether를 첨가하여 잘 혼합한 한 다음, 12~24시간 실온에 방치하여 두 층이 완전히 분리된 것을 확인하고, diethyl ether층만을 분리하여 diethyl ether분획을 얻었다. 그리고 diethyl ether분획을 분리하고 남은 물층에 다시 chloroform을 가하고 같은 방법으로 chloroform분획을 얻었다. 또한 계속해서 같은 방법으로 dichloromethane, butanol 순으로 물층에 첨가하여 dichloromethane과 butanol분획을 얻었으며, 남은 잔여물은 물분획으로 하였다.
- 5 ㎍/plate의 농도로 하였다. 그리고 구절초 조추출물 및 용매분획물의 농도는 125, 250, 500, 1,000, 2,000 ㎍/plate로 하였다. 직접 돌연변이원성시험(-S-9 mix)에서는 0.
- 담배연기응축물 400 ㎍ 이상 처리농도는 Salmonella typhimurium TA 98균주에 독으로 작용하는 것이 아닌가 생각된다 (Shin et al, 2007). 따라서 구절초 조추출물과 분획물이 담배연기응축물의 돌연변이 억제효과를 평가하기 위한 처리농도를 200 ㎍/plate로 정하였다.
- 따라서 본 연구에서는 구절초를 70% 에탄올로 추출하고, 이를 다시 극성에 따라 diethyl ether, chloroform, dichloromethane, butanol, water 순으로 분획한 다음, 돌연변이원으로 담배연기응축물을 이용하여 Salmonella typhimurium TA 98균주로 Ames test를 실시하고, 구절초 조추출물과 그 분획물 자체의 안전성을 확인하였으며, 또한 이들이 담배연기응축물에 대한 돌연변이를 억제하는 효과가 있는지 조사하였다.
- 그리고 diethyl ether분획을 분리하고 남은 물층에 다시 chloroform을 가하고 같은 방법으로 chloroform분획을 얻었다. 또한 계속해서 같은 방법으로 dichloromethane, butanol 순으로 물층에 첨가하여 dichloromethane과 butanol분획을 얻었으며, 남은 잔여물은 물분획으로 하였다. 각각의 모든 분획물은 rotary vacuum evaporator (Eyela, Japan)를 이용하여 감압 농축한 다음 동결 건조하였다.
- 구절초 조추출물을 다시 극성에 따라 용매로 분획하였다. 먼저 조추출물을 증류수 200 mL에 현탁시킨 다음, 동량의 diethyl ether를 첨가하여 잘 혼합한 한 다음, 12~24시간 실온에 방치하여 두 층이 완전히 분리된 것을 확인하고, diethyl ether층만을 분리하여 diethyl ether분획을 얻었다. 그리고 diethyl ether분획을 분리하고 남은 물층에 다시 chloroform을 가하고 같은 방법으로 chloroform분획을 얻었다.
- 표준담배 3R4F 40개피를 자동흡연장치(Heinr Borgwaldt RM 20, Germany)를 이용하여 ISO 흡연조건(흡연부피: 35 mL, 흡연시간: 2초, 흡연주기: 1분, 꽁초길이: tip paper + 3 ㎜)하에서 연소시키고, 캠브리지 유리섬유필터를 이용하여 담배연기응축물을 포집하였다.
대상 데이터
- Ames test용 시험 균주는 구조 이동형 변이균주인 Salmonella typhymurium TA 98로서 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 분양받아 정기적으로 유전형질을 확인하면서 실험에 사용하였다. 유전형질은 Maron과 Ames 방법 (1983)에 따라 histidine 요구성, uvrB mutation 유지여부, R-factor 유지여부, rfa mutation 유지여부, 자발적 돌연변이수로 확인하였다.
- Top agar 조제는 증류수에 agar 6 g과 NaCl 5 g 넣어 녹이고 증류수로 1 L가 되게 채운 다음, 고압 멸균하여 사용하였다. Histidinebiotin 용액 (H/B solution)은 증류수에 L-histidine 104.8 ㎎과 D-biotin 122.0 ㎎을 넣어 녹이고 증류수로 1L가 되게 채운 다음, 고압 멸균하여 4℃ 냉장고에 보관하면서 top agar 100 mL당 H/B solution 10 mL의 비율로 혼합하여 실험에 사용하였다.
- Vogel-Borner medium E (50 × VB salts) 용액은 증류수에 citric acid monohydrate 100 g, magnesium sulfate 10 g, potassium phosphate dibasic anhydrous 500 g, sodium ammonium hydrogen phosphate 175 g을 넣어 녹이고 증류수로 1L로 맞춘 다음, 고압 멸균하여 사용하였다.
