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문제 정의
- 대두 발효시 사용되는 균주가 관능적으로 우수하다고 해도 다른 균과 생육 속도에서 차이를 보이거나 최종 균수가 좋지 않은 경우 산업화에 문제가 될 수 있다. 따라서 대두를 원료로 발효가 가능하다고 판단되는 L. plantarum P23과 L. saki B2-16를 주발효균으로 하고, 된장에서 분리한 Nattokinase 보다 뛰어난 혈전용해효소를 생산하면서 안전성이 입증된 B. subtilis TP-6를 물성 강화균으로 하여 혼합 배양을 하고자 하 였다. 이에 대두 배지에 각각 1%(v/v) 수준으로 접종하여 배양하면서 생육 특성을 확인하였다(Fig.
- 본 연구에서는 한국 전통식품 유래 균들인 식물성 유산균을 대두에 혼합 배양한 대두 발효조성물에서 생산되는 생리활성물질의 기능과 유산균 음료로서 프로바이틱스의 기능 및 대두의 건강기능성 등의 상승적인 효능을 가진 유산균 음료를 개발하는 것을 목적으로, 대두의 전처리 기술 및 발효유산균 선정 등에 대하여 연구하였다.
가설 설정
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제안 방법
- Cellulase로 2시간 처리한 후 제조한 대두 배지에 L. lactis A164, L. lactis BH5, L. sakei B2-16, L. plantarum P23을 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 pH 및 불쾌취 발생 여부를 비교하였다. 그 결과, cellulase 처리에 의하여 불쾌취가 발생되지 않아 향미 개선 효과를 확인할 수 있었으며, pH 역시 유산균 음료에 적합한 pH 4.
- plantarum P23과 함께 발효음료 분리균인 Ent. faecium 및 김치에서 분리된 유산균 L.lactis L13을 이용하여 24시간 발효시킨 후 발효 특성을 비교하였다(Table 2).
- 관능검사는 훈련된 패널 15명을 대상으로 3회 반복하여 행한 후 차이 식별 능력이 우수한 10명을 선정하였다. 검사 시료로 균주별 혼합비를 달리하여 동일한 온도 및 시간을 기준으로 배양한 음료군을 사용하여 평가하였으며, 평가항목은 색(color), 풍미(flavor), 단맛(sweetness), 신맛(sourness), 고소함(sesameness), 부드러움(softness), 전반적인 기호도(overall quality)에 대한 특성으로 5에 가까울수록 큰 기호도를 나타내는 5점 척도법으로 평가하였다.
- 대두 발효 시 대두의 표피 성분에서 유래하는 불쾌취를 제거하기 위하여 cellulase를 이용하여 기질로 사용되는 대두의 성분을 일차적으로 분해하였다.
- 두유 배지에서 혼합 배양 시 유산균 발효에 의한 pH 저하로 생육 저해 유무를 확인하기 위하여, L. plantarum P23과 L. saki B2-16를 B. subtilis TP-6와 혼합 배양하면서 pH, 산도, 젖산균과 Bacillus 균의 생균수를 측정하여 Table 4에 나타내었다.
- 배지의 제조 공정에서 스크류식 분쇄기를 사용하여 비지를 제거할 경우 동일한 시간에 발효가 더 진행하게 될 것으로 예상되어 L. sakei B2-16과 L. plantarum P23은 비지 제거 효과도 함께 검토하였다. 산업체에서는 유산균 발효 음료의 pH를 일반적으로 pH 4.
- 습식미분쇄기와 일반 믹서기를 이용하여 분쇄한 대두의 입자 크기는 입도분석기(Laser diffraction particle size analyser, LS 13 320, Beckman coulter, USA)를 사용하여 입자의 크기별 분포를 분석하였다.
- subtilis TP-6를 물성 강화균으로 하여 혼합 배양을 하고자 하 였다. 이에 대두 배지에 각각 1%(v/v) 수준으로 접종하여 배양하면서 생육 특성을 확인하였다(Fig. 2). 발효 10시간 후에 균수는 최대값에 도달하였으며, L.
- 증숙된 두유의 발효가 가능한 균주를 선발하기 위하여 항균 펩타이드의 생산이 가능한 2종의 균주(Lactococcus lactics A164, BH5), GABA(γ-Aminobutyric acid) 생산균인 Lactobacillus sakei B2-16, 또한 내산성이 강한 유산균인 Lactobacillus plantarum P23을 이용하여 대두를 냉수에 24시간 정도 불린 후 조분쇄한 후 불린 물을 포함하여 대두 무게의 10배 되도록 물을 첨가하고 30분 이상 가열하였다.
- 효소 및 열에 의한 대두의 전처리만으로는 충분한 유산균 발효가 진행되기 어려워 추가적으로 첨가해 줄 배지의 탄소원을 탐색하였다. 기존 균주인 L.
- 효소 처리 배지는 가열이 끝난 대두 배지에 식품용 cellulase(Bioland, Korea)를 대두 고형분의 0.2%(w/v)를 첨가하여 반응 온도는 60℃에서 2시간 이상 처리 후 원하는 부원료를 첨가하여 80℃에서 15분간 살균하여 만들었다.
