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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 hyaluronidase를 처리하여 분자량 크기별로 제조한 HA의 항염증 효능을 평가하기 위해 RAW 264.7 세포에 LPS를 처리하여 염증 반응을 유도하고, 동시에 HA을 처리하여 산화질소 및 TNF-α의 생성량에 미치는 영향을 조사하였다.
- 따라서 본 연구에서는 고분자 HA을 hyaluronidase로 분해하여 분자량 크기에 따라 다양한 사이즈의 HA를 제조한 뒤, 사람 피부세포(Hs68 cells)에서의 콜라겐 합성능을 비교평가하고, Franz diffusion cell system을 이용하여 피부투과도를 비교하였다. 또한, 이들 HA을 RAW 264.7 (murine macrophage cell type)에서 항염증 활성을 비교 평가하여, 피부투과도 및 콜라겐 합성능이 높으면서 항염증 효과를 갖는 최적 분자량 크기의 HA을 스크리닝하고자 하였다.
제안 방법
- 5%, 및 1% 농도로 DMEM 배지에 녹여 세포에 처리하였다. 24 h 동안 배양한 다음 배양액을 모아 procollagen type Ⅰ C-peptide (PIP) ELISA kit를 이용하여 다음과 같은 방법으로 콜라겐 양을 측정하였다[25]. 단일클론 항체가 코팅된 plate에 antibody peroxidase (POD)와 배양액을 넣고 37 ℃, 3 h 반응시킨 다음, 기질액(tetramethylbenzidine solution, TMBZ) 100 µL를 넣고 15 min 동안 상온에서 반응시켰다.
- 24 h 뒤, 10 µg/mL의 LPS와 분자량 크기별로 제조된 HA (1, 10, 50, 및 100 kDa)을 각각 0.2%, 0.5%, 및 1% 농도로 DMEM 배지에 녹여 세포에 처리하였다.
- 24 h 뒤, 10 µg/mL의 lipopolysaccharide (LPS)와 분자량 크기별로 제조된 HA (1, 10, 50, 100 kDa)을 각각 0.2%, 0.5%, 및 1% 농도로 DMEM 배지에 녹여 세포에 처리하였다.
- incubator에서 37 ℃, 24 h 배양하였다. 24 h 뒤, 분자량 크기별로 제조된 HA (1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa)을 각각 0.2%, 0.5%, 및 1% 농도로 DMEM 배지에 녹여 세포에 처리하였다. 24 h 동안 배양한 다음 배양액을 모아 procollagen type Ⅰ C-peptide (PIP) ELISA kit를 이용하여 다음과 같은 방법으로 콜라겐 양을 측정하였다[25].
- incubator에서 37 ℃, 24 h 배양하였다. 24 h 뒤, 분자량 크기에 따라 제조된 HA (1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa)을 각각 0.2%, 0.5%, 및 1% 농도로 DMEM 배지에 녹여 세포에 처리하였다[24]. 24 h 동안 배양한 다음, 배양액을 모아 EZ cytox kit 에 100µL씩 분주하여 4 h 동안 37 ℃에서 반응한 뒤 분자량 크기에 따른 HA의 세포 독성을 microplate reader를 이용하여 450 nm에서 측정하였다[57].
- N-(1-napthyl) ethylenediamine, sulfanilamide, 및 phosphoric acid는 Sigma (USA)에서 구입하였다. EZ cytox kit (Daeil, Korea), procollagen type Ⅰ c-peptide (PIP) ELISA kit (Takara, Japan) 및 hyaluronan enzyme-linked immunosorbent assay kit (Echelon biosciences, USA)는 각각 세포 생존율, 콜라겐 및 피부 투과도를 측정하기 위해 사용하였다. Quantikine ELISA kit는 R&D (USA)에서 구입하여 TNF-α를 측정하였고, 분석기기는 microplate reader (Eon, BioTek, USA)를 사용하였다.
- HA의 분자량 크기에 따른 NO 생성 저해 활성을 mouse macrophage cell인 RAW 264.7 (TIB-71, ATCC, USA)세포를 이용하여 조사하였다. RAW 264.
- HA의 분자량(1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa) 및 농도(0.2, 0.5, 및 1%)에 따른 Hs68 섬유아세포의 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 EZ cytox kit을 이용하였다. 0.
