유방암세포에서 구절초 추출물의 암전이 억제 효과 Chrysanthemum zawadskii var. latilobum Extracts Inhibits of TPA-induced Invasion by Reducing MMP-9 Expression Via the Suppression of NF-${\\kappa}B$ Activation in MCF-7 Human Breast Carcinoma Cells원문보기
Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum Kitamura (Compositae), colloquially known "Gujulcho" in Korea, has been used in traditional medicine for the treatment of various diseases, including cough, common cold, bladder-related disorders, gastroenteric disorders, hypertension, and inflammatory ...
Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum Kitamura (Compositae), colloquially known "Gujulcho" in Korea, has been used in traditional medicine for the treatment of various diseases, including cough, common cold, bladder-related disorders, gastroenteric disorders, hypertension, and inflammatory diseases, such as pneumonia, bronchitis, pharyngitis, and rheumatoid arthritis (RA) However, the effect of Chrysanthemum zawadskii var. latilobum on breast cancer invasion is unknown. In this study, we investigated the inhibitory effect of Chrysanthemum zawadskii var. latilobum extract (CZE) on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression and cell invasion, as well as the molecular mechanisms involved in MCF-7 cells. CZE were not cytotoxic up to 100 ${\mu}g/ml$ concentration in the MCF-7 cell line. CZE decreased MMP-9 expression. TPA substantially increased NF-${\kappa}B$ DNA binding activity. Pre-treatment with CZE inhibited TPA-stimulated NF-${\kappa}B$ binding activity and NF-${\kappa}B$ related protein expression. To identify invasion ability of MCF-7 cells decreased by CZE, we used martrigel invasion assay. As a result, it is significantly decreased cell invasion. These results indicate that CZE-mediated inhibition of TPA-induced MMP-9 expression and cell invasion involves the suppression of the NF-${\kappa}B$ pathway in MCF-7 cells. Chrysanthemum zawadskii var. latilobum may have potential value in restricting breast cancer metastasis.
Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum Kitamura (Compositae), colloquially known "Gujulcho" in Korea, has been used in traditional medicine for the treatment of various diseases, including cough, common cold, bladder-related disorders, gastroenteric disorders, hypertension, and inflammatory diseases, such as pneumonia, bronchitis, pharyngitis, and rheumatoid arthritis (RA) However, the effect of Chrysanthemum zawadskii var. latilobum on breast cancer invasion is unknown. In this study, we investigated the inhibitory effect of Chrysanthemum zawadskii var. latilobum extract (CZE) on 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) expression and cell invasion, as well as the molecular mechanisms involved in MCF-7 cells. CZE were not cytotoxic up to 100 ${\mu}g/ml$ concentration in the MCF-7 cell line. CZE decreased MMP-9 expression. TPA substantially increased NF-${\kappa}B$ DNA binding activity. Pre-treatment with CZE inhibited TPA-stimulated NF-${\kappa}B$ binding activity and NF-${\kappa}B$ related protein expression. To identify invasion ability of MCF-7 cells decreased by CZE, we used martrigel invasion assay. As a result, it is significantly decreased cell invasion. These results indicate that CZE-mediated inhibition of TPA-induced MMP-9 expression and cell invasion involves the suppression of the NF-${\kappa}B$ pathway in MCF-7 cells. Chrysanthemum zawadskii var. latilobum may have potential value in restricting breast cancer metastasis.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
구절초 추출물을 사용하여 유방암의 억제 기전을 확인하고자 한 이번연구에 첫 번째로 실시한 실험은 세포 독성에 대한 평가였다. 구절초 추출물이 유방암 세포주인 MCF-7 세포에 독성을 나타내지는지 확인하기 위해 세포독성 실험을 실행한 결과 구절초 추출물은 고농도(100 ㎍/ml)에서도 세포독성을 나타내지 않았다.
구절초 추출물이 유방암 세포주인 MCF-7 세포에 독성을 나타내지는지 확인하기 위해 세포독성 실험을 실행한 결과 구절초 추출물은 고농도(100 ㎍/ml)에서도 세포독성을 나타내지 않았다. 다음 실험으로 MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현을 구절초 추출물이 조절할 수 있는 지를 조사하였다. MMPs(matrix metalloproteinases)는 여러 암종에서 분비되며 콜라겐이나 젤라틴을 분해하여 암세포의 이동과 전이를 촉진시키는 중요한 효소로 알려져있다35-37).
