[논문]가스크로마토그라피/질량분석기에 의한 모발중 대마성분 분석

양원경; 한은영; 박용훈; 임미애; 정희선

가스크로마토그라피/질량분석기에 의한 모발중 대마성분 분석
Analysis of $\\triangle^9$-Tetrahydrocannabinol and 11-nor-9-carboxytetrahydrocannabinol in Hair by Gas Chromatography/Mass Spectrometry 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.48 no.3, 2004년, pp.207 - 212

양원경 (국립과학수사연구소 마약분석과) , 한은영 (국립과학수사연구소 마약분석) , 박용훈 (국립과학수사연구소 마약분석) , 임미애 (국립과학수사연구소 마약분석) , 정희선 (국립과학수사연구소 마약분석과)

Abstract ▼ AI-Helper

An analytic method was developed for the quantitation of $\Delta$$^{9}-$ tetrahydrocannabinol (THC) and 11-nor-9-carboxy THC (THC-COOH) in human hair. After hair samples were pulverized using Freezer Mill, deuterated internal standards were added and digested in 1 N NaOH at $100^{\circ}C$ water bath for 30 min. Digest solutions were extracted by 5 ml hexane：ethyl acetate (90：10) after acidification with acetic acid. The organic phase was evaporated under N 2 and derivatized by BSTFA (with 1% TMCS) at $85^{\circ}C$ for 45 min. The derivatized solution was separated on HP-5MS column ($30m{\times}0.25mm{\times}0.25mm$) and detected using EI-GC-MS with selective ion monitoring mode. The assay of calibration was ranged from 5 to 100 ng/50 mg hair ($r^2$＞0.99) for THC and THC-COOH. Within and between-run precision were calculated at 6, 30, 60 ng/50 mg hair with coefficients of variation less than 11%. Within and between run accuracies at the same concentrations were$\pm$14% and $\pm$30% of target for both analytes, respectively. Absolute and relative recovery at 10 and 100 ng were 60∼91％. The method was used to detect and quantify THC and THC-COOH in cannabis abuser's hairs (N = 16) and SRM (N=5, THC 1 ng/mg, NIST). We detected THC and THC-COOH in only one hair sample. In SRM, % accuracy was 93% (range 86∼103%) and precision (% CV) was 8.14. We began to set up a quantitative analysis of THC and THC-COOH using EI-GC-MS. Continuously, we need to modify and develop this method in order to apply for identification in cannanbis users' hair.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 모발 중 대마성분 분석에 관한 기초를 확립하고자 분말화한 모발중에서 THC와 THC-COOH의 검출방법을가스 크로마토 그라프/질량 분석기를 활용하여 확립하였고 , National Institute of Standards & Thechnology(NIST)로부터 구입한 대마성분 THC를 함유한 Standard reference material(SRM)과 소변에서 대마가 검출된 남용자 16명의 모발 시료에 이 방법을 적용하여 시험방법으로서 유효화하였다 .