대상 데이터
- 5 부근으로 감소하여 cellulase에 의한 전처리 후 대두 발효 음료를 제조할 수 있음을 확인하였다(Table 1). 4가지 균주 중에서 향미가 우수한 L. sakei B2-16, L. plantarum P23을 1차적으로 발효를 위한 균주를 1차 선택하였다.
- plantarum P23, 발효 음료 분리균인 Ent. faecium, 김치에서 분리한 L. lactis L13 등 4종의 유산균을 사용하였으며, 비교할 탄소원으로는 가격이나 범용적인 측면에서 활용도가 높은 sucrose, glucose, lactose, 꿀을 2%(w/v) 첨가한 후 30℃에서 24시간 배양하여 pH를 Table 3에 나타내었다.
- 관능검사는 훈련된 패널 15명을 대상으로 3회 반복하여 행한 후 차이 식별 능력이 우수한 10명을 선정하였다. 검사 시료로 균주별 혼합비를 달리하여 동일한 온도 및 시간을 기준으로 배양한 음료군을 사용하여 평가하였으며, 평가항목은 색(color), 풍미(flavor), 단맛(sweetness), 신맛(sourness), 고소함(sesameness), 부드러움(softness), 전반적인 기호도(overall quality)에 대한 특성으로 5에 가까울수록 큰 기호도를 나타내는 5점 척도법으로 평가하였다.
- 대두 배지의 발효는 플라스크 및 발효조를 사용하였다. 플라스크 배양은 250 ㎖ 삼각 플라스크에 100 ㎖ 배지를 넣고, 균주의 전 배양액 1%(v/v)를 접종한 후, 30℃ incubator에서 48～60시간 동안 배양하였다.
- 본 연구에서는 국내의 김치 및 된장으로부터 분리한 Lactobacillus lactis A164, Lactobacillus lactis BH5, Lactobacillus sakei B2-16, Lactobacillus plantarum P-23, Lactobacillus lactis L13, 발효 음료 분리균인 Enterococcus faecium, 그리고 된장에서 분리한 Bacillus subtilis TP-6를 사용하였다.
- 실험에 사용한 대두 배지는 수세한 국산 대두(농협)에 대두 중량 대비 4배의 물을 가하여 100℃의 끓는 물에서 7분간 가열한 다음 상등액을 제거하고, 스크류식 습식미분쇄기(Super Masscolloider, ZA10-15J, Koen, Korea)와 일반 믹서기를 사용하여 미분쇄하였다. 분쇄 후 수분 조절이 끝난 대두 분쇄물은 1차로 가열하여 대두의 조직을 연화시켜 효소 처리 또는 발효 시 기질로 사용하였다.
- 유산균은 Lactobacilli MRS broth(Difco, USA), Bacillus균은 modified nutrient 배지(5 g tryptone, 5 g beef extract, 20 g xylose per liter, pH 7.0)를 이용하였다.
데이터처리
- 모든 연속형 변수의 평균과 표준편차(Mean±S.D.)를 구하였으며, Duncan's multiple range test를 이용 일원배치 분산분석을 통해 p<0.05의 수준에 서 시료간의 유의차 검정을 실시하였다.
- 본 연구에서 얻어진 자료 분석은 SPSS(12.01 for windows) program을 이용하여 통계분석을 시행하였다. 모든 연속형 변수의 평균과 표준편차(Mean±S.
성능/효과
- 4종의 유산균 모두 실험에 사용된 탄소원을 이용하였으나, glucose와 lactose를 사용한 경우에는 기호도가 좋지 않았으며, 모든 실험군에서 pH가 너무 감소하여 산미가 강했다.
- plantarum P23을 접종하고 30℃에서 24시간 배양한 후 pH 및 불쾌취 발생 여부를 비교하였다. 그 결과, cellulase 처리에 의하여 불쾌취가 발생되지 않아 향미 개선 효과를 확인할 수 있었으며, pH 역시 유산균 음료에 적합한 pH 4.5 부근으로 감소하여 cellulase에 의한 전처리 후 대두 발효 음료를 제조할 수 있음을 확인하였다(Table 1). 4가지 균주 중에서 향미가 우수한 L.
- 4). 그러나 L. sakei B2-16, L. plantarum P23, B. subtilis TP6를 1 : 0.7 : 0.3으로 발효한 경우에는 발효 두유의 맛과 향에는 큰 차이를 보이지 않는 관능평가 결과를 얻을 수 있었으며, 발효 최종 균수 등의 차이도 보이지 않았다. 또한 발효 8시간 내외에서 pH는 4.