하지만, 유방암 세포에서 구절초의 암전이 억제 효과는 보고 된 바 없다. 따라서 본 연구는 유방암 세포의 전이에 있어 구절초의 효과와 작용기전을 규명하였다.
본 연구에서는 NF-κB 활성에 의한 MMP-9 발현을 조사 하였다.
이 연구에서 우리는 구절초 추출물이 유방암의 전이를 강력하게 억제하는 것을 새롭게 밝혀냈으며, 이는 구절초 추출물이 유방암의 전이를 억제하거나 치료하는데 사용될 수 있는 하나의 생약 후보가 될 수 있음을 제시하는 바이다.
제안 방법
96-well culture plate에 MCF-7 cells을 3×104 cells/well의 농도로 넣어준 다음 24시간 후에 구절초 추출물을 25, 50, 100 ㎍/ml을 처리 하였다.
MCF-7 cells(5 × 105)에 구절초 추출물 25, 50, 100 ㎍/ml을 1시간 전처리 후에 TPA를 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양된 세포의 조건배지를 모은 후 non-reducing sample buffer에 섞어 polyacrylamide gel containing 0.1%(w/v) gelatin로 전기영동 하였다.
MCF-7 cells(5 × 105)에 구절초 추출물 25, 50, 100 ㎍/ml을 1시간 전처리 후에 TPA를 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현이 NF-κB의 활성의 의한 것인지 EMSA를 사용하여 확인하였다.
NF-κB (κB, 5’-CCGGTTAACAGAGGGGGCTTTCCGAG-3’)을 포함하고 있는 oligonucleotide 결합부위는 gel retardation assay를 통해 probe를 사용하여 합성하였다.
실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 역전사 효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액(Roche Diagnostics Ltd, UK)를 반응시켜 LightCycler rapid thermal cycler system(Roche)을 이용하여 수행하였다. 간략히 설명하자면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation(95℃, 10초), annealing(58℃ for MMP-9 or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation(72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA양은 LightCycler System software(Roche)를 이용하여 GAPDH에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다.
MCF-7세포에서 TPA-자극 MMP-9 발현과 구절초 추출물의 효과를 확인하기 위해 western blot analysis, real-time PCR 그리고 zymography를 이용하였다. 구절초 추출물(25, 50, 100 ㎍/ml)은 MCF-7 세포에 TPA를 처리하기 한 시간전에 처리 하였으며 TPA(20 nM)를 처리하고 24시간 후에 세포들을 수집하여 단백질을 분리하였다. 그 결과, MCF-7세포에 TPA를 처리 하면 MMP-9의 발현이 증가 되었으나 구절초 추출물을 처리하였을 경우 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(Fig.
구절초 추출물의 항전이 효과를 검증하기 위한 첫 단계로 MCF-7 세포에 대한 세포독성을 확인하였다. 구절초 추출물을 MCF-7 세포에 농도별로 처리 하여 세포독성 여부를 확인한 결과 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다.
구절초 추출물이 TPA-자극에 의한 MCF-7 세포의 침투를 억제하는지를 확인하기 위해 in vitro Matrigel invasion assay를 실시하였다. MCF-7 세포를 TPA로 자극 하였을 경우 TPA를 자극하지 않았을 때보다 전이가 10-fold가 증가한 것을 확인 할 수 있었다.
이차 항체는 HRP-conjugated IgG(1:2000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현양은 image analyzer(Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.
따라서 구절초 추출물에 의해 IκBα의 인산화와 NF-κB의 상위 신호전달경로인 IKK 신호전달경로가 조절 되는지 확인 하였다.
간략히 설명하자면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation(95℃, 10초), annealing(58℃ for MMP-9 or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation(72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다. 발현된 각각 유전자의 mRNA양은 LightCycler System software(Roche)를 이용하여 GAPDH에 대한 상대적인 양으로서 계산하였다. 실험에 사용된 MMP-9과 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA의 발현(Table 1)은 ABI PRISM 7900 sequence detection system과 SYBRÒ Green(Applied Biosystems, FosterCity,CA,USA)을 사용하여 분석하였다.
