다낭성 난소증후군(polycystic ovary syndrome, PCOS)은 내분비 및 대사장애로 호르몬 불균형 상태를 야기하여 가임기 여성의 불임 및 여러 합병증을 유발한다. 폐경기 여성의 호르몬대체 치료에 사용되는 estradiol valerate (EV)는 과다 투여 시 PCOS를 유발하는 것으로 알려졌다. 신경성장인자(nerve growth factor, NGF)는 발생 중인 신경세포의 생존과 성숙을 조절하는 인자로 난소에서도 합성되고, EV 처리에 의해 유도된 다낭성난소(polycystic ovary, PCO)에서 발현이 크게 증가하는 것으로 보고됐다. 따라서 본 연구에서는 난소유래 세포인 CHO 세포주와 다낭성 난소를 이용해 호르몬 불균형 상태인 PCOS 진단 시 NGF가 생물학적 표지인자로서 사용될 수 있는 가능성을 규명하고자 하였다. CHO 세포에 EV 2 mg과 3 mg 처리는 초기에 세포증식을 억제했으나 1 mg 처리는 영향을 미치지 않음으로써 실험 시 최적농도로 사용하였다. 하지만 농도별 EV 처리에 따른 CHO 세포의 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. CHO 세포에 EV 처리 후 NGF mRNA 및 단백질 발현은 대조군에 비해 30분 후 크게 증가하였고, 다수의 난포낭이 관찰된 PCOS 조직에서도 정상군에 비해 크게 증가하였다. 따라서 이상의 결과들을 종합하면 EV 처리 후 난소에서 유도되는 NGF 과발현은 비정상적 난포발달을 유도하는 인자로 작용할 것으로 보이며, 다낭성난소 진단 시 표지인자로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
다낭성 난소증후군(polycystic ovary syndrome, PCOS)은 내분비 및 대사장애로 호르몬 불균형 상태를 야기하여 가임기 여성의 불임 및 여러 합병증을 유발한다. 폐경기 여성의 호르몬대체 치료에 사용되는 estradiol valerate (EV)는 과다 투여 시 PCOS를 유발하는 것으로 알려졌다. 신경성장인자(nerve growth factor, NGF)는 발생 중인 신경세포의 생존과 성숙을 조절하는 인자로 난소에서도 합성되고, EV 처리에 의해 유도된 다낭성난소(polycystic ovary, PCO)에서 발현이 크게 증가하는 것으로 보고됐다. 따라서 본 연구에서는 난소유래 세포인 CHO 세포주와 다낭성 난소를 이용해 호르몬 불균형 상태인 PCOS 진단 시 NGF가 생물학적 표지인자로서 사용될 수 있는 가능성을 규명하고자 하였다. CHO 세포에 EV 2 mg과 3 mg 처리는 초기에 세포증식을 억제했으나 1 mg 처리는 영향을 미치지 않음으로써 실험 시 최적농도로 사용하였다. 하지만 농도별 EV 처리에 따른 CHO 세포의 형태학적 차이는 관찰되지 않았다. CHO 세포에 EV 처리 후 NGF mRNA 및 단백질 발현은 대조군에 비해 30분 후 크게 증가하였고, 다수의 난포낭이 관찰된 PCOS 조직에서도 정상군에 비해 크게 증가하였다. 따라서 이상의 결과들을 종합하면 EV 처리 후 난소에서 유도되는 NGF 과발현은 비정상적 난포발달을 유도하는 인자로 작용할 것으로 보이며, 다낭성난소 진단 시 표지인자로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
Polycystic ovary syndrome (PCOS) is hormonal imbalance condition as the endocrine and metabolic disorder that induces the infertility and various complications in reproductive age women. Estradiol valerate (EV) is used hormone replacement therapy in menopausal women and is reported that excessive ad...
Polycystic ovary syndrome (PCOS) is hormonal imbalance condition as the endocrine and metabolic disorder that induces the infertility and various complications in reproductive age women. Estradiol valerate (EV) is used hormone replacement therapy in menopausal women and is reported that excessive administration of EV induces the PCOS. Nerve growth factor (NGF) is the factor to regulate the survival and maturation of developing neuronal cell and is also synthesized in ovary. And NGF is overexpressed in EV-induced polycystic ovary (PCO) as previously reported. Therefore, this study examined the possibility of NGF as can be used the biological marker in diagnosis of PCOS, the hormonal imbalance condition, using PCO and CHO (chinese hamster ovarian) cell lines. The concentration of EV treatment is optimized a 1 mg as not influence on the proliferation of CHO cell but 2 mg and 3 mg of EV treatment have the inhibition effect at initial stage. The morphological change was not observed in CHO cell after dose dependent manner treatment of EV. Expression of NGF mRNA and protein is significantly increased at 30 min after EV treatment in CHO cells compared to that of control. And NGF protein expression is strongly increased in PCO tissue, which observed many follicular cysts compared to normal ovary tissue. Taken together, overexpression of NGF may be act as a molecule to induce an abnormal development of follicle, suggesting that NGF can be used as a biological marker in diagnosis of PCOS.
