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문제 정의
- pinnata의 경우에는 완전한 유식물체를 체세포조직에서 발생시킨다는 독특한 특징을 보인다. 본 연구에서는 이러한 K. pinnata의 독특한 무성영양번식과 관련한 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 각 시기별 유전자 발현양의 변화를 검출할 수 있는 DEG PCR 방법을 이용하여 유전자의 검색을 시도하였다. 검출된 DEG 중 많은 경우에 있어서 기존 database와 유의성을 갖지 못하였으나, 알려진 기능의 분석을 토대로 발현된 유전자간의 상호신호전달 네트워크를 예상해 보았을 때 검색된 유전자의 대부분이 cell division과 관련된 신호전달 체계에 위치하고 있음을 확인 할 수 있었다.
- 이것은 염기서열에서는 유의성을 보이지 않으나 단백질 서열로 번역하였을 때 확인되는 단백질 아미노산 서열이 유의성을 보인다는 것으로서 12개의 clone에서 이와 같은 결과가 도출되었다. 유의성 분석으로 선발된 유전자는 신호체계에서의 위치를 파악할 수 있는 선행 논문을 기초로 분석되었다.
- 이 논문에서는 K. pinnata의 잎 가장자리에서 나타나는 무성영양번식의 한 방법인 소식물체의 발생에 관련한 유전자를 탐색하고, 탐색된 유전자들에서 중요성 있는 유전자를 선발하여, 상호간의 신호 전달 체계에 대한 가능성을 논의하였다.
- 식물호르몬인 cytokinin은 세포분열과 발생에 관여하며, 특히 분열조직의 발생이나 액아생성 개시에 결정적인 호르몬으로 작용한다[20]. 이에 따라 초기단계에서 유도 혹은 높은 발현율을 갖는 유전자와 cytokinin과의 연관성을 검색하였다. Cytochrome p450과 유의성을 갖는 12번, 42번 Clone은 비유도성단계와 말기단계에서 발현을 보였다.
제안 방법
- 총 20 μl의 반응액에 4 μl의 희석한 first-strand cDNA을 주형으로 하고, 1 μl의 dT-ACP2 (5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATXXXXX(T)15-3')와 2 μl의 arbitrary ACP를 첨가하고 10 μl의 2× SeeAmp™ ACP™master mix를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다. 94℃로 예열된 PCR 기계(PTC-0200, MJ research Co., Germany)에 반응용액을 넣고 94℃에서 5분, 50℃에서 3분, 72℃에서 1분간 반응한 뒤, 94℃에서 40초, 65℃에서 40초, 72℃에서 40초 반응을 40회 반복한 후 72℃에서 5분간 최종 반응시켜 PCR을 종료하였다. 증폭된 PCR 결과물을 2% agarose gel에 전기 영동하여 각 primer에 따라 band의 상이한 패턴을 확인하였다.
- Budding의 초기단계에서 이상의 3가지 DEG clone들이 cytokinin의 down-regulation을 받는 것으로 예상된다. Budding의 과정에서 cytokinin의 축적을 확인하기 위하여 소식물체의 발생에 따라 축적되는 anthocyanin을 측정하였다. 발생 단계에 따른 anthocyanin의 축적은 cytokinin에 의해 조절된다[11].
- DEG PCR 결과물의 전기영동을 통하여 서로 다른 발현 양상이 확인된 band를 HiYield™ Gel / PCR DNA Extraction Kit (Real Biotech Co., Taiwan)를 이용하여 분리하여 pGEM-Teasy Vector (Promega Co., USA)에 클로닝하여 보관하였다.
- Differential expressed gene (DEG) 검출 실험을 수행하기 위하여 budding이 되지 않은 K. pinnata와 소식물체가 발생한 K. pinnata에서 총 RNA를 분리하여 실험을 시행하였다. 엽육식물종인 K.
- Differentially expressed genes을 검출하기 위하여 GeneFishing™ DEG Kit의 ACP-based PCR을 수행하였다.
- PCR 결과물과 ligation된 pGEM-T easy Vector를 E. Coli DH5α 형질 전환하여 형질 전환체를 선발하고 plasmid를 추출하여 염기서열 분석을 의뢰하였다.
- Viviparous 소식물체의 형성에 관련한 유전자의 분석을 위하여 K. pinnata를 독립된 화분에 심어 온도 38~40℃와 습도 70% 이상의 배양 조건에서 공기 순환을 통하여 신선한 공기가 지속적으로 유입 될 수 있도록 한 배양실에서 재배하였다. 광주기는 광 조건 16시간, 암 조건 8시간으로 설정하였으며, 명배양과 암 배양 간의 온도편차를 최소화하여 재배하였다.