반응이 끝난 후 13,000rpm, 4℃에서 20분 동안 원심분리하고 침전물을 80% EtOH로 세척하였다. 세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC가 처리된 증류수 20 ㎕로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 역전사 반응(reverse transcription reaction)은 3-5 ㎍ total RNA와 reverse transcriptase Fast Pure TMRNA Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다.
5㎖로 수화하였다. 세포(2 x 105/well)는 upper chamber에 seeding 하였고, bottom well 은 DMEM에 화학 유도물질을 희석하여 분주 하였다. 조건 배지(0.
세포는 NE-PERÒ Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)을 사용하여 Cytoplasmic 과 nuclear extracts로 분리하여 추출하였다.
3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2)에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 역전사 효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액(Roche Diagnostics Ltd, UK)를 반응시켜 LightCycler rapid thermal cycler system(Roche)을 이용하여 수행하였다. 간략히 설명하자면, reaction mixture을 10분 동안 95℃에서 반응 시킨 후, denaturation(95℃, 10초), annealing(58℃ for MMP-9 or 60℃ for GAPDH, 5초), elongation(72℃, 10초)의 조건에서 45 cycles을 수행하였다.
역전사 반응(reverse transcription reaction)은 3-5 ㎍ total RNA와 reverse transcriptase Fast Pure TMRNA Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사 반응은 total RNA(3-5 ㎍), oligo d(T)12-18(1 ㎍), 2 ㎕ dNTP(10 mM), MMLV reverse transcriptase(200 U), DTT(10 mM), RNase inhibitor(1 ㎕; Promega, USA), 20 ㎕ 완충용액(50 mM Tris-Cl pH 8.3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2)에 함유된 반응액으로 42℃에서 60분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 실시간 역전사 효소 중합 반응은 10배 희석한 cDNA에 역전사 효소가 포함된 2X SYBR-Green 완충용액(Roche Diagnostics Ltd, UK)를 반응시켜 LightCycler rapid thermal cycler system(Roche)을 이용하여 수행하였다.
5X Tris-borate buffer속에 4% polyacrylamidegels를 넣고 전기영동하였다. 전기영동이 끝난 뒤 젤은 3M paper에 드라이시킨 후 autoradiography에 의해 결과를 측정하였다.
간략히 설명하자면, MCF-7 세포를 3×104 cells/㎖의 농도로 96 well plate에 분주한 후 다양한 농도의 구절초 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 정해진 시간 동안 구절초 추출물을 처리한 후 PBS로 wash한 다음 MTT 시약 10 ㎕(0.5 ㎎/㎖ PBS)를 첨가한 후 37℃에서 30분간 배양한 후 DMEM 100 ㎕/well 을 첨가한 후 ELISA reader(Molecular Device, USA)로 570 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
5) 완충액에 넣고 37°C에서 16시간 동안 인큐베이션 하였다. 젤은 0.25%(w/v) Coomassie brilliant bluein 40%(v/v) methanol 7%(v/v) aceticacid로 염색하였고 photographedon an image alyzer(Fuji-Film)를 사용하여 이미지를 촬영하였다.
대상 데이터
CRL-2749)에서 구입해서 사용하였으며, 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin을 함유한 DMEM 배지에서 5% CO2를 함유하며, 37℃를 유지하는 세포 배양기에서 배양하였다. 95% 메탄올 구절초 추출물은 Korea Plant Extract Bank (Daejeon, Korea)에서 구입하였다. TPA, 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(MTT) and anti-β-actin antibody는 Sigma-Aldrich(St.
MMP-9, p50, p65, IκBα and proliferating cell nuclear antigen(PCNA), and horseradish peroxidase(HRP)-conjugated IgG 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Sant Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. [c32-P]ATP는 Amersham(Buckinghamshire, UK)에서 구입하였다. High glucose-containing DMEM, FBS and phosphate-buffered saline(PBS) 는 Gibco-BRL(Gaithersburg, ME, USA)에서 구입하였다.
샘플(20 ㎍)은 10% acrylamide와 함께 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 사용하여 분리하였고, Hybond ™-polyvinylidene fluoride membranes(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 이동하였다.