Polycystic ovary syndrome (PCOS) is hormonal imbalance condition as the endocrine and metabolic disorder that induces the infertility and various complications in reproductive age women. Estradiol valerate (EV) is used hormone replacement therapy in menopausal women and is reported that excessive administration of EV induces the PCOS. Nerve growth factor (NGF) is the factor to regulate the survival and maturation of developing neuronal cell and is also synthesized in ovary. And NGF is overexpressed in EV-induced polycystic ovary (PCO) as previously reported. Therefore, this study examined the possibility of NGF as can be used the biological marker in diagnosis of PCOS, the hormonal imbalance condition, using PCO and CHO (chinese hamster ovarian) cell lines. The concentration of EV treatment is optimized a 1 mg as not influence on the proliferation of CHO cell but 2 mg and 3 mg of EV treatment have the inhibition effect at initial stage. The morphological change was not observed in CHO cell after dose dependent manner treatment of EV. Expression of NGF mRNA and protein is significantly increased at 30 min after EV treatment in CHO cells compared to that of control. And NGF protein expression is strongly increased in PCO tissue, which observed many follicular cysts compared to normal ovary tissue. Taken together, overexpression of NGF may be act as a molecule to induce an abnormal development of follicle, suggesting that NGF can be used as a biological marker in diagnosis of PCOS.
Normal goat serum희석액을 간단히 제거하고 새로운 normal goat serum 희석 용액에 NGF 항체(Abcam)를 1 : 500의 비율로 희석하여 4°C에서 16시간 동안 처리하였다.
반응조건은 NGF가 30 cycles, 94℃ 40초, 64℃ 40초, 72℃ 40초이고, GAPDH는 30 cycles, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초로 각각 설정하였다. PCR반응 후 생산물은 0.5X Tris-Borate-EDTA buffer (TBE buffer)에 Ethidium bromide (SIGMA)가 첨가된 1.5% 농도의 아가로스겔에 전기영동한 후 Gel-Doc (BioRad Laboratories, USA)에서 확인하였다. 전기영동 후 확인된 NGF 밴드 크기는 582 bp이고 GAPDH는 199 bp였다.
다시 PBS로 조직표본을 5분씩 세 번 세척하고 normal goat serum (Vector Lab, USA) 15 μL를 1X PBS 1 mL에 희석한 용액을 20분간 상온에서 처리하는 2차 blocking을 수행하였다.
적출한 난소는 즉시 고정액(4% paraformaldehyde, in 1X PBS)에 옮기고 4℃에서 하루 동안 보관하였다. 다음날 1X PBS용액으로 2시간 세척하고, 70%, 80%, 90%, 100% I, 100% II, 100% III, 100% IV 에탄올 처리를 하여 탈수하였으며, 자일렌으로 투명화 과정을 거친 후 파라핀을 침투시켜 포매하였다. 파라핀 포매된 조직을 Leica 820 (Leica Instruments products, GER)을 이용하여 6μm 두께로 절편을 만든 후 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate (SIGMA)로 코팅된 유리 슬라이드에 올리고 37℃ 신전기 위에서 하루 동안 건조하였다.
cells/mL의 농도로 96-well 배양 접시에 각각 분주하였다. 다음날까지 세포를 배양한 후 12시간 동안 serum starvation한 다음, EV (SIGMA, USA)를 농도 별(1 mg, 2 mg, 3 mg) 그리고 시간 별로(6시간, 12시간, 24시간) 각각 처리했다. 이 후 PBS에 0.
분리된 단백질을 nitrocellulose 막으로 이동시킨 후, blocking solution (1X phosphate buffered saline, PBS+5% skim milk)에서 1시간 동안 실온 반응을 한 뒤에 세척 후, 새로운 blocking solution에 1차 항체인 anti-rabbit NGF (Abcam, UK) 항체와 anti-mouse-β-actin (SIGMA) 항체를 각각 1 : 2,500 비율로 처리하고 4°C에서 16시간 동안 반응시켰다. 다음으로 세척 후 HRP (horseradish-peroxidase)가 연결된 goat-anti-rabbit 또는 goat-anti-mouse 2차 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)를 1 : 10,000 비율로 처리하고 ECL (Amershamphamacia, UK) 용액을 이용하여 발색시킨 후 chemiluminescence film (Amershamphamacia)을 이용하여 현상하였다. 현상 필름에 나타난 NGF 밴드의 크기는 27 kDa이고 β-actin은 42kDa으로 각각 확인되었다.