- 각 단계에서 추출한총 RNA 3 μg을 사용하여 20 μl의 반응 최종 반응액에 2 mM dNTPs 5 μl, 5× reaction buffer 4 μl, Moloney murin leukemia virus reverse transcriptase (MMLV-RTase, Takara-bio Inc., Japan) 1 μl와 Kit에서 제공되는 dT-ACP (Deoxythymidine-Annealing Control Primer) 1 primer (5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATXXXXX(T)18-3') 2 μl를 첨가하여 42℃에서 90분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- 검출된 DEG의 확인을 위하여 분석된 유전자 염기서열을 기준으로 PCR 결과물의 크기가 150~200 bp 사이가 될 수 있도록 PCR primer를 작성하였다(Table 3). 반응 혼합물 총 20 μl에 10 μl의 SYBR Premix Ex Taq™(Takara-bio Inc.
- pinnata를 독립된 화분에 심어 온도 38~40℃와 습도 70% 이상의 배양 조건에서 공기 순환을 통하여 신선한 공기가 지속적으로 유입 될 수 있도록 한 배양실에서 재배하였다. 광주기는 광 조건 16시간, 암 조건 8시간으로 설정하였으며, 명배양과 암 배양 간의 온도편차를 최소화하여 재배하였다. 배양실에서 재배한 K.
- 기능이 알려져 있는 유전자인 NAC-domain 단백질, Cytochrome p450, Metallothionein, rpL2, rpL32유전자를 대표적으로 선발하여, 모체 식물의 crenate margin 부위에서 발생하는 소식물체의 발생단계에 따라 각각의 유전자의 발현 양상의 변화를 quantitative real-time PCR을 이용하여 분석하였다. 18S ribosomal RNA를 기준으로 delta-delta CT 분석법으로 각 유전자의 발현양을 분석한 결과 Fig.
- 유전자 염기서열을 바탕으로 BlastN program을 이용한 분석에서 유전자 서열 database와 유의성을 보이는 clone은 23개였으며 나머지 43개의 clone의 염기서열은 유의성을 보이는 정보를 얻지 못하였다. 동일한 DEG 염기서열을 BlastX program을 통해 번역된 염기서열과 단백질 database와의 유의성 검색하였다. 이 결과에서는 nucleotide database 검색과는 달리 총 35개의 유의성 있는 clone이 선발되었다.
- 반응 혼합물 총 20 μl에 10 μl의 SYBR Premix Ex Taq™(Takara-bio Inc., Japan)과 제작한 10 uM Real-time PCR용 primer를 forward와 reverse를 0.4 μl씩 첨가하고 각각 sample의 cDNA를 0.2 μg을 주형으로 하여 Rotor-Gene™ 3000 real-time PCR 기계(Corbett Life Science Co., Australia)를 사용하여 real-time PCR을 수행하고 결과를 Roter-Gene™ (v6.034) software를 이용하여 Delta-Delta-CT 방법으로 분석하였다[10].
- 발생단계 별로 채취 된 조직에서 분리된 RNA를 사용하여서 발생 단계에 따라 발현 차이를 보이는 유전자를 확인하기 위하여 GeneFishing™ DEG Premix Kit (Seegene Co., Korea)를 사용하였다.
- 광주기는 광 조건 16시간, 암 조건 8시간으로 설정하였으며, 명배양과 암 배양 간의 온도편차를 최소화하여 재배하였다. 배양실에서 재배한 K. pinnata의 성숙한 잎에서 소식물체의 발생이 이루어지지 않은 잎 가장자리, 발생 초기 단계의 잎 가장자리와 소식물체의 발생이 완료되어 viviparous 소식물체가 탈리 된 후의 잎 가장자리를 채취하였다. 조직의 특이성을 확보하기 위하여 잎 조직의 채취는 목표한 잎 가장자리를 포함하여 최소한의 범위로 가로세로 2 mm 정도의 정방형으로 조직을 잘라 곧바로 액체 질소에 얼려, 실험에 사용할 때까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
- 2A). 선발된 DEG 후보 군의 염기서열을 확보하였다(Table 1). 유전자 염기서열을 바탕으로 BlastN program을 이용한 분석에서 유전자 서열 database와 유의성을 보이는 clone은 23개였으며 나머지 43개의 clone의 염기서열은 유의성을 보이는 정보를 얻지 못하였다.