)에 구절초 추출물 25, 50, 100 ㎍/ml을 1시간 전처리 후에 TPA를 처리하고 37℃ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 세포내 단백질은 Mammalian Protein Extraction Reagent(M-PER; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분리하였다. 단백질의 농도는 Bradford method을 사용하여 조사하였다.
실험에 사용된 MMP-9과 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) mRNA의 발현(Table 1)은 ABI PRISM 7900 sequence detection system과 SYBRÒ Green(Applied Biosystems, FosterCity,CA,USA)을 사용하여 분석하였다.
각각의 membrane은 2% bovine serum albumin 또는 5% skim milk 를 사용하여 2시간 동안 블록킹 하였고, 일차항체 처리 후 4℃ 냉장고에서 overnight 하였다. 이차 항체는 HRP-conjugated IgG(1:2000 dilution)를 사용하였다. 단백질 발현양은 image analyzer(Fuji-Film, Tokyo, Japan)를 사용하여 확인하였다.
데이터처리
실험결과의 각 실험군은 6번 이상 반복 실시하였으며 그룹 간 유의성 검정은 One-way ANOVA Duncan 사후검정 비교를 실시하여 p<0.05일 때 유의한 것으로 판정하였다(SPSS V12. USA).
이론/모형
MCF-7세포에 대한 구절초 추출물의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT assay를 실행하였다. 간략히 설명하자면, MCF-7 세포를 3×104 cells/㎖의 농도로 96 well plate에 분주한 후 다양한 농도의 구절초 추출물을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다.
TPA는 PKC, MAPKs, PI3K/Akt pathways, NF-κB와 같은 전자조절 인자를 활성화시켜 MMP-9의 발현을 촉진하여 MCF-7의 침투능력을 증가시킨다. MCF-7세포에서 TPA-자극 MMP-9 발현과 구절초 추출물의 효과를 확인하기 위해 western blot analysis, real-time PCR 그리고 zymography를 이용하였다. 구절초 추출물(25, 50, 100 ㎍/ml)은 MCF-7 세포에 TPA를 처리하기 한 시간전에 처리 하였으며 TPA(20 nM)를 처리하고 24시간 후에 세포들을 수집하여 단백질을 분리하였다.
MCF-7세포에서 구절초 추출물(CZ extracts)의 세포독성은 MTT assay를 사용하여 확인하였다. 96-well culture plate에 MCF-7 cells을 3×104 cells/well의 농도로 넣어준 다음 24시간 후에 구절초 추출물을 25, 50, 100 ㎍/ml을 처리 하였다.
NF-κB의 활성은 핵단백질을 추출하여 gel mobility shift assay로 측정하였다.
세포내 단백질은 Mammalian Protein Extraction Reagent(M-PER; Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)를 사용하여 분리하였다. 단백질의 농도는 Bradford method을 사용하여 조사하였다. 샘플(20 ㎍)은 10% acrylamide와 함께 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)를 사용하여 분리하였고, Hybond ™-polyvinylidene fluoride membranes(GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire, UK)을 사용하여 이동하였다.
실험이 끝난 MCF-7 세포로부터 total RNA의 분리는 Trizol reagent(Life Technologies, UK)를 이용하여 제조회사가 제공하는 방법에 따라 수행하였다.
세척된 RNA를 건조시킨 후 DEPC가 처리된 증류수 20 ㎕로 녹이고 분광광도계에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 역전사 반응(reverse transcription reaction)은 3-5 ㎍ total RNA와 reverse transcriptase Fast Pure TMRNA Kit(TaKaRa, Shiga, Japan)를 이용하여 제조회사에서 제공하는 방법에 따라 수행하였다. 역전사 반응은 total RNA(3-5 ㎍), oligo d(T)12-18(1 ㎍), 2 ㎕ dNTP(10 mM), MMLV reverse transcriptase(200 U), DTT(10 mM), RNase inhibitor(1 ㎕; Promega, USA), 20 ㎕ 완충용액(50 mM Tris-Cl pH 8.
성능/효과
EMSA를 사용해 NF-κB의 활성을 확인한 결과 구절초 추출물은 TPA자극된 MCF-7 세포의 NF-κB 활성을 강력히 억제하는 효과를 보였다.