- HA의 분자량을 측정하기 위해 1500, 660 kDa, 2.5 mg/mL 그리고 100 kDa, 50, 10, 1 kDa과 48 kDa의 pullulan (6351 pullulan standard set, Sigma, USA) standard를 10 mg/mL을 증류수에 녹여 gel permeation chromatography (GPC, Aliance 2695, Waters, USA)을 이용하여 이동상은 10 mM sodium phosphate (pH 7.0)을 사용하였고, 유량(flow rate)은 0.7 mL/min, 검출기는 refractive index detector (RI, 2414 refractive index detector, Waters, USA), 검출온도는 30 ℃, 컬럼은 OHpak column (SB-804HQ, Showa Denko, Japan), 컬럼온도는 30 ℃로 측정을 하여 분자량을 얻었다(Figure 1)[58].
- 그러나 HA을 피부에 적용할 시, 분자량이 큰 HA은 진피층을 통과하지 못하는 문제점이 있어, 독성이 없고 피부 투과도가 높은 HA을 개발할 필요가 있다. 따라서 본 연구에서는 고분자 HA으로부터 hyaluronidase 효소 분해를 통해 다양한 사이즈의 HA (1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa)을 제조하였고 콜라겐 합성능, 항염증능, 및 특히 피부투과도를 비교하였다.
- 따라서 본 연구에서는 고분자 HA을 hyaluronidase로 분해하여 분자량 크기에 따라 다양한 사이즈의 HA를 제조한 뒤, 사람 피부세포(Hs68 cells)에서의 콜라겐 합성능을 비교평가하고, Franz diffusion cell system을 이용하여 피부투과도를 비교하였다. 또한, 이들 HA을 RAW 264.
- 2% 농도의 분자량 크기별로 제조된 HA (1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa) 5 mL를 넣고 다른 한쪽(receptor chamber)에는 PBS 5 mL를 넣은 후에 diffusion cell drive console을 이용하여 37 ℃, 600 rpm으로 일정하게 교반을 하였다. 시간별(1, 2, 4, 8, 및 12 h)로 투과한 HA을 hyaluronan enzyme-linked immunosorbent assay kit을 이용하여 다음과 같은 방법으로 정량하였다[27].
- 염증성 사이토카인인 TNF-α를 처리하여 콜라겐의 분해를 유도하고, 0.2%의 HA을 처리하여 분해된 콜라겐의 회복능을 측정하였다.
- 구입한 인공피부를 Franz diffusion cell 양쪽에 부착하여 클램프로 고정하였다. 이 후 donor chamber 한쪽에는 0.2% 농도의 분자량 크기별로 제조된 HA (1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa) 5 mL를 넣고 다른 한쪽(receptor chamber)에는 PBS 5 mL를 넣은 후에 diffusion cell drive console을 이용하여 37 ℃, 600 rpm으로 일정하게 교반을 하였다. 시간별(1, 2, 4, 8, 및 12 h)로 투과한 HA을 hyaluronan enzyme-linked immunosorbent assay kit을 이용하여 다음과 같은 방법으로 정량하였다[27].
- 한편, 분자량 크기에 따른 HA가 TNF-α 생성량에 어떤 영향을 미치는지 RAW 264.7세포를 이용하여 조사하였다.
대상 데이터
- Dulbeco’s modified Eagle medium (DMEM)및 fetal bovine serum (FBS)는 ATCC (USA)에서 구입하였고, penicillin / streptomycin (P/S)과 phosphate buffered saline (PBS)는 Hyclone (USA)에서, 0.25% trypsin EDTA는 Thermo fisher scientific (USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 25% trypsin EDTA는 Thermo fisher scientific (USA)에서 구입하여 사용하였다. N-(1-napthyl) ethylenediamine, sulfanilamide, 및 phosphoric acid는 Sigma (USA)에서 구입하였다. EZ cytox kit (Daeil, Korea), procollagen type Ⅰ c-peptide (PIP) ELISA kit (Takara, Japan) 및 hyaluronan enzyme-linked immunosorbent assay kit (Echelon biosciences, USA)는 각각 세포 생존율, 콜라겐 및 피부 투과도를 측정하기 위해 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 고분자 HA는 다미화학(Korea)에서 구입하여 기질로서 사용하였고, Lee 등의 방법에 따라 생산한 hyaluronidase로 분해하여 저분자 HA을 분자량 크기에 따라(1, 10, 50, 100, 660, 및 1500 kDa) 획득하였다[15]. 효소반응은 1% 고분자 HA을 3% 염화나트륨이 함유된 100 mM Tri-HCl 완충액(pH 7.
