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문제 정의
- 본 연구에서는 생체친화성 친수성 고분자인 히알루론산에 자극 감응성을 가지는 물질을 도입하여 새로운 의료용 고분자 물질을 탐구하고자 한다. 생체고분자인 히알루론산과 ELP 혹은 PNIPAAm의 반응을 이용하여 두 공중합체 물질을 합성하였다 이제까지 PNIPAAm 과 히알루론산의 공중합체는 시도된 바 있으나, ELP와의 공중합체는 보고된 바 없으며, 이 두 공중합체의 체계적인 비교도 보고된 바 없다 n 이와 같은 실험은 온도감응성을 가지는 생체친화적인 고분자의 제조를 통해 보다 온도에 안정적이며 효율적인 약물전달을 가능하게 할 수 있다.
제안 방법
- 분석. FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy: Magna 750, Nicolet, U.S.A) 을 이용하여 합성을 확인하였으며 NMR 600 MHz (nuclear magnetic resonance: VNS, Varian, U.S.A) 를 이용하여 합성을 확인하였다.
- PNIPAAm (ELP)-g-HA은 HAFNIPAAm (혹은 ELP) 가 1:0.5, 1:1, 1:2의 무게비로 반응이 되었으며 NMR을 통해 치환된 정도를 확인하였다. PNIPAAm과 HA의 빈응에서는 1:0.
- Rheometer (CVOD 1000NF Rheometer, Malvern Instrument, UK)를 이용하여 온도 변화에 따른 점도(viscosity)를 측정히였으며 온도 범위는 25에서 40℃끼지 측정하였으며 shear stress는 5 Pa 로 고정하여 측정하였다. 또한 온도 변화 속도는 2 ℃/min으로 진행하였다 위 과정은 총 5번을 진행하였으며 각 값들의 평균값을 결과값으로 히였다.
- 광학현미경 (BX51TRF, Olympus, Tokyo Japan) 을 이용하여 온도에 따른 탁도(turbidity) 를 측정하였다 온도 측정 가능 범위는 ±0.1℃이며 PNIPAAm-g-HA와 ELP-g-HA를 물에 녹여 2 wt% 의 용액을 만들어 슬라이드글라스 위에 0.1 mL를 떨어뜨리고 증발을 막기 위해 커버글라스로 덮은 뒤에 측정하였다. 또한 온도는 각 온도에서 1분 동안 방치 후에 광학현미경으로 측정하였다 이 괴정은 총 3번을 반복하여 측정하였다.
- 1 mL를 떨어뜨리고 증발을 막기 위해 커버글라스로 덮은 뒤에 측정하였다. 또한 온도는 각 온도에서 1분 동안 방치 후에 광학현미경으로 측정하였다 이 괴정은 총 3번을 반복하여 측정하였다.
- 온도에 따른 탁도를 측정하여 고분자들의 온도감응성을 파악할 수도 있다. 이 측정은 2 wt%의 용액 상태에서 측정하였으며 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다.
- Rheological 측정은 25에서 37℃까지 점도를 측정하였다. 이는 체내 온도를 염두에 둔 약물전달 분야에 적용할 때 그 거동을 파악하기 위한 것이며 37도 이상의 고온에서는 물질의 층 분리 현상으로 정확한 측정이 어려웠다' 이 실험은 각각의 고분자를 물에 녹여 4 wt% 용액을 만든 후 5 Pa의 일정한 전단력을 가해주었을 때 생기는 점도를 rheometer로 측정하였다. PNIPAAm (혹은 ELP)-g-HA 최종 합성물의 온도에 따른 점도의 변화는 Figure 7과 같디; 각 고분자에서 주사슬과 그래프트 사슬의 비에 따라 점도의 차이를 볼 수 있는데 PNIPAAm이나 ELP의 상대적인 반응비가 클수록 점도가 커지는 것을 확인할 수 있다 즉 그래프트 부분이 늘어날수록 점도는 증가하였다.
- HA 그래프트 공중합체의 합성 및 분석. 최종 반응 물질은 FTIR 과 NMR을 통해 치환율과 반응을 확인하고 히알루론산과의 반응물질과 반응비에 따른 물리적, 화학적 특성을 확인하였다.
- 히알루론산 생체고분자에 자극감응성을 가지는 사슬을 conjugation 시켜 그래프트 공중합체를 합성하였다. 반응 물질의 반응비를 변화시켜 주사슬과 그래프트 사슬의 무게비를 변화시킬 수 있었다.
대상 데이터
- 5 pm, 90 mm) 을 이용하여 결정을 얻어냈다. Elastin-like peptide (ELP)([(GVGVP GVGVP GEGVP GVGVPGVGVP GVGVPMGVGVP)])는 바이오엘라스틱사(U.S.A.)에서 구입하였다물(Clomasolv, HPLC) 과 헥산(anhydrous, 95%)는 Sigma- Aldrich(USA) 에서 구매하였다. 메틸 알콜(99.
- )에서 구입하였다물(Clomasolv, HPLC) 과 헥산(anhydrous, 95%)는 Sigma- Aldrich(USA) 에서 구매하였다. 메틸 알콜(99.9 %)은 덕산(Korea) 에서 구입하였다.
- 히알루론산 sodium salt (HA) (Mj= ~ 1.6 x 106), A^-isopropylacryl- amide (NIPAAm) (97%), adipic dihydrazide (ADH), A^-(3-di- methylaminopropyl)-A^-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC), 1 -hydroxybenzotriazole hydrate (HOBt), 4, 4-azobis (4-cyano- valeric acid)(ACA) 들은 정제과정 없이 사용되었다. ^isopropyl- acrylamide는 헥산 용액에서 재결정 방법을 통한 정제과정을 거쳐 사용하였다.
