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문제 정의
- 따라서 본 연구는 측정불확도 개념을 대마 모발감정 분야에 도입하여 정량분석 결과의 신뢰도를 보다 객관적으로 표현하고자 하였다.11,12 우선 모발 중 대마 대사체 분석 과정에서 측정결과에 영향을 줄 수 있는 요인들을 찾아내어 측정량을 설정하고, 측정값으로부터 표준불확도, 합성표준불확도 및 확장불확도를 구하였다.
가설 설정
- 본 연구는 동위원소로 치환된 내부표준물질을 첨가 하는 내부표준법을 사용함으로써 전처리 과정에서 발생할 수 있는 불완전한 추출, 시험자의 조작 손실 등은 보정될 수 있는 것으로 가정하였다.
제안 방법
- 11,12 우선 모발 중 대마 대사체 분석 과정에서 측정결과에 영향을 줄 수 있는 요인들을 찾아내어 측정량을 설정하고, 측정값으로부터 표준불확도, 합성표준불확도 및 확장불확도를 구하였다. 측정결과에 대한 불확도는 약 95%의 신뢰수준에서의 포함인자를 적용하여 산출하였다.
- MS/MS fragmentation을 위해 충돌 기체로 아르곤을 사용하였으며 충돌이 일어나는 collision cell 내의 압력을(3.0 ± 0.3) mTorr로 유지하였다.
- 유도체 시약인 penta-fluoropropionic anhydride (PFPA)와 pentafluoropropanol (PFPOH)는 벨기에 Acros Organics사에서 구입하였으며, pH 조절에 사용된 acetic acid는 일본 Wako사 제품이다. THC-COOH 표준용액은 methanol 로 순차적으로 희석하여 각각 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 mg/L 농도로 제조하였으며, 사용하기 전까지는 -20 ℃에서 냉동 보관하였다.
- 건고된 잔사에 유도체 시약 PFPOH 30 µL와 PFPA 50 µL를 가하여 70℃에서 30분간 유도체화 반응을 진행하였다.
- 검정 곡선은 5개 농도(0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 µg/ kg)의 표준용액을 1회 분석하여 작성하였다(Table3).
- 측정불확도 평가는 측정량과 입력량들 사이의 수학적 관계식(측정모델) 설정, 표준불확도 산출, 합성표준불확도 및 확장불확도의 계산 단계로 구분할 수 있다. 관계식에 포함된 개별 요인의 불확도 요소로부터 표준불확도를 산출하고, 측정모델에 불확도전파법칙을 적용하여 합성표준불확도를 구하였으며 여기에 신뢰 수준 95%에 상당하는 포함인자(k)를 곱하여 확장불확 도를 구하였다.
- 대조 모발 시료에 THC-COOH 표준용액을 정량범위 내에 저, 중, 고의 농도에 해당되는 양을 첨가하고, 시료와 같은 방법으로 처리 분석한 후, 측정된 정량 값을 비교하여 정밀도 및 회수율을 검토하였다. 일간 정밀도는 4일간 반복하였고 회수율은 7회 반복하여 측정하였다.
- 신뢰구간 내의 한계값만이 주어지는 값의 불확도는 직사각형 확률분포로 가정되어야 한다. 따라서 반너비의 한계값으로 주어진 경우 직사각형 모양의 분포함수에 따르는 평가 방법을 이용하여 입력값의 불확도를 계산하였다. 상대표준불확도는 표준불확도를 초기 농도로 나누어 구하였다.
- 모발에서 THC-COOH 농도 측정에 관계되는 불확도 요소는 크게 시료량 측정과정에서 발생하는 불확도, 분석에 사용된 표준용액의 자체의 불확도 및 희석할 때 발생하는 불확도, 분석 결과로부터 측정값을 계산하는 과정에서 발생하는 검정 곡선에 대한 불확도, 측정이 시간을 두고 반복적으로 이루어질 때 발생되는 재현성에 대한 불확도 그리고 회수율 측정시 발생되는 불확도 등의 5가지 요소를 추출하였다.
- 본 실험에서는 3개 농도 중 가장 정밀도의 표준편차가 큰 농도인 0.2µg/kg에 해당하는 QC 시료를 이용하여 불확도를 산출하였다.