- pinnata에서 총 RNA를 분리하여 실험을 시행하였다. 엽육식물종인 K. pinnata에서 RNA의 순수분리를 위하여 본 실험에서는 guanidinium hydrochloride와 PEG를 이용한 총 RNA추출 방법을 적용하였다[17]. 발생단계 별로 채취 된 조직에서 분리된 RNA를 사용하여서 발생 단계에 따라 발현 차이를 보이는 유전자를 확인하기 위하여 GeneFishing™ DEG Premix Kit (Seegene Co.
- pinnata의 성숙한 잎에서 소식물체의 발생이 이루어지지 않은 잎 가장자리, 발생 초기 단계의 잎 가장자리와 소식물체의 발생이 완료되어 viviparous 소식물체가 탈리 된 후의 잎 가장자리를 채취하였다. 조직의 특이성을 확보하기 위하여 잎 조직의 채취는 목표한 잎 가장자리를 포함하여 최소한의 범위로 가로세로 2 mm 정도의 정방형으로 조직을 잘라 곧바로 액체 질소에 얼려, 실험에 사용할 때까지 -80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
- , Germany)에 반응용액을 넣고 94℃에서 5분, 50℃에서 3분, 72℃에서 1분간 반응한 뒤, 94℃에서 40초, 65℃에서 40초, 72℃에서 40초 반응을 40회 반복한 후 72℃에서 5분간 최종 반응시켜 PCR을 종료하였다. 증폭된 PCR 결과물을 2% agarose gel에 전기 영동하여 각 primer에 따라 band의 상이한 패턴을 확인하였다.
- 총 20 μl의 반응액에 4 μl의 희석한 first-strand cDNA을 주형으로 하고, 1 μl의 dT-ACP2 (5'-CTGTGAATGCTGCGACTACGATXXXXX(T)15-3')와 2 μl의 arbitrary ACP를 첨가하고 10 μl의 2× SeeAmp™ ACP™master mix를 첨가하여 PCR 반응을 수행하였다.
대상 데이터
- 동일한 DEG 염기서열을 BlastX program을 통해 번역된 염기서열과 단백질 database와의 유의성 검색하였다. 이 결과에서는 nucleotide database 검색과는 달리 총 35개의 유의성 있는 clone이 선발되었다. 이것은 염기서열에서는 유의성을 보이지 않으나 단백질 서열로 번역하였을 때 확인되는 단백질 아미노산 서열이 유의성을 보인다는 것으로서 12개의 clone에서 이와 같은 결과가 도출되었다.
- 총 120 조합의 ACP primer를 이용한 DEG PCR을 통하여 채취 조직에 따라 서로 다른 유전자 발현 양상을 보이는 66개의 DEG 후보 군을 확인하였다(대표 예, Fig. 2A). 선발된 DEG 후보 군의 염기서열을 확보하였다(Table 1).
데이터처리
- Coli DH5α 형질 전환하여 형질 전환체를 선발하고 plasmid를 추출하여 염기서열 분석을 의뢰하였다. 분석된 염기서열을 바탕으로 National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) 중 nucleotide blast (BlastN)와 blastX program을 이용하여 algorithm analysis를 시행하였다.
성능/효과
- Blastn과 blastx의 database 검색 결과 중 최대 검색 점수가 전체 nucleotide sequence의 60% 미만이거나 e-value가 1e-05 이상의 값을 가지는 결과는 알려지지 않은 sequence로 분류하였으며, search 결과 중 식물에 관련한 유전자가 검색되지 않을 경우도 알려지지 않은 sequence로 표기하였다. 14개의 clone에서 blastX와 blastN 검색에서 상이한 결과를 나타냈으며, blastX의 검색을 기준으로 DEG 유전자의 기능을 예상하였다. Table 2에서는 검색된 DEG 유전자의 식물 발생 혹은 cell cycle에 관련한 기능을 표기하였다.
- 기능이 알려져 있는 유전자인 NAC-domain 단백질, Cytochrome p450, Metallothionein, rpL2, rpL32유전자를 대표적으로 선발하여, 모체 식물의 crenate margin 부위에서 발생하는 소식물체의 발생단계에 따라 각각의 유전자의 발현 양상의 변화를 quantitative real-time PCR을 이용하여 분석하였다. 18S ribosomal RNA를 기준으로 delta-delta CT 분석법으로 각 유전자의 발현양을 분석한 결과 Fig. 2B에 나타난 바와 같이 소식물체가 발생하지 않은 비유도성 단계의 조직을 기준으로 발생의 초기 단계에 높은 수준으로 발현 양이 증가함을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 유전자를 cloning할 때 사용한 DEG의 결과와 동일하거나 유사하였다.
