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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 여러 가지 약리 효과와 풍부한 아미노산 등을 포함한 뽕잎을 용매별로 추출하여 각 추출물들의 항산화성을 측정하고, 항산화 효과를 나타내는 성분을 분리 동정하여 새로운 천연 항산화제로서의 가능성을 제시하고자 하였다.
- 본 연구에서는 에틸아세테이트와 부탄올 추출물에서 항산화물질을 분리하여 구조식을 밝혔으며, 전자공여능으로 항산화성을 검증하였다. 뽕잎의 메탄올 추출물을 분획한 각 용매층을 미리 전자공여능으로 항산화 물질을 screening한 결과, 에틸아세테이트층과 부탄올층에서 활성이 나타나 항산화 성분을 분리하였다.
제안 방법
- Fraction 2, 3, 4분획이 비슷한 TLC chromatogram 양상을 나타내어 합하여, Sephadex LH-20(only MeOH)에서 용출하여 2개의 subfraction을 얻었으며, 이중 subfr. 1을 CHCl3:MeOH=(9:1) 비율로 silica gel column chromatography를 실시하고, 다시 MeOH:Water=(1:1) 비율로 RP18 column chromatography를 실시하여 MO-EA 2를 분리하였다.
- Fig. 2와 3에서 보는 바와 같이 에틸아세테이트와 부탄올 분획을 silica gel column chromatography 및 sephadex LH-20을 사용한 molecular sieve column chromatography와 RP16 resin을 사용한 ion exchange chromatography 등을 반복 실시하여 화합물들을 단리하였다.
- Fraction 1을 MeOH:Water=(1:1～3:2) 비율로 RP18 column chromatography를 실시하였다.
- 각 분획 및 단일 성분 3 ㎎을 취해 메탄올로 25 ㎖로 정용한 후 각각의 농도를 480 ㎍/4 ㎖, 320 ㎍/4 ㎖, 160 ㎍/4 ㎖, 80 ㎍/4 ㎖, 40 ㎍/4 ㎖, 20 μg/4 ㎖, 10 ㎍/4 ㎖로 희석한 용액 4 ㎖와 메탄올로서 1.5×10－4M/㎖ 농도가 되게 한 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 1 ㎖씩을 vortex로 균일하게 혼합한 다음 실온에서 30분간 방치한 후 520 ㎚에서 optical density(O.D.)를 측정하였다.
- 뽕잎은 먼저 증류수로 2～3회 수세한 후 물기를 제거하고, 직사광선의 조사를 받지 않는 연구실 내에서 건조시키고, 또 건조된 뽕잎을 분쇄기(IKA All basic, IKA Korea Co., Ltd., Korea)에서 미세하게 분쇄하여 80 mesh의 체를 이용하여 추출용 시료로 하였다. 뽕잎가루는 polyethylene bag을 이용하여 냉장보관하면서 시료로 사용하였다.
- 에틸아세테이트 분획 3.4 g을 CHCl3:MeOH=(9:1～8:2) 비율의 gradient solvent system으로 Fig. 2와 같은 순서로 silica gel column chromatography를 실시하여 4개의 subfraction으로 분획하였다. 부탄올 분획 2.
대상 데이터
- Column chromatography용 silicagel은 Kieselgel 60(Art.7734 and 9385, Merck, Darmstadt, Germany)으로 70～230 and 230～400 mesh를 사용하였고, molecular sieve column chromatography용 packing material은 Sephadex LH-20(Pharmacia)을 사용하였다.
- 7552, Merck)를 사용하였으며, low pressure liquid chromatography(LPLC)용 column은 Lobar-A Lichroprep Si 60(Merck)column을 사용하였다. 발색시약으로는 10% H2SO4(in EtOH)와 anisaldehyde를 사용하였으며 UV로 254, 365 ㎚ detection을 병용하였다(Toshiko 등 1994).
- 본 실험에 사용한 추출용 시료 뽕잎은 수원 잠사곤충연구소에서 농약이 살포되지 않은 뽕잎을 직접 채취하여 사용하였다.
이론/모형
- DPPH assay는 Dietz 등(2005)의 실험방법을 참고하였다. 각 분획 및 단일 성분 3 ㎎을 취해 메탄올로 25 ㎖로 정용한 후 각각의 농도를 480 ㎍/4 ㎖, 320 ㎍/4 ㎖, 160 ㎍/4 ㎖, 80 ㎍/4 ㎖, 40 ㎍/4 ㎖, 20 μg/4 ㎖, 10 ㎍/4 ㎖로 희석한 용액 4 ㎖와 메탄올로서 1.
- 물층에 다시 클로로포름을 넣어 물층과 클로로포름층으로 분리하였으며 3회 반복하였다. 나머지 에틸아세테이트, 부탄올 층도 위와 같은 방법(Woo WS 1997)으로 하여 각각의 추출물을 얻었다.
성능/효과
- 13C-NMR spectrum data와 TLC를 이용한 산가수분해 실험에 의해서 배당체에 결합된 당질은 glucose와 rhamnose임을 확인하였다. 이상의 결과를기존 문헌data(Lee 등1994; Do 등 1991)에 비교하여 본 결과, MO-EA-2의 성분은 배당체인 acacetin-7-O-β-rutinoside 즉 linarin인 것으로 그 구조를 확인하였다.