- latilobum Kitamura)는 대한민국 정부지정 약초웰빙특구에서 분말형태의 시료를 구입하였다. 생산자는 제천학들 영농법인이고, 생산지는 경기도 가평군 하면이었다. 직접 돌연변이원인 4-nitroquinoline-n-oxide (4-NQ), 그리고 간접 돌연변이원인 2-aminoanthracene (2-AA), 또한 균주배양을 위한 agar, Lhistidine 및 D-biotin 등의 시약은 Sigma-Aldrich (USA)의 제품을 사용하였다.
- 실험에 사용한 구절초 (Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Kitamura)는 대한민국 정부지정 약초웰빙특구에서 분말형태의 시료를 구입하였다. 생산자는 제천학들 영농법인이고, 생산지는 경기도 가평군 하면이었다.
- 생산자는 제천학들 영농법인이고, 생산지는 경기도 가평군 하면이었다. 직접 돌연변이원인 4-nitroquinoline-n-oxide (4-NQ), 그리고 간접 돌연변이원인 2-aminoanthracene (2-AA), 또한 균주배양을 위한 agar, Lhistidine 및 D-biotin 등의 시약은 Sigma-Aldrich (USA)의 제품을 사용하였다. 그 외 사용된 모든 추출용매 및 시약은 특급 이상을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 데이터 분석은 StatView version (4.0 Abacus Concepts, Inc. Berkeley, CA)을 이용하였고, Fisher's protected least significant difference test 혹은 Scheffe's F test에 의해 두 처리군 사이에 p값이 0.05보다 작은 값을 나타내었을 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
- 구절초 조추출물과 각각의 용매분획물 그 자체가 돌원변이 원성을 나타내는지에 대한 조사는 Maron과 Ames방법 (1983)에 준하여 실시하였다. 즉 양성대조군으로는 직접 돌연변이원 4-NQO 0.
- Ames test용 시험 균주는 구조 이동형 변이균주인 Salmonella typhymurium TA 98로서 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 분양받아 정기적으로 유전형질을 확인하면서 실험에 사용하였다. 유전형질은 Maron과 Ames 방법 (1983)에 따라 histidine 요구성, uvrB mutation 유지여부, R-factor 유지여부, rfa mutation 유지여부, 자발적 돌연변이수로 확인하였다. 유전형질이 확인된 균주는 nutrient broth no.
성능/효과
- 그리고 시험배지에 직접 돌연변이원인 4-NQO를 0.5 ㎍ 처리하였을 때 복귀 돌연변이 집락수는 448.0 ± 8.5개이었으며, 또한 간접 돌연변이원인 2-AA를 0.5 ㎍처리했을 때 복귀 돌연변이 집락수는 524.7 ± 10.7개로 Maron과 Ames의 실험결과와 일치하였으며, 시스템이 매우 양호하게 작동하고 있음을 확인하였다 (Maron and Ames, 1983).
- 한편 구절초 조추출물 어느 분획이 담배연기응축물에 대한 돌연변이를 억제하는 효과가 가장 크게 나타나는지 조사하기 위하여 담배연기응축물 200 ㎍과 구절초 조추출물 용매 분획물을 각각 1 ㎎/plate 농도로 동시에 처리했을 때 얻은 결과를 Table 6에 나타냈다. 담배연기응축물에 대한 돌연변이 억제율은 구절초 조추출물 diethyl ether 분획, chloroform 분획, dichloromethane 분획, butanol 분획, 그리고 물 분획이 각각 96.9%, 20.2%, 0.0%, 5.0%, 그리고 2.5%이었다. 따라서 같은 농도에서 chloroform 분획과 diethyl ether 분획이 Salmonella typhimurium TA 98 균주에서 담배연기응축물에 대한 돌연변이 억제효과를 보였으며, 이 중 diethyl ether 분획이 돌연변이 억제효과가 더 큰 것으로 나타났다.
- 7%이라는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Salmonella typhimurium TA 98균주를 이용한 in vitro 돌연변이 검출계에서 구절초 조추출물 diethyl ether 분획은 담배연기응축물에 의한 돌연변이를 억제할 가능성이 있다고 판단되었다. 구절초 조추물 diethyl ether 분획에 대한 내용성분 분리 및 동정 그리고 돌연변이 억제효과 확인 등 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다.
- 5%이었다. 따라서 같은 농도에서 chloroform 분획과 diethyl ether 분획이 Salmonella typhimurium TA 98 균주에서 담배연기응축물에 대한 돌연변이 억제효과를 보였으며, 이 중 diethyl ether 분획이 돌연변이 억제효과가 더 큰 것으로 나타났다.
- 한편 S-9 mix를 처리했을 때와 처리하지 않았을 때를 구분하여 시험배지에 구절초 조추출물을 농도별로 처리했을때 복귀 돌연변이 집락수는 음성대조군과 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않을 뿐만 아니라 음성대조군과 2배이상 차이가 나지 않았다. 따라서 구절초 조추출물 그 자체는 Salmonella typhimurium TA 98 균주에 대하여 돌연변이 유발효과는 없는 것으로 판단되었다.