- 사람 피부 섬유아세포인 Hs68 (CRL-1635, ATCC, USA)세포를 1 × 104 cells/mL의 농도로 96-well plate에 seeding한 후, 10% FBS와 1% P/S가 포함된 DMEM 배지와 함께 5% CO2 incubator에서 37 ℃, 24 h 배양하였다.
- 인공피부를 사용하여 실험을 진행하였으며 인공피부는 각질층, 표피(epidermis), 진피(dermis) 피부의 전층을 재현해 놓은 3D 피부모델의 Neoderm-ED (TEGO Science, Korea) 6-well을 테고사이언스에서 구입하여 사용했다. 구입한 인공피부를 Franz diffusion cell 양쪽에 부착하여 클램프로 고정하였다.
데이터처리
- HA의 분자량 크기에 따른 TNF-α의 생성 저해 활성을 평가하기 위해 Quantikine ELISA kit를 이용하여 측정하였다.
- 유의성 검증은 Student’s t-test를 실시하였으며 실험군 간의 유의성은 p＜0.05 수준에서 검증하였다.
성능/효과
- 0.2%의 660 및 1500 kDa HA의 시간에 따른 피부 투과도는 처리하기 전에 비해 2% 미만으로 투과율이 미미한 반면, 100 kDa 이하의 HA은 모두 시간이 지남에 따라 인공피부 투과율이 현저히 증가하였다.
- 5, 및 1%)에 따른 Hs68 섬유아세포의 생존율에 미치는 영향을 조사하기 위하여 EZ cytox kit을 이용하였다. 0.2, 0.5, 및 1%의 1 kDa의 HA을 처리하였을 때 대조군과 비교하여 세포 생존율이 각각 12, 11, 9% 감소하였고 10 kDa의 HA을 처리하였을 때는 세포 생존율이 각각 14, 14, 10% 감소하였다. 한편, 50, 100, 660 및 1500 kDa의 HA을 농도별로 처리하였을 때, 5% 내외의 미미한 세포 생존율 감소를 나타났다(Figure 2).
- 1 및 100 kDa의 HA 외에 50 kDa의 HA을 처리한 군은 가장 높은 TNF-α 생성 저해율을 보이며 항염증 효과를 나타냈다.
- 10 µg/mL의 LPS와 함께 50 kDa의 HA 함량을 0.2, 0.5, 및 1%를 처리한 군은 12, 31 및 39%의 높은 TNF-α 생성 저해율을 나타냈고, 10 kDa의 HA을 처리한 군 또한 21, 26 및 36%의 높은 TNF-α 생성 저해율을 나타냈다(Figure 5B).
- 그중 가장 높은 투과율을 보인 HA은 분자량 1 kDa의 HA으로 1, 2, 4, 8, 및 12 h에 측정한 피부 투과량이 처리하기 전에 비해하여 26, 53, 62, 69 및 87%로 증가하였고, 다음으로 높은 투과율을 보인 HA은 분자량 10 kDa의 HA으로 나타났다. 10 kDa의 HA은 시간이 지남에 따라 25, 51, 55, 64 및 75%로 인공피부 투과율이 증가하였다. 그 외에 50 kDa HA의 피부 투과율은 처리하기 전에 HA 투과율에 비교하여 시간에 지남에 따라 24, 41, 55, 57 및 76%로 증가하였고, 100 kDa의 HA은 시간이 지남에 따라 23, 33, 36, 37 및 50%로 인공피부 투과율이 증가하였다.
- 100 kDa 이하의 HA을 이용하여 TNF-α 생성량을 측정한 결과, LPS (10 µg/mL)와 함께 1 kDa의 HA 0.2%를 처리한 군은 대조군과 비교하여 TNF-α 생성량이 10% 증가하였고, NO 생성량 측정 결과와 일치하였고, 100 kDa의 HA 0.2, 0.5 및 1%를 처리한 군은 LPS만 처리한 대조군과 비교하여 TNF-α 생성량이 각각 8, 13 및 23% 저해하였다.
