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제안 방법
- 본 연구에서 2K1C에 의해 실험적으로 유발된 신성 고혈압은 腎의 혈류장애에 의해 발생된 鬱症로 腎虛에 해당할 수 있으며 그 증상은 腎虛와 함께 이로 인한 고혈압이라는 心火上逆 증상이 동반되어 나타므로, 사암오행침법의 心勝格 중 自經의 子性穴과 子性經의 子性穴에 해당하는 太白 神門에 捻轉 및 迎隨補瀉 手技法를 시행하여 혈압, 혈장 renin, ANP 및 심장비대지수들을 비교 관찰하였다.
- 고혈압을 유발시키기 위하여 白鼠를 대상으로 EntobarTM (pentobarbital sodium, 50 ㎎/㎏)를 복강 내 주사하여 마취시킨 후 복부를 절개하여 왼쪽 신동맥을 노출시켜 주위 조직들을 깨끗이 제거한 다음 간격이 0.2 ㎜되는 silver clip을 신동맥에 끼워 넣고 봉합하였다. 수술 4주 후에 혈압을 측정하여 수축기 혈압이 150 ㎜Hg 이상인 경우를 고혈압 백서로 사용하였다.
- 모든 군은 2K1C 방법으로 수술을 시행하여 4주 후 고혈압이 유발된 상태를 확인하였으며, 이후 대조군(Control, n=5)은 침자를 시행하지 않은 군이고, 太白·神門 시계방향 捻轉 手技群(Acu-1a, n=5)은 太白·神門에 침자한 후 시계방향으로 6회 捻轉手技한 군이고, 太白·神門 반시계방향 捻轉 手技群(Acu-2a, n=5)은 太白·神門에 침자한 후 반시계방향으로 6회 手技한 군이고, 太白·神門 迎隨 瀉法手技群(Acu-3a, n=5)은 太白·神門에 경락 반대 방향인 발가락 (太白) 및 몸쪽 방향(神門)으로 침자한 군이고, 太白·神門 迎隨 瀉法 捻轉 반시계방향 手技群(Acu-4a, n=5)은 大敦·湧泉에 경락 반대 방향인 발가락 (太白) 및 몸쪽 방향(神門)으로 침자한 후 반시계방향으로 6회 手技한 군이며, 이와 같이 5개 군으로 군을 분리하여 실험하였다(Table 1).
- 혈압의 측정은 2K1C 유발 후 4주째에는 침자를 시행하지 않고 혈압을 측정하였고, 4½, 5, 5½, 6, 6½주째에는 먼저 침자를 시행하고 1시간 후에 혈압을 각각 측정하였다.
- 鍼刺는 2K1C 수술 후 4주째에 고혈압이 유발된 白鼠를 선별하고 난 후, 4½, 5, 5½, 6, 6½주째에 각각 1회씩 白鼠의 양측의 穴位에 30초 동안 각 군별로 침자 수기법을 시행하였다.
- 鍼刺는 2K1C 수술 후 4주째에 고혈압이 유발된 白鼠를 선별하고 난 후, 4½, 5, 5½, 6, 6½주째에 각각 1회씩 白鼠의 양측의 穴位에 30초 동안 각 군별로 침자 수기법을 시행하였다. 鍼은 毫鍼(No.3-0.5, Haenglim, Korea)을 이용하였으며, 鍼刺 深度는 피하를 통과하여 捻轉 및 迎隨 手技法 시행이 가능할 수 있는 정도의 깊이로 하였다. 침자 手技法 시행은 전 실험기간 동안 숙련된 전문가 1인이 계속하여 시술하였다.
- 백서의 혈압 변동 관찰은 non-invasive blood pressure 측정기인 rat tail blood pressure system(RTBP2003, WPI, U.S.A.)을 활용하여 관찰하였다. 백서를 animal warming restrainer에 넣고, 백서의 tail에 piezoelectric pulse sensor와 occlusion cuff를 위치시킨 다음 컴퓨터에 연결된 pulse signal의 size가 적당한 정도로 관찰되면, 이때 기기를 작동시켜 수축기 혈압을 관찰하였다.