- Kalanchoe pinnata에서도 budding의 단계가 진행될수록 anthocyanin이 축적되는 양상을 확인하였고, 이러한 결과를 통해 간접적으로 소식물체 발생의 초기단계부터 cytokinin이 관여함을 예상할 수 있었다. Anthocyanin의 축적은 cytokinin외에 ethylene에 의해 유도되기도 하는데[40], 본 실험에서 20번 DEG clone은 ethylene의 생합성에 결정적 효소인 ACC Oxidase와 유의성을 가지며 budding 전 단계에 걸쳐 발현되고 특히 후기 발생 단계에서 높은 발현을 보였다. Budding의 단계에서 K.
- DEG PCR을 통하여 총 67개의 budding 단계에 따라 다른 발현 양상을 보이는 유전자를 검출하였고(Table 2) NCBI database와 유사성 검색 결과 38개의 유의성 있는 유전자를 검출할 수 있었다(Table 3). Blastn과 blastx의 database 검색 결과 중 최대 검색 점수가 전체 nucleotide sequence의 60% 미만이거나 e-value가 1e-05 이상의 값을 가지는 결과는 알려지지 않은 sequence로 분류하였으며, search 결과 중 식물에 관련한 유전자가 검색되지 않을 경우도 알려지지 않은 sequence로 표기하였다. 14개의 clone에서 blastX와 blastN 검색에서 상이한 결과를 나타냈으며, blastX의 검색을 기준으로 DEG 유전자의 기능을 예상하였다.
- DEG PCR을 통하여 총 67개의 budding 단계에 따라 다른 발현 양상을 보이는 유전자를 검출하였고(Table 2) NCBI database와 유사성 검색 결과 38개의 유의성 있는 유전자를 검출할 수 있었다(Table 3). Blastn과 blastx의 database 검색 결과 중 최대 검색 점수가 전체 nucleotide sequence의 60% 미만이거나 e-value가 1e-05 이상의 값을 가지는 결과는 알려지지 않은 sequence로 분류하였으며, search 결과 중 식물에 관련한 유전자가 검색되지 않을 경우도 알려지지 않은 sequence로 표기하였다.
- Kalanchoe pinnata에서도 budding의 단계가 진행될수록 anthocyanin이 축적되는 양상을 확인하였고, 이러한 결과를 통해 간접적으로 소식물체 발생의 초기단계부터 cytokinin이 관여함을 예상할 수 있었다. Anthocyanin의 축적은 cytokinin외에 ethylene에 의해 유도되기도 하는데[40], 본 실험에서 20번 DEG clone은 ethylene의 생합성에 결정적 효소인 ACC Oxidase와 유의성을 가지며 budding 전 단계에 걸쳐 발현되고 특히 후기 발생 단계에서 높은 발현을 보였다.
- 이러한 발현의 양상은 cytochrom p450에서도 확인되었다. Metallothionein와 rpL32의 경우, 소식물체의 발생 초기에 높아진 유전자의 발현이 이후 꾸준히 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 특이 할만한 것은 rpL2의 경우는 소식물체의 발생 초기단계에는 그 발현 양이 증가되는 것으로 확인되었으나, 이후 소식물체의 발생이 완료된 성숙 단계에서는 오히려 발현 양이 비유도성 단계보다 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
- pinnata의 독특한 무성영양번식과 관련한 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 각 시기별 유전자 발현양의 변화를 검출할 수 있는 DEG PCR 방법을 이용하여 유전자의 검색을 시도하였다. 검출된 DEG 중 많은 경우에 있어서 기존 database와 유의성을 갖지 못하였으나, 알려진 기능의 분석을 토대로 발현된 유전자간의 상호신호전달 네트워크를 예상해 보았을 때 검색된 유전자의 대부분이 cell division과 관련된 신호전달 체계에 위치하고 있음을 확인 할 수 있었다. 그 중 NAC-domain protein의 경우 세포 분화에 관련된 유전자로서 활성이 알려져 있고, 체세포에서의 발현양은 미미하다고 보고가 되어 있으나, K.
- 관찰된 잎의 가장자리는 budding이 준비되는 단계에 따라 왕성한 체세포분열의 양상을 보이며, 이후 세포의 분열이 집중되는 유사분열조직(meristemoid)의 형태로 분화되는 것을 확인하였다(Fig. 1B). 이후 유사분열조직의 왕성한 세포분열을 통하여 budding이 일어나 발생단계인 heart stage의 embryo 형태의 소식물체를 관찰할 수 있었다.