제안 방법

모발 중 THC 및 생체 내 대사체인 THC-COOH의 분석 방법에 대하여 표준물질 5~ 100ng의 정량범위에서의 직선성(Linearity) 을 확인하고, 6, 30, 60 ng 농도에서 within run고]" between run assay의 정확도(Accuracy)와 정밀도(Precision), 회수율(Recovery), 검출한계 및 정량한계값(LOD : limit of detection, LOQ : limit of quantificationX 검증하여 유효성 평가를 실시하였고, 이 방법을 NIST의 SRM과 대마 남용자 16명의 모발에 적용하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
이 방법의 정확성과 정밀성을 평가하기 위해 within과 between-run assay 를 실시하였다. Quality control로서 6, 30 및 60 ng의 세 가지의 농도를 공시료인 모발에 첨가하여 사용하였고, withinrun assay(n=6)는 같은 날에 6회의 반복시험를 하여 정밀도 (Precision)는 % coefficients of variation(CV)로, 정확도(accuracy) 는 % bias((mean concentration-target concentration)/ (target concentration)x 100))로 계산하였다. 각각의 농도에 대하여 각각 5~6회의 반복시험을 5일 동안 실험하여 between-run (n=28~30) assay를 평가하였으며, 이에 대한 정밀도 및 정확도를 위의 식에 따라 결정하였다.
THC와 THC-COOH의 within과 between-run 정밀도는 6, 30, 60 ng /50 mg hail에서 coefficients of variation %로 계산하였다(I汕le Ⅲ). 각 농도 6, 30, 60 ng/50 mg hair(n=6) 에서 THC의 within run 정밀도는 3.
THC와 THC-COOH의 회수율은 절대회수율과 상대회수율, 두유형으로 구하였다. 추출효율과 관련된 상대회수율은 10 ng과 100 ng 두 농도에서 THC는 60-83%, THC-COOH는 69-91% 였다.
Quality control로서 6, 30 및 60 ng의 세 가지의 농도를 공시료인 모발에 첨가하여 사용하였고, withinrun assay(n=6)는 같은 날에 6회의 반복시험를 하여 정밀도 (Precision)는 % coefficients of variation(CV)로, 정확도(accuracy) 는 % bias((mean concentration-target concentration)/ (target concentration)x 100))로 계산하였다. 각각의 농도에 대하여 각각 5~6회의 반복시험을 5일 동안 실험하여 between-run (n=28~30) assay를 평가하였으며, 이에 대한 정밀도 및 정확도를 위의 식에 따라 결정하였다. 추출회수율은 두 가지의 농도 10ng 검출한계 (limit of detection, LOD)는 signal과 noise의 비가 3 :1 이상이고, 표준물질농도 25 ng calibrator의 목적 이온과 qualitified0] 온의 면적비율이 ±20% 범위 내에 크로마토그램과 머무름 시간이 같은 가장 낮은 농도로 정하였다. 추정되는 LOD의 농도 대개의 모발 중 대마성분을 분석할 경우 시료의 digestion 또는 알카리 가수분해하여 액상추출 후 유도체화하여 분석하고 있는 바, *4)본 실험에서는 이들의 방법을 다음과 같이 변형하였다(Fig. 2). 분말화한 모발시료 약 50 mg 정도를 취해 1N NaOH 약 1 m/을 넣고 30분 동안 95℃ 수욕상에서 가수분해하였다.
약물이 없는 것으로 확인된 공시료인 모발에 대조군과 검량곡선2로 사용할 농도를 알카리 가수분해전에 첨가하여 사용하였다. 또한 소변 중에서 THC와 THC-COOH가 검출된 남용자의 모발 16예와 National Institute of Standards & Thechnology(NIST MD, USA)로부터 구입한 모발 Standard Reference Material(SRM)을사용하여 본 연구에서 유효화한 방법을 적용하여 검토하였다.
Injector 온도는 250℃로 하였으며, 시료는 3B씩 splitless mode로 주입하였다. 모든 목적화합물과 내부표준물질은 selective ion monitoring(SIM)으로 분석하였다. 다음의 fragmentation ionse 확인시험에 사용한 목적이온과 qualitified ion이다( 밑줄 친 이온이 정량에 사용한 이온임).
모발 중 THC 및 THC-COOH의 분석방법을 유효화하기 위해공시료 모발에 6, 30, 60 ng의 표준물질을 첨가하여 quality controls. 조제하여 실험하였다.
지원자로부터 얻은 모발을 공시료로 사용하였다. 약물이 없는 것으로 확인된 공시료인 모발에 대조군과 검량곡선2로 사용할 농도를 알카리 가수분해전에 첨가하여 사용하였다. 또한 소변 중에서 THC와 THC-COOH가 검출된 남용자의 모발 16예와 National Institute of Standards & Thechnology(NIST MD, USA)로부터 구입한 모발 Standard Reference Material(SRM)을사용하여 본 연구에서 유효화한 방법을 적용하여 검토하였다.
조제하여 실험하였다. 우선 공시료 모발을 위에서 언급한 바와 같이 처리하여 목적물질과 내부표준물질의 검출에 간섭하는 물질이 있는가를 검토하였다. 공시료에 내부표준물질만 첨가한 시료와 내부표준물질 첨가없는 공시료를 확립된 방법으로 실험하여 내부표준물질과 모발 matrix에 의한 간섭물질이 없음을 확인하였다.
위와 같이 이 연구논문에서 모발을 분말화하고 알카리 가수분해, 용매추출한 뒤 유도체화하여 모발 중 대마성분 THC와 대사체 THC-COOH를 EI 모드의 GC/MS로 분석하는 방법을 유효화하였고, SRM과 대마 남용자의 모발에서 적용을 시도하였다. 모발 중 대마성분의 분석법의 한계를 고려할 때 THC 및 THC-COOH의 검출이나 정량한계의 개선, 고감도 분석기기로의 적용 '둥 이 실험법에 대한 지속적인 개발과 발전이 있어야 할 것으로 보인다.
이 SRM을 이용하여 확립한 방법을 적용하여 정확도에 대한 검토를 하였다. 이 SRM 모발을 서술한 방법에 따라 분말화하고 가수분해, 액상추출하고 유도체화하여 GC/MS로 정량하였다. 이 결과를 %CV와 % accuracy를 계산하였다(Table V).
이 SRM을 이용하여 확립한 방법을 적용하여 정확도에 대한 검토를 하였다. 이 SRM 모발을 서술한 방법에 따라 분말화하고 가수분해, 액상추출하고 유도체화하여 GC/MS로 정량하였다.
추출용매 hexane : ethylacetate(9 :1)을넣고 진탕 추출하였으며, 2500rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 취해 질소농축하였다. 잔사에 30 uZ acetonitril과 1% TMCS 가 포함된 BSTFA 20*을 넣고, 85℃에서 45분 동안 반응시킨 뒤 상온에서 냉각하여 3皿씩 GC/MS에 주입하여 분석하였다.
정량 및 정성 분석은 Agilent 6890 gas chromatograph와 Agilent 5973 mass selective detector로 실시하였다. GC는 splitless mode로 HP-5MS(30 m x 0.
각각의 농도에 대하여 각각 5~6회의 반복시험을 5일 동안 실험하여 between-run (n=28~30) assay를 평가하였으며, 이에 대한 정밀도 및 정확도를 위의 식에 따라 결정하였다. 추출회수율은 두 가지의 농도 10ng과 100 ng을 공시료에 첨가하고 내부표준물질을 실험전과 후에넣어 실험하여 절대회수율과 상대회수율로 비교하였다. 표준물질의 검량곡선은 분말화한 공시료 약 50 mg에 5, 10, 25, 50, 100 ng의 표준물질과 내부표준물질을 넣고 위에서 언급한 바와 같이 가수분해, 용매추출 및 유도체화하고 분석하여 작성하였으며, 각 5회 실험하여 검량곡선 범위를 정하였다. 이 방법의 정확성과 정밀성을 평가하기 위해 within과 between-run assay 를 실시하였다.