- 본 연구는 모발을 이용하여 대마 흡연 여부를 확인 하는 분석법에 측정불확도 개념을 처음 적용하여 실제 남용자의 모발 시료에서 측정된 대마 대사체 정량 값의 불확도 범위를 객관적으로 추정하였다. 특히 회수율 측정값에 대한 불확도를 개별 요소로 추가하였다는 점에 그 의미를 갖고 있다.
- 부피 측정시 발생하는 피펫의 불확도는 교정기관이 발행한 교정성적서의 불확도를 활용하여 산출하였다. 1.
- 따라서 반너비의 한계값으로 주어진 경우 직사각형 모양의 분포함수에 따르는 평가 방법을 이용하여 입력값의 불확도를 계산하였다. 상대표준불확도는 표준불확도를 초기 농도로 나누어 구하였다.
- 모발 시료 25 mg을 시험관(16 mm × 125 mm)에 넣은 후, isopropyl alcohol 10 mL로 3회 진탕하여 세척 하였다. 세척된 시료를 무균 상에서 1 시간 동안 건조시키고 독일 Retsch사의 자동분쇄기(Qiagen TissueLyser II)를 이용하여 2 mL Safe-Lock tube에서 30 Hz에서 8분간 모발을 분쇄하였다. 시료에 0.
- 시료를 ethyl acetate 100 µL로 재용해하여 PTFE 시린지 필터로 여과한 후 1 µL를 GC-NCI-MS/ MS에 주입하여 분석하였다.
- 001 mg/L 농도로 제조한 후, 표준용액 50 µL를 취하여 모발 시료에 첨가하였다. 앞에서 설정한 전처리 방법에 따라 시료를 처리한 후 얻은 크로마토그램으로부터 피크의 머무름 시간을 확인하고, 내부 표준물질의 피크 면적에 대한 분석 대상물질의 피크 면적 비로 검정 곡선을 작성하였다.
- 이때 검정곡선의 농도 범위는 0.05-10.0 µg/kg이었으며 측정된 QC 시료의 농도는 0.2, 2.0, 6.0 µg/kg으로 각각의 시료에 대해 7회 반복하여 측정하였다.
- 대조 모발 시료에 THC-COOH 표준용액을 정량범위 내에 저, 중, 고의 농도에 해당되는 양을 첨가하고, 시료와 같은 방법으로 처리 분석한 후, 측정된 정량 값을 비교하여 정밀도 및 회수율을 검토하였다. 일간 정밀도는 4일간 반복하였고 회수율은 7회 반복하여 측정하였다.
- 정량 범위는 모발 중에 검출되는 농도를 고려하여 농도 범위를 설정하였고 THC-COOH의 모발 중 농도는 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 µg/kg이 되도록 첨가하여 검정 곡선을 작성하였다.
- 측정 농도 값에는 모발량를 측정하는 과정에서 발생하는 불확도 요인이 포함되어 있다. 질량 측정시 발생하는 불확도는 교정기관이 발행한 교정성적서의 교정불확도를 활용하여 산출하였다. 교정성적서로부터 95%의 신뢰구간에서 교정불확도(k=2)는 0.
- 3) mTorr로 유지하였다. 최대 감도와 최적의 product ion 생성 조건을 찾기 위해 collision energy를 5-15 eV 범위까지 변화시켰고, 이때 분석물질의 precursor ion으로부터 생성된 특징 적인 product ion을 선정하여 각각을 하나의 쌍으로 모니터링 하였다. THC-COOH의 MRM transition pair 는 m/z 602 → m/z 474, m/z 602 → m/z 513이며 THCCOOH-d9는 m/z 611 → m/z 483이다.
- 측정이 이루어지는 동안 일정한 값을 유지하는 회수율에 의한 불확도 요인을 평가하기 위해 기존의 검정된 분석법으로 QC 시료를 측정하여 얻은 회수율을 이용하여 불확도를 산출하였다. 이때 검정곡선의 농도 범위는 0.
- 표준용액 희석에 사용된 부피플라스크에 의한 불확도 발생 요소는 부피플라스크 자체의 불확도, 온도에 의한 불확도의 두 가지 요소를 고려하였다. 부피플라스크 자체의 불확도는 교정성적서로부터 95%의 신뢰 구간에서 불확도(k=2)가 0.
대상 데이터
- 2 mL Safe-Lock tube는 독일 Eppendorf사에서 구입하였으며 직경 2.8 mm 스텐인리스 스틸 비드는 국내 대일베어링사에서 구입하였다. 직경 13 mm PTFE (polytetrafluoroethylene, 0.