구절초 추출물이 TPA-자극에 의한 MCF-7 세포의 침투를 억제하는지를 확인하기 위해 in vitro Matrigel invasion assay를 실시하였다. MCF-7 세포를 TPA로 자극 하였을 경우 TPA를 자극하지 않았을 때보다 전이가 10-fold가 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 구절초 추출물을 함께 처리했을 경우 MCF-7의 침투능력이 약 80%가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
MMP-9의 발현과 직접적인 관련이 있는 NF-κB의 활성역시 구절초 추출물에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었으며, 최종적으로 MCF-7 세포의 전이에도 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.
2A). MMP-9의 발현이 RNA level에서도 조절 되는지 real-time PCR로 확인한 결과 단백질 발현과 마찬가지로 구절초 추출물의 농도에 의존적으로 mRNA level이 감소한 것을 확인하였다(Fig. 2B). 또한 zymography를 이용한 MMP-9 효소활성 실험 역시 똑같은 결과를 도출할 수 있었다(Fig.
구절초 추출물을 MCF-7 세포에 농도별로 처리 하여 세포독성 여부를 확인한 결과 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현에서 구절초 추출물은 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현을 억제하였고, 효소 활성역시 감소시켰다. MMP-9의 발현과 직접적인 관련이 있는 NF-κB의 활성역시 구절초 추출물에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었으며, 최종적으로 MCF-7 세포의 전이에도 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.
현재까지 약 24가지 이상의 MMPs가 알려져 있으며, 이들 중 특히 Type IV collagenase인 MMP-2 및 MMP–9은 암세포의 전이와 침윤 발생 시 기저막을 분해하며 암세포의 전이, 침윤 및 신생혈관 생성을 활성화시키는 역할을 한다고 알려져 있다17). 구절초 추출물은 MCF-7 세포에서 MMP-9의 발현을 단백질 레벨과 mRNA 레벨에서 강력하게 억제하는 효과를 보였다. 또한 MMP-9의 효소 활성 역시 구절초 추출물에 의해 억제 되는 것을 확인 할 수 있었다.
구절초 추출물의 항전이 효과를 검증하기 위한 첫 단계로 MCF-7 세포에 대한 세포독성을 확인하였다. 구절초 추출물을 MCF-7 세포에 농도별로 처리 하여 세포독성 여부를 확인한 결과 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현에서 구절초 추출물은 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현을 억제하였고, 효소 활성역시 감소시켰다.
구절초 추출물을 사용하여 유방암의 억제 기전을 확인하고자 한 이번연구에 첫 번째로 실시한 실험은 세포 독성에 대한 평가였다. 구절초 추출물이 유방암 세포주인 MCF-7 세포에 독성을 나타내지는지 확인하기 위해 세포독성 실험을 실행한 결과 구절초 추출물은 고농도(100 ㎍/ml)에서도 세포독성을 나타내지 않았다. 다음 실험으로 MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현을 구절초 추출물이 조절할 수 있는 지를 조사하였다.
그 결과 MCF-7 세포는 TPA-자극에 의해 NF-κB의 활성이 증가 하였고, 구절초 추출물을 처리 하였을 때 NF-κB의 활성이 유의성 있게 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3A).
구절초 추출물(25, 50, 100 ㎍/ml)은 MCF-7 세포에 TPA를 처리하기 한 시간전에 처리 하였으며 TPA(20 nM)를 처리하고 24시간 후에 세포들을 수집하여 단백질을 분리하였다. 그 결과, MCF-7세포에 TPA를 처리 하면 MMP-9의 발현이 증가 되었으나 구절초 추출물을 처리하였을 경우 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현이 감소되는 것을 확인하였다(Fig. 2A). MMP-9의 발현이 RNA level에서도 조절 되는지 real-time PCR로 확인한 결과 단백질 발현과 마찬가지로 구절초 추출물의 농도에 의존적으로 mRNA level이 감소한 것을 확인하였다(Fig.
그 결과, 구절초 추출물은 TPA-자극 되어진 NF-κB의 활성에서 IKKα와 IKKβ의 발현량에 영향을 주지 않았지만 IKKαβ의 인산화를 억제하였고, IκBα의 경우 TPA를 처리한 MCF-7 세포에서는 분해되었으나 구절초 추출물을 처리한 군에서는 IκBα의 분해가 일어나지 않았다.