대상 데이터

NIST로부터 THC(1 ng/mg)이 함유된 모발 SRM을 구입하였다. 이 SRM을 이용하여 확립한 방법을 적용하여 정확도에 대한 검토를 하였다.
应-Tetrahydrocannabinol(THC), ll-nor-9-carboxy THC(THC-COOH), D3-THC 및 DyTHC-COOH는 Radian사 제품, 1% trimethylchlorosilane(TMCS)가 함유된 Bis(trimethylsilyl)tri-fluoroacetamide(BSTFA)는 Sigma사 제품을 사용하였다. 에칠아세테이트, 헥산, 아세토나이트릴 및 기타 유기용매는 모두 HPLC 급을 사용하였고, 기타 모든 화학약품은 분석용 시약을 사용하였다.
검량곡선에사용한 calibrators와 방법의 유효화에 사용한 quality controle다른 생산 lot number를 갖는 표준물질을 사용하였다. 검량곡선의 correlation coe伍cients는 THC와 THC-COOH 모두 r2은 0.
99 이상이었다. 내부표준물질은 중수소화된 유사물질을 사용하였다. 두화합물의 火절편과 기울기의 평균은 Table I과 같다.
방법의 유효화를 확립하기위해 마약과 대마를 남용한 적이 없는 지원자로부터 얻은 모발을 공시료로 사용하였다. 약물이 없는 것으로 확인된 공시료인 모발에 대조군과 검량곡선2로 사용할 농도를 알카리 가수분해전에 첨가하여 사용하였다.
소변에서 THC와 THC-COOH가 검출된 남용자 16명의 모발을 준비하였다. 모발시료는 50mg 이상을 취해 물과 메탄올로 두 번씩 세척하였다.