- 검출된 DEG 중 많은 경우에 있어서 기존 database와 유의성을 갖지 못하였으나, 알려진 기능의 분석을 토대로 발현된 유전자간의 상호신호전달 네트워크를 예상해 보았을 때 검색된 유전자의 대부분이 cell division과 관련된 신호전달 체계에 위치하고 있음을 확인 할 수 있었다. 그 중 NAC-domain protein의 경우 세포 분화에 관련된 유전자로서 활성이 알려져 있고, 체세포에서의 발현양은 미미하다고 보고가 되어 있으나, K. pinnata의 유사분열조직에서 높은 수준으로 발현이 향상됨을 확인할 수 있었다. 이와 같이 분열조직과 달리 체세포조직에서의 발현이 높지 않은 유전자들이 유식물체의 발생 단계에 따라 그 발현양의 변화를 보임을 확인 할 수 있었으며, 이를 통해 K.
- Monophasic type의 발생 형태에서 bud 분화과정은 primordia에서 소식물체로 발생하는 초기 단계로부터 지속적으로 발생이 진행되는 형태이며, biphasic type의 발생 형태에서 bud 분화과정은 첫 번째 단계로 생리적으로는 휴면 상태를 유지하지만 형태적으로는 완전한 외형을 갖춘 bud를 primordia에서 발생시키고 이후에 두 번째 단계로 잎의 분리에 의하여 완전 성숙이 일어나 소식물체를 발생시킨다. 더불어 두 번째 유형에 속하는 Kalanchoe의 소식물체 발생은 epiphyllous bud의 발생이 잎의 분리에 의한 신호와 동시에 잎의 성숙에 관련한 신호가 작용한다. 따라서 이러한 발생은 잎의 성숙 및 탈리와 관련한 일련의 두 가지 신호에 의하여 개시된다고 할 수 있다[39].
- 선발된 DEG 후보 군의 염기서열을 확보하였다(Table 1). 유전자 염기서열을 바탕으로 BlastN program을 이용한 분석에서 유전자 서열 database와 유의성을 보이는 clone은 23개였으며 나머지 43개의 clone의 염기서열은 유의성을 보이는 정보를 얻지 못하였다. 동일한 DEG 염기서열을 BlastX program을 통해 번역된 염기서열과 단백질 database와의 유의성 검색하였다.
- pinnata의 유사분열조직에서 높은 수준으로 발현이 향상됨을 확인할 수 있었다. 이와 같이 분열조직과 달리 체세포조직에서의 발현이 높지 않은 유전자들이 유식물체의 발생 단계에 따라 그 발현양의 변화를 보임을 확인 할 수 있었으며, 이를 통해 K. pinnata 잎의 톱니형 가장자리부분이 새로운 형태의 유사분열조직(meristemoid)으로 특징지어질 수 있음을 시사한다. 본 연구를 통하여 K.
- 1B). 이후 유사분열조직의 왕성한 세포분열을 통하여 budding이 일어나 발생단계인 heart stage의 embryo 형태의 소식물체를 관찰할 수 있었다.
- Metallothionein와 rpL32의 경우, 소식물체의 발생 초기에 높아진 유전자의 발현이 이후 꾸준히 유지되고 있음을 확인할 수 있었다. 특이 할만한 것은 rpL2의 경우는 소식물체의 발생 초기단계에는 그 발현 양이 증가되는 것으로 확인되었으나, 이후 소식물체의 발생이 완료된 성숙 단계에서는 오히려 발현 양이 비유도성 단계보다 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
- 이러한 결과는 유전자를 cloning할 때 사용한 DEG의 결과와 동일하거나 유사하였다. 특히 NAC domain 단백질의 경우에는 초기 발현이 급격히 증가하였고, 이후 소식물체가 성숙된 이후에도 비유도성 단계보다 발현을 높게 유지함을 확인할 수 있었다. 이러한 발현의 양상은 cytochrom p450에서도 확인되었다.
후속연구
- pinnata 잎의 톱니형 가장자리부분이 새로운 형태의 유사분열조직(meristemoid)으로 특징지어질 수 있음을 시사한다. 본 연구를 통하여 K.pinnata의 무성영양번식과 관련한 모든 유전자의 신호전달체계를 설명할 수 는 없지만, 계속 이어지는 연구를 통하여 각 유전자의 선택적 발현을 통해 무성영양번식의 주요 신호전달방법을 예측할 수 있을 것으로 사료된다.
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