05% DAB (Deaminobenzidine Tetrahydrochloride; Vector Lab)를 이용하여 발색시킨 후 조직표본을 2차 증류수에 10분간 세척하였다. 대조염색으로 Hematoxylin (Samchun Chemical, KOR)을 사용해 15초간 염색 하였고, 다시 2차 증류수에 세척한 후 조직표면에 탈수, 투명 및 봉입 과정을 수행하였다. 염색된 조직표본은 광학현미경 (Carl Zeiss, GER)을 통해 관찰하였다.
분리된 단백질을 nitrocellulose 막으로 이동시킨 후, blocking solution (1X phosphate buffered saline, PBS+5% skim milk)에서 1시간 동안 실온 반응을 한 뒤에 세척 후, 새로운 blocking solution에 1차 항체인 anti-rabbit NGF (Abcam, UK) 항체와 anti-mouse-β-actin (SIGMA) 항체를 각각 1 : 2,500 비율로 처리하고 4°C에서 16시간 동안 반응시켰다.
사육 및 실험 전 기간 동안 사육환경을 온도 23±2℃, 상대습도 60±10%로 유지하고 12시간의 명암주기가 유지되는 실내에서 사료와 식수를 자유로이 공급하였다.
세포독성에 유효농도인 EV 1 mg을 CHO 세포에 처리 후 세포의 형태학적 변화 유무를 광학현미경을 통해 시간대별로 관찰하였다. EV 처리 후 30분, 1시간, 3시간 그리고 6시간 후에 세포와 정상군의 형태적 차이는 관찰되지 않았다(Fig.
세포로부터 총 RNA 추출은 Tri reagent (MRC Inc, USA)를 이용하였고 방법은 제조회사에서 제공된 설명서를 참고하였다. 총 RNA 1 μg을 상보성 DNA (Complementary DNA, cDNA) 합성을 위해 AccuPower RT Premix (Bioneer, KOR)에 첨가하여 역전사(Reverse-Transcription, RT) 반응을 하였고, AccuPower PCR Premix (Bionee)에 합성된 cDNA 1μL를 첨가하여 중합효소반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다.
세포로부터 NGF 단백질의 발현을 분석하기 위하여 면역학적 단백질 검출법을 사용하였다. 세포에 150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), 2 mM Na3VO4, 2 mM Na4P2O7, 50 mM NaF, 2 mM EDTA (pH 7.4) 그리고 단백질분해효소 억제제인 leupeptin과 aprotinin을 첨가한 NP-40 lysis buffer을 이용하여 세포질 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 30 μg씩 각각 같은 양을 정량하여 실험에 사용하였고 SDS 12%-polyacrylamide 겔을 이용하여 전기영동을 시행하여 단백질을 분리하였다.
대조염색으로 Hematoxylin (Samchun Chemical, KOR)을 사용해 15초간 염색 하였고, 다시 2차 증류수에 세척한 후 조직표면에 탈수, 투명 및 봉입 과정을 수행하였다. 염색된 조직표본은 광학현미경 (Carl Zeiss, GER)을 통해 관찰하였다.
조직 내 NGF의 발현을 확인하기 전에 CHO 세포주에 대한 EV의 세포독성을 알아보기 위해 세포증식 지표실험인 MTT 분석을 수행하였다. CHO 세포에 1 mg부터 3 mg까지의 농도 범위를 정하여 EV를 처리하고, MTT 분석을 위해 흡광도를 측정한 결과, 6시간 후 EV 1 mg 처리군은 정상군에 비해 흡광도 값이 떨어졌지만, oil 대조군과 비슷하였다.
준비된 조직표본을 자일렌 I, 자일렌 II, 자일렌 III에 순서대로 5분씩 처리하여 탈파라핀을 하고 100%, 90%, 80%, 70% 에탄올에 각각 5분씩 단계적으로 함수하였다. 1X PBS 완충액으로 조직표본을 5분씩 세 번 세척 후, 10 mM sodium citrate 완충액(pH 6.
총 RNA 1 μg을 상보성 DNA (Complementary DNA, cDNA) 합성을 위해 AccuPower RT Premix (Bioneer, KOR)에 첨가하여 역전사(Reverse-Transcription, RT) 반응을 하였고, AccuPower PCR Premix (Bionee)에 합성된 cDNA 1μL를 첨가하여 중합효소반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하였다.