- 농도별 표준용액 제조를 위해 독일 Brand사의 부피 플라스크(10 mL)와 독일 Eppendorf사의 피펫(pipette, 1000 µL)을 사용하였다.
- 시험에 사용한 모발시료는 2010년 7월 1개월 동안 수도권 소재 검찰청으로부터 감정 의뢰된 대마 남용 용의자의 모발을 연구용 시료로 사용하였다. 대조 모발 시료는 약물을 복용하지 않은 사람의 모발을 채취하여 사용하였다.
- 시료량 측정은 독일 Sartorius 사 전기식 지시저울(CP225D)을 사용하였다. 모발 세절과정에 사용한 분쇄기는 독일 Retsch사의 Qiagen TissueLyser II를 사용하였고 3개의 스테인리스 스틸비드(2.8 mm diameter)가 담긴 2 mL 튜브를 사용하여 세절하였다.
- 분석에 사용된 장비는 미국 Agilent Technologies사 6890N Gas Chromatograph (GC)에 미국 Waters사 Quattro micro GC tandem mass spectrometer가 연결된 GC-MS/ MS를 사용하였다. 분리관은 DB-5MS (25 m × 0.
- 0분으로 설정하였다. 시료는 미국 Agilent Technologies 사의 7683B 시료자동주입장치를 사용하여 분석 장비에 주입하였다.
- 시험에 사용한 모발시료는 2010년 7월 1개월 동안 수도권 소재 검찰청으로부터 감정 의뢰된 대마 남용 용의자의 모발을 연구용 시료로 사용하였다. 대조 모발 시료는 약물을 복용하지 않은 사람의 모발을 채취하여 사용하였다.
- Baker사에서 구입하였다. 유도체 시약인 penta-fluoropropionic anhydride (PFPA)와 pentafluoropropanol (PFPOH)는 벨기에 Acros Organics사에서 구입하였으며, pH 조절에 사용된 acetic acid는 일본 Wako사 제품이다. THC-COOH 표준용액은 methanol 로 순차적으로 희석하여 각각 10, 1, 0.
- 를 미국 Cerilliant사로부터 구입하였다. 전처리 과정에 사용된 용매는 HPLC-grade로 n-hexane, ethyl acetate, isopropyl alcohol 이며 미국 J. T. Baker사에서 구입하였다. 유도체 시약인 penta-fluoropropionic anhydride (PFPA)와 pentafluoropropanol (PFPOH)는 벨기에 Acros Organics사에서 구입하였으며, pH 조절에 사용된 acetic acid는 일본 Wako사 제품이다.
- 직경 13 mm PTFE (polytetrafluoroethylene, 0.2 µm pore size) 시린지 필터는 영국 Whatman사에서 구입하였다.
- 표준물질과 내부표준물질은 각각 1 mL 바이알에 1000 mg/L 농도로 제조된 THC-COOH와 100 mg/L 농도로 제조된 THC-COOH-d9를 미국 Cerilliant사로부터 구입하였다. 전처리 과정에 사용된 용매는 HPLC-grade로 n-hexane, ethyl acetate, isopropyl alcohol 이며 미국 J.
데이터처리
- 0 µg/ kg)의 표준용액을 1회 분석하여 작성하였다(Table3). 검정 곡선과 관련된 변수는 가로축 값의 불확도가 세로축 값의 불확도보다 작다는 가정을 전제 조건으로 하여 선형 최소제곱법으로 계산하였다. 그 결과 THCCOOH의 검정 곡선은 결정계수 0.
이론/모형
- 본 연구에서 불확도 평가는 측정불확도 표현 지침서(GUM, Guide to the expression of Uncertainty in Measurement)에 나타나있는 방법에 따라 수행하였으며, 검토된 불확도 요인은 질량 측정, 표준용액의 순도 및 제조, 정밀도, 회수율 및 검정 곡선의 비직선성이었다. 측정불확도 평가를 통하여 위의 5가지 요인 중 QC 시료의 정밀도가 가장 큰 영향을 미치는 요인임을 확인할 수 있었다.
- 농도별 표준용액 제조를 위해 독일 Brand사의 부피 플라스크(10 mL)와 독일 Eppendorf사의 피펫(pipette, 1000 µL)을 사용하였다. 시료량 측정은 독일 Sartorius 사 전기식 지시저울(CP225D)을 사용하였다. 모발 세절과정에 사용한 분쇄기는 독일 Retsch사의 Qiagen TissueLyser II를 사용하였고 3개의 스테인리스 스틸비드(2.