96-well culture plate에 MCF-7 cells을 3×104 cells/well의 농도로 넣어준 다음 24시간 후에 구절초 추출물을 25, 50, 100 ㎍/ml을 처리 하였다. 다시 24시간 후에 세포독성을 확인한 결과 구절초 추출물이 첨가된 모든 농도에서 세포의 생존에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다(Fig. 1).
NF-κB와 AP-1 elements는 TPA-mediated MMP-9 유전자 발현에 중추적인 역할을 한다33,34). 대식세포의 파골세포로의 분화 과정에서 구절초 추출물이 NF-B pathway를 억제하는 현상을 확인하고 유방암 세포의 MMP-9 발현과 침윤을 억제할 수 있을 것이라고 예상하였다.
따라서 구절초 추출물은 MCF-7 세포에서 NF- κB의 활성을 억제하여 MMP-9의 발현을 억제한다는 결론을 얻을 수 있었다.
따라서 구절초 추출물이 IKK/αβ, IκBα의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다.
2C). 따라서, 구절초 추출물이 MCF-7세포에서 TPA-자극 MMP-9의 발현을 강력하게 억제하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.
구절초 추출물은 MCF-7 세포에서 MMP-9의 발현을 단백질 레벨과 mRNA 레벨에서 강력하게 억제하는 효과를 보였다. 또한 MMP-9의 효소 활성 역시 구절초 추출물에 의해 억제 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과 구절초 추출물이 MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의해 발현되는 MMP-9을 억제한다는 증거를 확보할 수 있었다.
또한 구절초 추출물에 의해 NF-κB의 subunit인 p65와 p50이 감소하는 것을 확인하였다(Fig 3B).
또한 MMP-9의 효소 활성 역시 구절초 추출물에 의해 억제 되는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과 구절초 추출물이 MCF-7 세포에서 TPA-자극에 의해 발현되는 MMP-9을 억제한다는 증거를 확보할 수 있었다.
이러한 실험결과는 MCF-7 세포에서 구절초 추출물이 p-IKKαβ와 p-IκBα의 감소를 통해 NF-κB의 활성을 억제함으로써 TPA에 의한 MMP-9 발현 조절 가능성을 보여준다.
MCF-7 세포를 TPA로 자극 하였을 경우 TPA를 자극하지 않았을 때보다 전이가 10-fold가 증가한 것을 확인 할 수 있었다. 하지만 구절초 추출물을 함께 처리했을 경우 MCF-7의 침투능력이 약 80%가 감소되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4).
후속연구
따라서 암의 전이를 억제하거나 늦출 수 있는 치료약의 개발은 암환자의 생명을 연장시킬 수 있는 중요한 치료적 접근이 될 것으로 여겨지고 있다. 결국, 구절초 추출물은 여러 종류의 암 전이를 억제할 수 있는 하나의 생약 후보가 될 수 있을 것으로 사료된다.
MMP-9의 발현과 직접적인 관련이 있는 NF-κB의 활성역시 구절초 추출물에 의해 억제되는 것을 확인 할 수 있었으며, 최종적으로 MCF-7 세포의 전이에도 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다. 따라서, 구절초 추출물에 대한 전임상연구 근거를 창출하기 위하여 향후 동물실험을 통한 효능검증이 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
구절초는 무엇인가?
Carl Maximowicz에 의해 명명 되어진 Chrysanthemum zawadskii var. latilobum의 한국 이름은 구절초이며, 구절초는 국화과 국화속에 속하는 다 년생 식물이다1). 구절초는 폐렴, 기관지염, 기침, 감기, 인두염, 방광 관련질환, 위장 장애, 고혈압을 치료하기위한 약으로 사용되어져 왔다1,2).
구절초는 어떤 질환들에 약으로 사용되는가?
latilobum의 한국 이름은 구절초이며, 구절초는 국화과 국화속에 속하는 다 년생 식물이다1). 구절초는 폐렴, 기관지염, 기침, 감기, 인두염, 방광 관련질환, 위장 장애, 고혈압을 치료하기위한 약으로 사용되어져 왔다1,2). 또한, 구절초는 항암, 산화, 염증과 간 보호 효과와 같은 다양한 약물 특성이 있다고 보고되었다3-7).