성능/효과
- 5 ℃에서 탁도 변화를 확인할 수 있다. ELP-g-HA는 점도 측정에서는 PNIPAAm과 같은 LCST* 파악하기 어려웠으나, 치환 정도와 온도의 증가가 점도와 비례함을 확인하였으며, 탁도 변화 측정에서는 PNIPAAm-g-HA와 비슷한 34℃에서 LCST를 확인할 수 있었다. 이러한 자극감응성 히알루론산은 약물 방출과 조직공학 등 다양한 연구분아에 활용할 수 있는 가능성을 보여준다.
- 1 wt%의 치환율을 확인하였다. 또한 HA오? ELP의 반응에서의 치환 정도는 1:0.5 비율에서 20.3 wt%, 1:1 비율에서 37.6 wt%, 1:2 비율의 반응에서는 58.8 wt % 의 치환율을 확인하였다.
- 반응 물질의 반응비를 변화시켜 주사슬과 그래프트 사슬의 무게비를 변화시킬 수 있었다. PNIPAAM-g-HA는 치환율이 커질수록, 온도가 올라갈수록 점도가 높아지는 것을 확인하였으며 치환율에 상관없이 30℃ 부근에서 명확한 LCST를 보인다. 또한 33.
- 5, 1:1, 1:2의 무게비로 반응이 되었으며 NMR을 통해 치환된 정도를 확인하였다. PNIPAAm과 HA의 빈응에서는 1:0.5 비율에서 49.1 wt%, 1:1반응에서 62.8 wt%, 1:2반응에서 78.1 wt%의 치환율을 확인하였다. 또한 HA오? ELP의 반응에서의 치환 정도는 1:0.
- 과정1의 수득률은 92.5%, 과정2의 수득률은 89.8%, 과정3의 수득률은 HA와 PNIPAAm-COOH의 반응비에 따라 ]:0.5에서는 95.5%, 1:1에서는 96.2%, 1:2에서는 95.1% 이었다 또한 HA와 ELP의 반응비에 따라 1:0.5에서는 95.5%, 1:1에서는 94.4%, 1:2에서는 93.0% 이었다 성공적으로 각 직용기의 conjugation과 그래프트화 반이 이루어졌음을 확인할 수 있었다
- 또한 PNIPAAm-g-HA 이 LCST를 갖는 것을 확인할 수 있으며 이는 약 30℃에서 나타난다 ELP-g-HA는 매우 완만한 전이가 상당히 넓은 온도 영역에서 존재하여, LCST로 볼 수 있는 명확한 전이온도를 파악하기 어려웠다. ELP의 경우도 PNIPAAm-^-HA 와 같이 반응비가 클수록 점도가 커지는 것을 볼 수 있다.
- ELP의 경우도 PNIPAAm-^-HA 와 같이 반응비가 클수록 점도가 커지는 것을 볼 수 있다. 또한 전체적으로 PNIPAAm-g-HA에 비해 매우 낮은 점도를 갖는 다는 것을 확인할 수 있다
- 또한 점도 측정에서는 LCST를 명확하게 확인하기 힘들었던 ELP- g-HA에서도 변화점은 존재하는데 PNIPAAm-g-HA보다 약간 높은 온도인 34℃에서 나타나는 것을 확인할 수 있다 또한 모든 용액이 완전히 불투명해지는 순간은 ELP-g-HA는 35.8℃, PNIPAAm- g—HA는 36.7 C이었다.
- 선형 H의 주사슬에 그래프트 사슬이 많이 붙을수록 점도가 상승하였으며, 그래프트 사슬의 온도감응성 상변화 특성을 그래프트 공중합체에서도 그대로 나타내었다 이로써 주사슬에 비해 상대적으로 소수성의 그래프트 사슬이 수용액 상에서 점도 상변이 등에 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있다 점도는 같은 농도에서 PNIPAAm-g-HA가 ELP- g-H보다 큰 점도를 가지며 이는 분자량의 차이일 수도 있으나, 랜 랜덤 사슬과 베타나선형의 사슬 구조 차이일 수도 았을 것으로 사료된다. PNIPAAm-g-HA의 경우 온도에 따른 급격한 점도 변화와 탁도 변화를 보여주는데 반대로 ELP-g-HA에서는 다소 완간한 변화를 보여준다.
- 완만한 변화는 cooperativity가 떨어지는 상전이로 그래프트 사슬의 이차구조의 차이에 기인하는 것으로 판단된다. 즉, PNEAAm의랜덤 사슬 구조와 ELP의 정형화된 나선형 구조가 상전이의 co operativity 차이를 가져오는 것으로 판단되며, 이는 기존의 7; 전이와 LCST 전이의 설명과 일치한다.
후속연구
- 13 또한 하이드로젤의 특징을 가짐으로써 조직공학에도 매우 적합한 물질의 제조가 가능하다. 아울러 PNIPAAm과 같이 온도 감응성을 가지는 물질 중 하나인 펜타펩티드 구조의 ELP를 이용한 공중합체를 PNIPAAm을 이용한 히알루론산 공중합체와 구조적, 물리적, 화학적 특성을 비교하고, 이를 통해 향후 보다 나은 온도 감응성 히알루론산을 개발할 수 있을 것이다.
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