- 또한 S-9 mix를 첨가하고 구절초 조추출물 용매분획물의 농도를 증가시켜도 S-9 mix를 첨가하지 않았을 때와 같이 복귀 돌연변이 집락수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 구절초 조추출물의 용매분획물 그 자체도 간접적으로나 직접적으로 돌연변이 유발효과는 없는 것으로 판단되었다.
- 시험배지에 S-9 mix를 첨가하지 않고 구절초 조추출물의 diethyl ether, chloroform, dichloromethane, butanol 그리고 물 분획물 모두 농도를 증가시키며 처리했을때 복귀 돌연변이 집락수는 통계적으로 유의하게 증가하지 않았다. 또한 S-9 mix를 첨가하고 구절초 조추출물 용매분획물의 농도를 증가시켜도 S-9 mix를 첨가하지 않았을 때와 같이 복귀 돌연변이 집락수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 따라서 구절초 조추출물의 용매분획물 그 자체도 간접적으로나 직접적으로 돌연변이 유발효과는 없는 것으로 판단되었다.
- 또한 담배연기응축물을 25, 50, 100, 200, 400, 800과 1600 ㎍을 처리했을 때 복귀 돌연변이 집락수는 각각 41.0 ± 3.5, 47.7 ± 2.5, 115.3 ±8.2, 359.0 ± 23.5, 555.3 ± 44.9, 482.7 ± 78.0와 109.3 ± 12.5개로 담배연기응축물 처리농도 400 ㎍까지는 처리농도가 증가할수록 복귀돌연변이 집락수도 증가하였으나 400 ㎍ 이상에서는 복귀돌연변이 집락수는 오히려 감소하였다.
- Table 1은 구절초 조추출물을 극성에 따라 다섯개의 용매로 순차적으로 분획했을 때 얻어진 수율를 나타내고 있다. 순차분획물중 물 분획물 수율이 35.5%로 가장 높았고, 다음은 butanol 분획물로서 수율이 32.8%이었으며, chloroform 분획물의 수율은 5.6%로 다섯 개의 분획물 중에서 가장 낮은 수율을 나타내었다.
- Table 3은 S-9 mix을 첨가했을 때의 결과이고 Table 4는 S-9 mix을 첨가하지 않았을 때의 결과이다. 시험배지에 S-9 mix를 첨가하지 않고 구절초 조추출물의 diethyl ether, chloroform, dichloromethane, butanol 그리고 물 분획물 모두 농도를 증가시키며 처리했을때 복귀 돌연변이 집락수는 통계적으로 유의하게 증가하지 않았다. 또한 S-9 mix를 첨가하고 구절초 조추출물 용매분획물의 농도를 증가시켜도 S-9 mix를 첨가하지 않았을 때와 같이 복귀 돌연변이 집락수는 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다.
- 3~1,000 ㎍/plate 범위로 처리했을 때의 담배연기응축물에 대한 돌연변이 억제효과를 나타낸 것이다. 시험배지에 diethyl ether 분획물 처리 농도가 증가할수록 담배연기응축물에 대한 돌연변이 억제효과도 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 특히 시험배지에 diethyl ether 분획물 1 ㎎ 농도에서는 담배연기응축물에 대한 돌연변이 억제효과가 97.7%이라는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 Salmonella typhimurium TA 98균주를 이용한 in vitro 돌연변이 검출계에서 구절초 조추출물 diethyl ether 분획은 담배연기응축물에 의한 돌연변이를 억제할 가능성이 있다고 판단되었다.
- , 2006) 연구 결과 등이 있다. 한편, 예비실험에서 한약재 23종의 조추추물을 제조하고, 돌연변이 원성과 담배연기응축물을 이용한 돌연변이 억제활성을 조사했을 때 구절초 조추출물은 상대적으로 돌연변이 억제활성이 우수하였다. 그러나 돌연변이에 대한 구절초의 연구결과는 거의 없는 실정이다.
후속연구
- 따라서 Salmonella typhimurium TA 98균주를 이용한 in vitro 돌연변이 검출계에서 구절초 조추출물 diethyl ether 분획은 담배연기응축물에 의한 돌연변이를 억제할 가능성이 있다고 판단되었다. 구절초 조추물 diethyl ether 분획에 대한 내용성분 분리 및 동정 그리고 돌연변이 억제효과 확인 등 더 많은 연구가 필요하리라 생각된다. 한편 계피의 에탄올 조추출물의 hexane 분획은 Salmonella typhimurium TA 98균주를 이용했을 때 benzo [α] pyrene (B[a]P)에 대한 돌연변이 억제활성이 800 ㎍에서 98% 이상이었으며 (Jeong et al.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.