데이터처리

이 SRM 모발을 서술한 방법에 따라 분말화하고 가수분해, 액상추출하고 유도체화하여 GC/MS로 정량하였다. 이 결과를 %CV와 % accuracy를 계산하였다(Table V). SRM 중 THC는 0.

이론/모형

각 5회 실험하여 검량곡선 범위를 정하였다. 이 방법의 정확성과 정밀성을 평가하기 위해 within과 between-run assay 를 실시하였다. Quality control로서 6, 30 및 60 ng의 세 가지의 농도를 공시료인 모발에 첨가하여 사용하였고, withinrun assay(n=6)는 같은 날에 6회의 반복시험를 하여 정밀도 (Precision)는 % coefficients of variation(CV)로, 정확도(accuracy) 는 % bias((mean concentration-target concentration)/ (target concentration)x 100))로 계산하였다.

성능/효과

1. 공시료 모발에 첨가하여 5-100ng 범위로 r2이 0.99 이상인 검량곡선을 작성하였으며 , THC의 LOD 및 LOQ는 1.0, 5r也 50 mg hair, THC-COOH는 각각 2.5 및 5ng/50mg이었다. Between run assay의 정밀도는 THC오I THC-COOH 모두 6, 30, 60ng 농도에서 CV가 11% 미만이었다.
2. 미국 NIST에서 구입한 SRM 모발(THC In以mg)에서의 THC 검출은 정확도가 93%(범위 : 86-103%), 정밀도는 8.14% CV였다. 또한 대마 남용자 16명의 모발 시료 중 한 시료에서 THC(0.
6) 였다. Within-rune between run 정확도는 THC와 THC-COOH 두 목적화합물에 대한 목적농도의 bias는 각각 ±14%와 ±30%로 대마 대사체인 THC-COOH의 정확도는 THC에 비해 범위가 넓게 나타났다.
우선 공시료 모발을 위에서 언급한 바와 같이 처리하여 목적물질과 내부표준물질의 검출에 간섭하는 물질이 있는가를 검토하였다. 공시료에 내부표준물질만 첨가한 시료와 내부표준물질 첨가없는 공시료를 확립된 방법으로 실험하여 내부표준물질과 모발 matrix에 의한 간섭물질이 없음을 확인하였다.
8em;">결정하였다. 정량검출한계(limit of quantification, LOQ)는 LOD의 검출피크의 기준에 적합하며 , signal과 noise의 비가 10:1 이상 목적농도의 ±20% 범위 내에 있어아히■고, 이 또한 세 번의 반복시험 결과가 모두 적합한 경우 LOQ로 결정하였다.
구하였다. 추출효율과 관련된 상대회수율은 10 ng과 100 ng 두 농도에서 THC는 60-83%, THC-COOH는 69-91% 였다. 절대 회수율은 두 농도에서 THC가 77-88%, THC-COOH 는 82~84%였다(Eble II).

후속연구

시도하였다. 모발 중 대마성분의 분석법의 한계를 고려할 때 THC 및 THC-COOH의 검출이나 정량한계의 개선, 고감도 분석기기로의 적용 '둥 이 실험법에 대한 지속적인 개발과 발전이 있어야 할 것으로 보인다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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