- 이들 HA은 사람 피부 섬유아세포인 Hs68에 독성이 없는 것을 확인하였으며, 콜라겐 합성능을 측정한 결과, 분자량 크기가 증가함에 따라 콜라겐 합성률이 증가하는 것을 확인하였다. Franz diffusion cell system을 이용하여 시간에 따른 인공피부 투과율을 측정한 결과 600 및 1500 kDa의 HA은 전혀 투과하지 못한 반면, 상대적으로 저분자인 1, 10, 50, 및 100 kDa의 HA은 시간이 지남에 따라 투과율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다. 피부노화에 직⋅간접적 영향을 미치는 염증반응에 대한 HA의 항염증 효능을 RAW 264.
- 그 결과 TNF-α (20 ng/mL)만 처리한 대조군은 아무것도 처리하지 않은 untreated control과 비교한 결과 콜라겐 생합성이 20% 감소하였다.
- 100 kDa 이하의 HA은 모두 시간이 지남에 따라 인공피부 투과율이 현저히 증가하였다. 그중 가장 높은 투과율을 보인 HA은 분자량 1 kDa의 HA으로 1, 2, 4, 8, 및 12 h에 측정한 피부 투과량이 처리하기 전에 비해하여 26, 53, 62, 69 및 87%로 증가하였고, 다음으로 높은 투과율을 보인 HA은 분자량 10 kDa의 HA으로 나타났다. 10 kDa의 HA은 시간이 지남에 따라 25, 51, 55, 64 및 75%로 인공피부 투과율이 증가하였다.
- 따라서 50 kDa의 HA이 피부주름을 유도하는 염증반응을 효과적으로 억제시킴으로써 콜라겐 분해 및 DNA 변이를 억제하고 결과적으로 피부 노화를 지연시키는 효과가 있을 것으로 판단되며, 따라서 이들 저분자 HA이 피부 개선용 화장료 조성물로서 활용될 가능성을 확인하였다.
- 따라서 본 실험에 사용된 1 kDa HA 또한 NO생성에는 영향을 미치지 않고, 면역 및 염증반응에 가장 중요한 인자인 TNF-α의 생성을 급격히 증가시켜 대식세포 내 염증반응을 유도하는 것으로 보인다.
- 한편, 50, 100, 660 및 1500 kDa의 HA을 농도별로 처리하였을 때, 5% 내외의 미미한 세포 생존율 감소를 나타났다(Figure 2). 따라서 저분자에서 약 10% 내외의 세포독성을 나타냈으나, 전반적으로는 분자량에 상관없이 세포독성은 미미하거나 없는 것으로 나타났다.
- 따라서 피부 투과도가 미미한 고분자 HA (660 및 1500 kDa)을 제외하고 100 kDa 이하의 HA을 이용하여 NO 생성 억제능을 평가한 결과, LPS (10 µg/mL)와 함께 100 kDa의 HA 0.2 및 0.5%를 처리한 군은 LPS만 처리한 대조군과 비교하여 NO 합성량이 각각 10.5 및 5% 증가율을 보였다.
- 5 및 5% 증가율을 보였다. 반면에 50 kDa의 HA을 처리한 군은 가장 높은 NO 생성 저해율을 보였는데, 50 kDa의 HA 0.2, 0.5, 및 1%를 처리한 군은 12, 32, 및 40%의 높은 NO 생성 저해율로 처리한 농도에 비례하여 항염증 효과를 보였다. 한편 1 kDa의 HA을 처리한 군은 NO 생성에 영향을 미치지 않았다는 결과가 나타났다(Figure 5A).
- 5, 및 1%를 처리한 군은 12, 31 및 39%의 높은 TNF-α 생성 저해율을 나타냈고, 10 kDa의 HA을 처리한 군 또한 21, 26 및 36%의 높은 TNF-α 생성 저해율을 나타냈다(Figure 5B). 이는 앞서 언급한 NO 생성 저해율 측정 결과와 일치하였으며, 결론적으로 LPS를 처리한 마우스 유래 대식세포(RAW 264.7)에 대해 50 kDa의 HA의 농도 의존적이며 강력한 항염증 효능을 나타냄을 확인할 수 있었다.