추출한 단백질은 30 μg씩 각각 같은 양을 정량하여 실험에 사용하였고 SDS 12%-polyacrylamide 겔을 이용하여 전기영동을 시행하여 단백질을 분리하였다.
파라핀 포매된 조직을 Leica 820 (Leica Instruments products, GER)을 이용하여 6μm 두께로 절편을 만든 후 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate (SIGMA)로 코팅된 유리 슬라이드에 올리고 37℃ 신전기 위에서 하루 동안 건조하였다.
흰쥐 무게 100 g 당 0.2 mL의 염산케타민(Yuhan, KOR)과 0.08 mL의 럼푼(Bayerkorea, KOR) 혼합액을 대퇴부에 근육주사하여 마취한 후 개복하고, 난소를 적출했다.
대상 데이터
2 mL를 첨가한 후, 590 nm에서 흡광도를 측정했다. EV는 Sesame oil (SIGMA)에 녹여 처리하였고, oil만 처리한 것을 oil 대조군으로 사용하였다.
무게가 190~210 g이고 4일 간격으로 성주기를 보이는 7주령된 암컷 Sprague-Dawley 흰쥐(Samtako Bio, KOR)에 EV 4 mg을 근육주사하고, 60일 후 PCO가 확인된 것을 실험에 사용하였다. 사육 및 실험 전 기간 동안 사육환경을 온도 23±2℃, 상대습도 60±10%로 유지하고 12시간의 명암주기가 유지되는 실내에서 사료와 식수를 자유로이 공급하였다.
햄스터 난소 세포주인 CHO 세포를 2×105 수로 60 mm 배양 접시에 접종하고 5% CO2 농도를 유지하는 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
전기영동 후 확인된 NGF 밴드 크기는 582 bp이고 GAPDH는 199 bp였다. 각 밴드의 밀도 측정 및 정량은 Science Lab Image Gauge (FUJI FILM, JPN) 프로그램을 이용하였다.
모든 실험은 3번 반복했고, 실험 결과 값의 통계적 분석을 위해 Excel 2007 프로그램(Microsoft, USA)을 이용하여 표준편차 및 Student t-test를 수행하였다. Student t-test 분석에서 p<0.
이론/모형
사육 및 실험 전 기간 동안 사육환경을 온도 23±2℃, 상대습도 60±10%로 유지하고 12시간의 명암주기가 유지되는 실내에서 사료와 식수를 자유로이 공급하였다. 본 실험은 전남대학교 실험동물윤리 지침에 의하여 specific pathogen free (SPF) 수준의 동물사육시설을 이용하였다.
세포로부터 NGF 단백질의 발현을 분석하기 위하여 면역학적 단백질 검출법을 사용하였다. 세포에 150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris-Cl (pH 7.
현상 필름에 나타난 NGF 밴드의 크기는 27 kDa이고 β-actin은 42kDa으로 각각 확인되었다. 현상 후 나타난 단백질 밴드의 밀도 측정 및 정량은 Science Lab Image Gauge (FUJI FILM) 프로그램을 이용하였다.
성능/효과
조직 내 NGF의 발현을 확인하기 전에 CHO 세포주에 대한 EV의 세포독성을 알아보기 위해 세포증식 지표실험인 MTT 분석을 수행하였다. CHO 세포에 1 mg부터 3 mg까지의 농도 범위를 정하여 EV를 처리하고, MTT 분석을 위해 흡광도를 측정한 결과, 6시간 후 EV 1 mg 처리군은 정상군에 비해 흡광도 값이 떨어졌지만, oil 대조군과 비슷하였다. 하지만 2~3 mg 처리군의 흡광도 값은 6시간 후 정상군과 oil 대조군에 비해 유의하게 낮았다(Fig.
정상난소에서는 발생 중인 난포동난포 및 성숙난포가 관찰되었으나 PCO에서는 난포동난포 및 성숙난포의 수는 적었고, 다수의 난포낭이 확인됐다. NGF 단백질 발현은 정상난소에 비해 PCO에서 증가했고, 발현 부위는 난소의 피질부로부터 수질부 쪽으로 집중되었다(Fig. 3).
, 2009). 따라서 EV 처리가 CHO 세포에서 NGF 발현 증가를 유도하는 것으로 보아 NGF 과발현은 PCO 형성과 밀접한 관련이 있을 것으로 생각된다.