구절초 추출물의 항전이 효과를 확인하기 위해 MCF-7 세포에 처리하여 독성 여부를 확인한 결과는 어떠했는가?
구절초 추출물의 항전이 효과를 검증하기 위한 첫 단계로 MCF-7 세포에 대한 세포독성을 확인하였다. 구절초 추출물을 MCF-7 세포에 농도별로 처리 하여 세포독성 여부를 확인한 결과 모든 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. TPA-자극에 의한 MMP-9의 발현에서 구절초 추출물은 농도에 의존적으로 MMP-9의 발현을 억제하였고, 효소 활성역시 감소시켰다.
참고문헌 (42)
Kwon, H.S., Ha, T.J., Hwang, S.W., Jin, Y.M., Nam, S.H., Park, K.H., Yang, M.S. Cytotoxic flavonoids from the whole plants of Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum Kitamura. J. Life Sci. 16: 746-749, 2006.
Kim, Y.Y., Lee, S.Y., Yim, D.S. Biological activities of linarin from Chrysanthemum zawadskii var latilobum. J. Pharm. Soc. Korea. 45: 604-610, 2001.
Singh, R.P., Agrawal, P., Yim, D.S., Agarwal, C., Agarwal, R. Acacetin inhibits cell growth and cell cycle progression, and induces apoptosis in human prostate cancer cells: Structure-activity relationship with linarin and linarin acetate. Carcinogenesis. 26: 845-854, 2005.
Seo, J.Y., Lim, S.S., Park, J.A., Lim, J.S., Kim, H.J., Kang, H.J., Park, J.H.Y., Kim, J.S. Protection by Chrysanthemum zawadskii extract from liver damage of mice caused by carbon tetrachloride is maybe mediated by modulation of QR activity. Nutr Res Pract. 4: 93-98, 2010.
Han, S., Sung, K.H., Yim, D., Lee, S., Lee, C.K., Ha, N.J., Kim, K. The effect of linarin on LPS-induced cytokine production and nitric oxide inhibition in murine macrophage cell line RAW 264.7. Arch Pharm Res. 25: 170-177, 2002.
Friedel, G., Pastorino, U., Ginsberg, R.J., Goldstraw, P., Johnston, M., Pass, H., Putnam, J.B., Toomes, H. Results of lung metastasectomy from breast cancer: prognostic criteria on the basis of 467 cases of the International Registry of Lung Metastases. Eur J Cardiothorac Surg. 22: 335-344, 2002.
Mackay, A.R., Hartzler, J.L., Pelina, M.D., Thorgeirsson, U.P. Studies on the ability of 65-kDa and 92kDa tumor cell gelatinases to degrade type IV collagen. J Biol Chem. 265(35):21929-21934, 1990.
Cohen, S. The role of cell-mediated immunity in the induction of inflammatory responses. Am J Pathol. 88(3):502-509, 1977.
Velinov, N., Poptodorov, G., Gabrovski, N. The role of matrix metalloproteinases in the tumor growth and metastasis[J]. Khirurgiia(Sofiia). 45: 44-49, 2010.
Mikala Egeblad and Zena Werb. New functions for the matrix metalloproteinases in cancer progerssion. Nat Rev Cancer(Review). 2(3):161-174, 2002.
Rha, S.Y., Kim, S.J., Chung, H.C., Kim, J.H., Roh, J.K., Lee, K.S., Kim, B.S. Expression of Matrix-metalloproteinase-9 (MMP-9) in breast cancer. J Kor Cancer. 28(2):247-252, 1996.
Saito, N., Hatori, T., Murata, N., Zhang, Z.A., Ishikawa, F., Nonaka, H., Iwabuchi, S., Samejima, H. A double three-step theory of brain metastasis in mice: the role of the pia mater and matrix metalloproteinases. Neuropathol Appl Neurobiol. 33(3):288-298, 2007.
Kim, J.H., Ahn, D.K. A study on the effect of Chrysathemum siviricum Fischer. Kor J Herbology 4: 15-21 1989.