- 시험은 ‘모발 중 대마 성분 감식기법(SPO-DRUGQA-07, 2010)’에 정해진 표준시험방법에 따라 수행하였다.
- 질량분석기의 ion source의 온도는 200 ℃로 설정하였고 이온화 방식은 음이온 화학적 이온화 방식이었으며 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 사용 하여 정량하였다. MS/MS fragmentation을 위해 충돌 기체로 아르곤을 사용하였으며 충돌이 일어나는 collision cell 내의 압력을(3.
성능/효과
- 검정 곡선과 관련된 변수는 가로축 값의 불확도가 세로축 값의 불확도보다 작다는 가정을 전제 조건으로 하여 선형 최소제곱법으로 계산하였다. 그 결과 THCCOOH의 검정 곡선은 결정계수 0.9999, 기울기 0.4798, y-절편 0.0098의 값을 나타내었다. 실제 복용자의 모발시료로부터 각 성분의 검정 곡선에 적용하여 얻은 THC-COOH 농도는 0.
- 따라서 실제 대마 흡연자의 모발에서 THC-COOH의 농도 측정값을 95% 신뢰구간에서 불확도를 포함 하여 표기하면(0.47 ± 0.08) µg/kg (k = 2.1, 신뢰수준 약 95%)이었고 대마 대사체 농도 측정값에 대한 불확도는 17%였다.
- 부피플라스크 자체의 불확도는 교정성적서로부터 95%의 신뢰 구간에서 불확도(k=2)가 0.008 mL로 표준불확도 (ucert')는 0.004 mL을 알 수 있었다.
- 실험적 데이터에 의해 있을 수 있는 계통효과에 대한 불확도가 확인된 후에는 확률분포에 근거한 표준불확도로 나타내어야 한다. 측정 결과에 대한 기질 (matrix)의 영향 및 재현성은 기기분석시 고려해야 할 사항으로 동위원소가 치환된 내부표준물질을 사용한 내부표준법을 적용하여 측정한 일간 QC 시료의 정밀도 측정값으로부터 측정모델의 기질의 영향 및 재현성에 대한 불확도를 산정할 수 있다. 본 실험에서는 3개 농도 중 가장 정밀도의 표준편차가 큰 농도인 0.
- 본 연구에서 불확도 평가는 측정불확도 표현 지침서(GUM, Guide to the expression of Uncertainty in Measurement)에 나타나있는 방법에 따라 수행하였으며, 검토된 불확도 요인은 질량 측정, 표준용액의 순도 및 제조, 정밀도, 회수율 및 검정 곡선의 비직선성이었다. 측정불확도 평가를 통하여 위의 5가지 요인 중 QC 시료의 정밀도가 가장 큰 영향을 미치는 요인임을 확인할 수 있었다. 이는 기질로부터 함께 추출되는 방해물질의 영향이 일정 정도 작용을 할 뿐만 아니라 음이온 화학적 이온화 방식으로 분석물질을 이온화하는 경우 반응기체인 메탄가스에 의한 ion source의 오염에 의해 안정성이 저해되고 결과적으로 이러한 요인들에 의해 측정의 재현성에 상당한 영향을 미친 것으로 판단된다.
후속연구
- 측정결과에 대한 불확도는 약 95%의 신뢰수준에서의 포함인자를 적용하여 산출하였다.13-16 향후 본 연구의 측정불확도에 영향을 미치는 개별 요인들에 대한 평가 결과는 분석법의 개선 및 불확도 요인의 영향을 감소시키는 기초 자료로 활용할 예정이다.
- 이는 기질로부터 함께 추출되는 방해물질의 영향이 일정 정도 작용을 할 뿐만 아니라 음이온 화학적 이온화 방식으로 분석물질을 이온화하는 경우 반응기체인 메탄가스에 의한 ion source의 오염에 의해 안정성이 저해되고 결과적으로 이러한 요인들에 의해 측정의 재현성에 상당한 영향을 미친 것으로 판단된다. 향후 이러한 측정불확도 추정 및 평가 결과를 분석방법 개선에 반영하여 가장 큰 오차 요인의 영향을 감소시키는 방향으로 연구의 초점을 맞출 예정이다.
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