- DPPH radical 소거 효과에 의한 항산화 활성 검색에서 부탄올층의 성분보다 에틸아세테이트층의 wogonin과 linarin 두 가지 성분이 강력한 항산화 작용을 나타내었다.
- 뽕잎의 메탄올 추출물을 분획한 각 용매층을 미리 전자공여능으로 항산화 물질을 screening한 결과, 에틸아세테이트층과 부탄올층에서 활성이 나타나 항산화 성분을 분리하였다. 그 결과, 에틸아세테이트층에서 두 가지, 부탄올층에서 1가지의 성분을 분리하였는데, 에틸아세테이트층 중의 성분은 wogonin과 linarin으로 구조를 결정하였으며, 부탄올층의 성분은 pectolinarin으로 그 구조를 결정하였다.
- 따라서 뽕잎의 기능성 식품첨가물로써의 가능성과 천연 항산화제로서의 가치가 매우 높게 나타났다
- 또한 Positive FAB-Mass spectrum에서 [M-O2]+의 peak가 m/z 606으로 확인되었고, TLC를 이용한 산가수분해 실험 결과, 배당체에 결합된 당질은 glucose와 rhamnose임을 확인하였다. 이상의 결과를 기존 문헌 data(Ishida 등 1987)와 비교하여 MO-BU-1은 배당체인 pectolinarigenin-7-O-β-rutinoside 즉 pectolinarin인 것으로 그 구조를 확인하였다.
- 본 실험의 결과를 종합하여 볼 때 추출물 중 에틸아세테이트 추출물에서 분리해낸 화합물이 부탄올 추출물에서 분리해낸 성분보다 강력한 항산화성을 나타내었다. 에틸아세테이트 추출물 중에서 분리해낸 성분은 flavonoid인 wogonin과 linarin이었고, 부탄올층의 성분은 pectolinarin이었다.
- 뽕나무 잎의 메탄올 추출물을 분획한 각 용매층을 미리 DPPH법으로 항산화 물질을 screening한 결과, 에틸아세테이트층과 부탄올층에서 활성을 보여준 항산화 성분을 분리 동정하였다.
- 본 연구에서는 에틸아세테이트와 부탄올 추출물에서 항산화물질을 분리하여 구조식을 밝혔으며, 전자공여능으로 항산화성을 검증하였다. 뽕잎의 메탄올 추출물을 분획한 각 용매층을 미리 전자공여능으로 항산화 물질을 screening한 결과, 에틸아세테이트층과 부탄올층에서 활성이 나타나 항산화 성분을 분리하였다. 그 결과, 에틸아세테이트층에서 두 가지, 부탄올층에서 1가지의 성분을 분리하였는데, 에틸아세테이트층 중의 성분은 wogonin과 linarin으로 구조를 결정하였으며, 부탄올층의 성분은 pectolinarin으로 그 구조를 결정하였다.
- 이 화합물의 1H-NMR spectrum data에 의하면 δ 3.93과 3.91에서 두 개의 methoxy peak가 관찰되었으며, δ 5.17와 δ 4.49에서 2 M의 당에 의한 anomeric proton peak가 나타났는데, 이중 δ 5.17은 coupling constant가 J=7.5Hz인 doublet peak로 당이 β결합을 하고 있음을 추정할 수 있었다.
- 또한 positive FAB-mass spectrum에서 [M]+의 peak가 m/z 284로 확인되었다. 이상의 결과, 뽕잎의 성분은 wogonin, wogonoside 등 여러 성분이 존재하는데, 기존 문헌 data(Takido 등 1975; Goudard 등 1978)와 비교하여 본 결과, MO-EA-1의 성분은 5,7-dihydroxy-8-methoxy-2-phenyl-4H-one 즉 wogonin인 것으로 그 구조가 확인되었으며, 구조식은 Fig. 4～6과 같다.
- 이상의 결과를 기존 문헌 data(Ishida 등 1987)와 비교하여 MO-BU-1은 배당체인 pectolinarigenin-7-O-β-rutinoside 즉 pectolinarin인 것으로 그 구조를 확인하였다.
- 이상의 결과를기존 문헌data(Lee 등1994; Do 등 1991)에 비교하여 본 결과, MO-EA-2의 성분은 배당체인 acacetin-7-O-β-rutinoside 즉 linarin인 것으로 그 구조를 확인하였다.
- 전자공여능 측정에 사용된 DPPH는 안정한 자유라디칼로서 그것의 비공유전자로 인해 517 ㎚ 부근에서 흡광도가 감소하며, 각 추출물에서 이러한 라디칼을 환원시키거나 상쇄시키는 능력이 크면 높은 항산화 활성 및 활성산소를 비롯한 다른 라디칼에 대하여 소거 활성을 기대할 수 있다(Kim 등 2010). 측정 결과, MO-BU-1 층의 성분보다 MO-EA-1, MO-EA-2 층의 두 가지 성분이 강력한 항산화 작용을 나타내었다. 뽕잎으로부터 분리된 3종의 플라보노이드 성분은 항산화 활성이 있는 것으로 나타났다.
후속연구
- 최근에는 뽕잎이 기능성 식품, 화장품, 의약품의 신소재로서 가능성을 인정받고 있다. 천연 식품 소재에 함유된 항산화 활성물질을 포함한 기능성 물질을 규명함으로써 보다 부가가치가 높은 식품 소재 및 식품으로 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
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