- )을 활용하여 관찰하였다. 백서를 animal warming restrainer에 넣고, 백서의 tail에 piezoelectric pulse sensor와 occlusion cuff를 위치시킨 다음 컴퓨터에 연결된 pulse signal의 size가 적당한 정도로 관찰되면, 이때 기기를 작동시켜 수축기 혈압을 관찰하였다. 혈압의 측정은 2K1C 유발 후 4주째에는 침자를 시행하지 않고 혈압을 측정하였고, 4½, 5, 5½, 6, 6½주째에는 먼저 침자를 시행하고 1시간 후에 혈압을 각각 측정하였다.
- 각 군들의 백서들은 고혈압 유발 후 6½주째에 5회의 처치가 끝난 후 체중을 측정하였고, 단두한 후 심장을 적출하였으며, 적출 후 심장에 연결된 혈관과 근막 등과 혈흔을 각 흰쥐에게 동일한 정도로 제거한 후 balance(Metler toledo, d=0.1 mg, Switzerland)로 무게를 측정하였다.
- 각 실험군은 대조군에 비하여 α〓0.05 수준 (P<0.05)과 α〓0.01 수준 (P<0.01)에서 유의성을 검정하였으며, 다만 0.1<α<0.05인 경우에는 한계적으로 유의한 경우로 검정하였다.
- 각 군들의 백서들을 단두한 후 혈액 5 ㎖를 얻었으며, 혈액 채취시 tube에 EDTA(50 ㎎/㎖) 100 ㎕를 넣고 원심 분리하여 plasma를 분리하였다. Angiotensinogen(renin substrate)은 maleate buffer(1.5M, pH 5.88) 50 ㎕, 8-Hydroxyquinoline(3.4 mM) 10 ㎕, neomycin sulf-ate(20%) 10 ㎕, phenylmethylsulfonyl-fluoride(PMSF 305 mM) 10 ㎕, plasma 200 ㎕, D W 170 ㎕로 만들었다. Renin의 radioimmuno assay는 plasma 50 ㎕에 450 ㎕ substrate (angiotensinogen)를 넣은 후 37 ℃에서 3시간정도 incubation하였다.
- Sep-Pak C18 Cartridge(Waters Associates, Milford, MA, USA)에 100% acetonitrile 5 ㎖를 syringe로 통과시킨 후 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid) 5 ㎖로 통과시키고 plasma 1 ㎖을 천천히 통과시킨 후, 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid) 5 ㎖를 통과시키고 60% acetonitrile 2 ㎖을 천천히 통과시켜 tube에 sample을 받아 Speed Vaccum으로 완전히 건조시켰다. 건조된 tube에 ANP buffer 150 ㎕를 넣고 4 ℃에서 10분 정도 incubation후, 4℃에서 10,000 rpm 5분간 원심분리해서 상층액 100 ㎕를 tube에 분리해 ANP Ab 100 ㎕를 넣고 4 ℃에서 24시간 incubation 후, ANP tracer 100 ㎕를 넣고 4 ℃에서 24시간 incubation 후 Charcoal 1 ㎖을 넣고 3000 rpm 15분간 원심분리 후 gamma counter(COBRA, Packard, USA))로 radioactivity를 측정하였다.
- 이에 이전 연구를 심화하여 心勝格 중 自經의 子性穴과 子性經의 子性穴에 해당하는 太白 神門鍼刺과 함께 捻轉 및 迎隨補瀉 手技法의 혈압의 강압 효과를 알아보고자 혈압 변동, 혈장 renin, 혈장ANP 및 심장비대지수를 비교 관찰 하였다.
- 실험적으로 유발된 2K1C 고혈압 동물 모델에 대하여 太白 神門을 취하여 捻轉 및 迎隨補瀉 手技法에 따른 혈압, 혈장 renin, ANP 및 심장비대지수들을 비교 관찰한 바 다음과 같은 결론을 얻었다.
대상 데이터
- 체중이 약 180～200 g의 Sprague Dawley계의 白鼠를 사육장(실내온도, 24～26 ℃)내에서 물과 사료를 충분히 섭취하게 하면서 사육하였다가 실험에 사용하였다.
- 2 ㎜되는 silver clip을 신동맥에 끼워 넣고 봉합하였다. 수술 4주 후에 혈압을 측정하여 수축기 혈압이 150 ㎜Hg 이상인 경우를 고혈압 백서로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 Excel statistic program(Excel 2002, Microsoft)을 이용하여 평균치와 표준오차(mean ±SE)로 표시하였고, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Windows용 SPSS(ver10.0.5, SPSS)을 사용하여 비모수적 방법으로 Mann-Whitney U test를 시행하였다.
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