- 이들 HA은 사람 피부 섬유아세포인 Hs68에 독성이 없는 것을 확인하였으며, 콜라겐 합성능을 측정한 결과, 분자량 크기가 증가함에 따라 콜라겐 합성률이 증가하는 것을 확인하였다. Franz diffusion cell system을 이용하여 시간에 따른 인공피부 투과율을 측정한 결과 600 및 1500 kDa의 HA은 전혀 투과하지 못한 반면, 상대적으로 저분자인 1, 10, 50, 및 100 kDa의 HA은 시간이 지남에 따라 투과율이 현저히 증가하는 것을 확인하였다.
- 피부노화에 직⋅간접적 영향을 미치는 염증반응에 대한 HA의 항염증 효능을 RAW 264.7 세포를 이용하여 조사한 결과, 50 kDa의 HA이 LPS에 의해 유도된 NO 및 TNF-α의 생성을 감소시켜 가장 높은 항염증 효능을 보였다.
- 5, 및 1%의 1 kDa의 HA을 처리하였을 때 대조군과 비교하여 세포 생존율이 각각 12, 11, 9% 감소하였고 10 kDa의 HA을 처리하였을 때는 세포 생존율이 각각 14, 14, 10% 감소하였다. 한편, 50, 100, 660 및 1500 kDa의 HA을 농도별로 처리하였을 때, 5% 내외의 미미한 세포 생존율 감소를 나타났다(Figure 2). 따라서 저분자에서 약 10% 내외의 세포독성을 나타냈으나, 전반적으로는 분자량에 상관없이 세포독성은 미미하거나 없는 것으로 나타났다.
- 한편, TNF-α (20 ng/mL)만 처리한 대조군과 비교하여, 1 kDa의 HA과 동시에 처리한 군은 38%, 10 kDa의 HA을 처리한 경우는 53%, 50 kDa의 HA을 처리한 경우는 50%, 100 kDa의 HA을 처리한 경우는 35%, 660 kDa의 HA을 처리한 경우는 48%, 1500 kDa의 HA을 처리한 경우는 59%의 콜라겐 생합성 증가로 HA의 분자량이 커질수록 콜라겐 생합성 정도가 증가하는 경향을 나타났다(Figure 3).
후속연구
- HA은 분자량이 커지면 점성과 탄성이 커지는 특징이 있지만, 진피층을 통과하지 못하는 반면, 저분자 HA은 피부 안쪽으로 흡수되어 자체 친수성기에 의해 수분을 흡착하여 고분자 HA과 비슷한 보습효력을 나타낸다고 보고되어 있다[8]. 따라서 본 실험에 사용된 저분자 HA (1, 10, 50, 및 100 kDa)은 피부 장벽을 통과하여 기저층을 지나 피부 안쪽까지 흡수가 가능하고 흡수된 저분자 HA은 수분을 흡착하여 보습 효과가 뛰어날 것으로 기대된다.
- 따라서 이러한 연구결과는 50 kDa의 HA가 사람 피부세포에서 콜라겐 합성을 증진시키고, 피부 투과율이 높으면서 뛰어난 항염증 효능을 가지므로 피부 주름을 유발하는 콜라겐 및 HA의 감소와 염증반응을 억제함으로써 피부노화 및 주름 개선용 화장품소재로 개발될 수 있는 가능성을 제시하였고, HA 분자량의 크기를 효소(hyaluronidase)에 의해 제조된 50 kDa의 HA에 대해서 collagen의 합성, 항염증 및 피부 흡수도를 종합적인 평가를 한 사례는 없으며 그 의의가 있다.
- HA은 피부진피의 3대 구성성분 중 하나로 세포성장, 분열, 수분유지에 영향을 미쳐 피부의 보습과 탄력을 유지시켜주는 역할을 하며 노화에 따라 그 양이 감소하며 피부 건조와 주름을 유발한다. 따라서 피부에 HA의 생합성을 촉진 시키거나, 인위적으로 HA을 투여함으로써 피부노화의 방지 및 주름 문제를 개선할 수 있을 것이다. 그러나 HA을 피부에 적용할 시, 분자량이 큰 HA은 진피층을 통과하지 못하는 문제점이 있어, 독성이 없고 피부 투과도가 높은 HA을 개발할 필요가 있다.
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