Singh, R.P., Agrawal, P., Yim, D.S., Agarwal, C., Agarwal, R. Acacetin inhibits cell growth and cell cycle progression and induces apoptosis in human prostate cancer cells: Structure-activity relationship with linarin and linarin acetate. Carcinogenesis 26: 845-854, 2005.
Seo, J.Y., Lim, S.S., Park, J.A., Lim, J.S., Kim, H.J., Kang, H.J., Park, J.H.Y., Kim, J.S. Protection by Chrysanthemum zawadskii extract from liver damage of mice caused by carbon tetrachloride is maybe mediated by modulation of QR activity. Nutr Res Pract. 4: 93-98, 2010.
Han, S., Sung, K.H., Yim, D., Lee, S., Lee, C.K., Ha, N.J., Kim, K. The effect of linarin on LPS-induced cytokine production and nitric oxide inhibition in murine macrophage cell line RAW264.7. Arch Pharm Res. 25: 170-177, 2002.
Kwon, H.S., Ha, T.J., Hwang, S.W., Jin, Y.M., Nam, S.H., Park, K.H., Yang, M.S. Cytotoxic flavonoids from the whole plants of Chrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum Kitamura. J Life Sci. 16: 746-749, 2006.
Gu, D.R., Hwang, J.K., Munkhsoyol, E., Kwon, K.B., Kim, M.S., Lee, Y.R., Lee, S.H. Inhibitory Effect of hrysanthemum zawadskii Herbich var. latilobum Kitamura Extract on RANKL-Induced Osteoclast Differentiation (Online). Article ID 509482, http://dx.doi.org/10.1155, 2013.
Eberhardt, W., Huwiler, A., Beck, K. F., Walpen, S., Pfeilschifter, J. Amplification of IL-1 beta-induced matrix metalloproteinase-9 expression by superoxide in rat glomerular mesangial cells is mediated by increased activities of NF-kappa B and activating protein-1 and involves activation of the mitogen-activated protein kinase pathways. J Immunol 165: 5788-5797, 2000.
Lee, Y.R., Noh, E.M., Oh, H.J., Hur, H., Kim, J.M., Han, J.H., Hwang, J.K., Park, B.H., Park, J.W., Youn, H.J., Jung, S.H., Kim, B.S., Jung, J.Y., Lee, S.H., Park, C.S., Kim, J.S. Dihydroavenanthramide D inhibits human breast cancer cell invasion through suppression of MMP-9 expression. Biochem Biophys Res Commun 405: 552-557, 2011.
John, A., Tuszynski, G. The role of matrix metalloproteinases in tumor angiogenesis and tumor metastasis. Pathology & Oncology Research. 7(1):14-23, 2001.
Haas, T.L., Madri, J.A. Extracellular matrix-driven matrix metalloproteinase production in endothelial cells: implications for angiogenesis. Trends in cardiovascular medicine 9(3):70-77, 1999.
Clark, I.M., Swingler, T.E., Sampieri, C.L., Edwards, D.R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. The international journal of biochemistry & cell biology. 40(6):1362-1378, 2008.
Eberhardt, W., Huwiler, A., Beck, K.F., Wallpen, S., Pfeilschifeter, J. Amplification of IL-1 beta-induced matrix metallproteinase-9 expression by superoxide in rat glomerular mesangial cells is mediated by increased activities of NF-kappa B and activating protein-land involves activation of the mitogen-activated protein-land involves activation of the mitogen-activated protein kinase pathways. J Immunol. 105: 5788-5797, 2000.
Schwartz, S.A., Hernandez, S.A., Mark, E.B. The role of NF-kappaB/ IkappaB IkappaB proteins in cancer: implications for novel treatment strategies. Surg Oncol. 8(3):143-153, 1999.
Oya, M., Ohtsubo, M., Takayanagi, A., Tachibana, M., Shimizu, N., Murai, M. Constituitive activation of nuclear factor-kappaB prevents TRAIL-induced apoptosis in renal cancer cells. Oncogene 20(29):3888-3896, 2001.
Beyaert, R., Heyninck, K., Van, H.S. A20 and A20-binding proteins as cellular inhibitors of nuclear factor-kappaB-dependent gene expression and apoptosis. Biochem Pharmacol 60(8):1143-1151, 2000.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.