- 일반적으로 대두 입자 크기가 작을수록 다른 원료와 혼합하여 제품을 만들 때 고르게 분산되어 발효가 효율적으로 진행되고, 색, 맛, 향 등의 특성 및 발효조성물의 물성과 기능성 물질의 용출 효율을 증진시킬 수 있다. 따라서 대두를 일반 믹서분쇄와 습식미세분쇄로 처리한 입자 크기를 분석한 결과(Fig. 1), 대두의 일반분쇄의 평균 입자 크기는 206 ㎛로 미세분쇄의 20～26 ㎛보다 약 8～10배 정도 컸다. 또한 습식분쇄에 사용한 압력이 증가되면 입자 크기가 약간 감소하였다.
- 발효 10시간 후에 균수는 최대값에 도달하였으며, L. plantarum P-23의 경우 1.87×10 9 cfu/㎖의 생균수로, L. saki B2-16과 B. subtilis TP-6에 비해 10배와 100배의 높은 값을 보였다.
- subtilis TP-6에 비해 10배와 100배의 높은 값을 보였다. 발효 시간이 경과함에 따라 발효액의 pH는 서서히 감소하는 경향을 보였으며, 특히 L. plantarum P-23의 경우에는 10시간 배양 후에 pH 4.1로 감소하여 발효 두유에 적합하였으며, 24시간 발효 후 pH 3.77까지 낮아져 강한 신맛을 보였다. 산도의 경우 배양 10시간 후 가장 높았으며, 이후에는 산도가 감소하는 경향을 보였다.
- 5 부근이 생균수와 산미 관점에서 가장 적합한 조건으로 결정하고 있다. 발효 음료에서 분리한 Ent.faecium는 배양온도 37℃에서 pH 4.5 이하 범위로 발효되었고, 발효 후 사과향이 나는 장점을 확인하였다. L.
- 산업적인 열처리를 위하여 기존의 대두 증숙 과정에 소요되는 에너지를 줄이고, scale-up시 적합한 process를 개발하기 위하여 대두 침지 없이 수세한 대두를 100℃ 끓는 물에 7분간 침지한 결과, 에너지 감소와 콩 비린내 제거, 침지에 의한 영양성분 손실을 최소화한 것으로 나타났다.
- 증숙된 두유의 발효가 가능한 균주를 선발하기 위하여 항균 펩타이드의 생산이 가능한 2종의 균주(Lactococcus lactics A164, BH5), GABA(γ-Aminobutyric acid) 생산균인 Lactobacillus sakei B2-16, 또한 내산성이 강한 유산균인 Lactobacillus plantarum P23을 이용하여 대두를 냉수에 24시간 정도 불린 후 조분쇄한 후 불린 물을 포함하여 대두 무게의 10배 되도록 물을 첨가하고 30분 이상 가열하였다. 여과포를 이용하여 비지를 제거한 후 Lactobacilli MRS broth에서 배양된 각 유산균을 접종한 후 30℃에서 24시간 정치 배양하면 모든 유산균이 두유에서 생육하는 특징을 나타내었으나, 대두 특유의 비린내와 어느 정도의 불쾌취를 나타내었다. 따라서 발효 후 생성되는 대두 발효취와 불쾌취 제거를 위한 전처리 공정이 요구되었다.
- 최종 발효 제품의 풍미는 접종균의 비율에 따라 많이 좌우되었는데, L. saki B2-16은 부드러운 물성과 단맛을 내고, L. plantarum P23의 경우는 상쾌한 신맛, B. subtilis TP6의 경우는 부드러운 물성을 부여하는 특징이 있어 2종의 유산균과 1종의 Bacillus 균의 접종비를 달리하여 두유 배지에서 37℃ 10시간 배양한 후 생균수를 분석한 결과, 전반적으로 B. subtilis TP6의 생균수가 유산균에 비하여 낮았다(Table 5). 특히, L.
- subtilis TP6의 생균수가 유산균에 비하여 낮았다(Table 5). 특히, L. sakei B2-16, L. plantarum P-23, B. subtilis TP6의 접종비를 1 : 0.5 : 0.7으로 하여 접종하였을 때, 균의 생육은 다른 접종비에 비하여 현저히 낮았으며, 관능평가를 수행하여 그 맛과 향을 평가한 경우에도 다른 접종비에 비하여 낮은 결과를 얻었다(Fig. 4). 그러나 L.
- 혼합 배양 10시간 후의 Bacillus 균수는 1.03×109과 1.60× 109 cfu/㎖로 단독 배양시의 1.60×107 cfu/㎖ 보다 높은 값을 보여, 발효에 의해 생기는 pH 저하 현상으로 인한 TP6의 생육 저해는 보이지 않았다.
후속연구
- lactisL13 균주의 경우 산미가 너무 강하여 발효에 부적합한 물성을 나타내었다. 그러나 대두 발효에 사용할 균주는 단일 균주보다는 혼합 균주를 이용하는 것이 효과적이므로 배양 실험이 추가적으로 필요할 것으로 판단되었다.
- 이러한 결과는 선택된 2종의 유산균 및 1종의 Bacillus 균을 이용하여 산업적으로 다양한 제품의 발효 두유를 생산할 수 있는 가이드를 제시할 수 있다고 판단되어진다.
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