본 연구에서도 CHO 세포에 EV를 처리하면 NGF mRNA 및 단백질 발현이 대조군에 비해 30분 후에 크게 증가했고, 세포 수도 초기에 감소하였다. 또한 EV 처리에 의해 PCOS가 유발된 흰쥐 난소에서 성숙난포와 난포동 난포는 정상군에 비해 적은 수가 관찰됐으나 NGF 단백질 발현은 크게 증가했다. NGF 과발현은 교감신경계를 과도하게 활성화시켜 혈중 생식샘자극호르몬과 황체형성호르몬에 대한 반응을 비정상적으로 증가시킴으로써 다낭성난소 증후군을 유발시키는 것으로 보고됐다(Dissen et al.
, 2000). 또한 PCOS 여성 난포액과 난포의 과립세포 배양액 내에 NGF 농도는 정상 여성에 비해 높았고, 난포막세포에서 NGF를 과발현하도록 조작한 생쥐의 배란은 정상 생쥐에 비해 감소했으며, 폐쇄 난포동난포 수가 증가했다. 또한 NGF를 과발현시킨 생쥐의 난포 과립세포의 세포사멸과 난포낭 형성은 대조군에 비해 크게 증가했다(Dissen et al.
, 2007). 본 연구에서도 CHO 세포에 EV를 2mg과 3mg을 각각 처리하고, 6시간 후 세포증식이 대조군 또는 oil 대조군에 비해 감소하였다. 하지만, 1mg 처리 시 대조군 및 oil 대조군과의 세포증식에 대한 차이는 없었다.
, 2009). 본 연구에서도 CHO 세포에 EV를 처리하면 NGF mRNA 및 단백질 발현이 대조군에 비해 30분 후에 크게 증가했고, 세포 수도 초기에 감소하였다. 또한 EV 처리에 의해 PCOS가 유발된 흰쥐 난소에서 성숙난포와 난포동 난포는 정상군에 비해 적은 수가 관찰됐으나 NGF 단백질 발현은 크게 증가했다.
현상 필름에 나타난 NGF 밴드의 크기는 27 kDa이고 β-actin은 42kDa으로 각각 확인되었다.
, 2009). 흰쥐 난소에서 NGF mRNA 발현 및 단백질 분비는 EV 처리에 의해 크게 증가했고, 시간이 지날수록 점점 감소했다. 또한 EV 처리 시 전체 난포동난포 수는 감소했으나 NGF 항체를 주입하면 다시 정상 수준으로 회복됐다(Lara et al.
후속연구
따라서 이상의 결과들을 종합하면 EV 처리 후 난소에서 유도되는 NGF 과발현은 비정상적 난포발달을 유도하는 인자로 작용할 것으로 보이며, 다낭성난소 진단 시 표지인자로서 사용될 수 있을 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
신경성장인자란 무엇이며 어디에서 분비되는가?
신경성장인자(nerve growth factor, NGF)는 발생 중인 신경세포의 생존과 성숙을 조절하는 인자로서, 피부의 각질세포, 멜라닌세포 그리고 평활근 세포와 같은 비신경성 세포뿐만 아니라 정소, 난소, 뇌하수체, 흉선 등과 같은 내분비 조직에서 분비되는 것으로 알려졌다(Sofroniew et al., 2001).
다낭성 난소증후군은 인체에 어떤 영향을 끼치는가?
다낭성 난소증후군(polycystic ovary syndrome, PCOS)은 가임기 여성에서 일어나는 가장 흔한 내분비 및 대사장애이다(Vaitukaitis, 1983). PCOS는 난소에서 난포발달, 스테로이드생산 그리고 배란에 관여하는 다양한 호르몬과 성장인자들의 생성 및 분비에 영향을 끼침으로써 무배란과 무월경에 의한 불임을 유발하고, 안드로겐 농도과다 및 내분비계 이상을 일으켜 여드름, 비만 그리고 당뇨병 같은 합병증도 일으킨다(Lara et al., 1993; Franks, 1995; Balen, 1999).
다낭성 난소증후군이란?
다낭성 난소증후군(polycystic ovary syndrome, PCOS)은 가임기 여성에서 일어나는 가장 흔한 내분비 및 대사장애이다(Vaitukaitis, 1983). PCOS는 난소에서 난포발달, 스테로이드생산 그리고 배란에 관여하는 다양한 호르몬과 성장인자들의 생성 및 분비에 영향을 끼침으로써 무배란과 무월경에 의한 불임을 유발하고, 안드로겐 농도과다 및 내분비계 이상을 일으켜 여드름, 비만 그리고 당뇨병 같은 합병증도 일으킨다(Lara et al.
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