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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 표고버섯 균사체의 항산화성, 가공 중가열에 의한 항산화성 변화, 항균성 및 항암성 실험을 실시하였기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- ) Sins.) 자실체 열수추출물을 각각 당도계로 5 Brix가 되도록 조정하여 각 해당 실험군에 자유로이 급여될 수 있도록 하였다.
- Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)는 Buege와 Aust의 방법15)을 약간 수정하여 측정하였다. 1 ml 반응 혼합물이 채워진 시험관을 37℃ water bath에서 1시간 동안 반응시켰다.
- S-180은 8～12주령된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 복수암에 걸려서 복부가 팽만한 마우스의 복강 속으로 일회용 1 ml 주사기로 찔러 노란색의 복수액 1 ml를 채취한 후, 그 원액을 0.1 ml씩 ICR 마우스의 복강 속에 접종하고 배양하면서 13일마다 계대하였다.
- 5 g에 증류수 250 ml을 넣고 hot plate에서 약 30분간 가열한 후 autoclave로 멸균하여 10 ml씩 사용하였다. 본 실험에서 총균수 측정을 한 후 생육된 균을 1 백금이를 clean bench에서 접종하여 incubator에서 24시간 배양하였다. 그 후 3%로 표고버섯균사체 추출물 희석액을 1 ml씩 가하였다.
- 가열 후 찬물에서 식힌 후 2,000×g의 속도로 15분간 원심분리 시켰다. 상등액을 흡광도(HITACHI UV-2001) 531 nm에서 측정하였고, 공시료는 시료대신에 증류수를 가하여 같은 방법으로 측정하였다. TBARS값은 ml 반응혼합물에 대해서 ㎍ malondialdehyde(MDA)로 표시하였다.
- 실험동물을 각 군당 7마리씩으로 전술한 방법으로 조제한 종양세포부유액의 농도가 1×107 cells/㎖되게 하였다.
- 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 0.1 ml(1×106 cells)씩 ICR 마우스(♂, 6주령, 28±2 ｇ)의 복강에 이식한 후부터 전술한방법으로 제조한 시료용액을 자유급식하고 23일까지의 생존여부를 관찰하여 평균수명일수를 계산하고 다음 식으로부터 수명연장 백분율(prolongation ratio, P.R. ： %)을 구하였다.
- 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 μ(2×106 cells)씩 ICR 마우스(♂, 6주령, 28±2g)의 우측 서혜부에 피하 이식한 후 5 Brix로 조제한 시료용액을 자유 급식하였다.
- 전자공여능은 Blois의 방법16)을 변형하여 측정하였다. 각 시료 2 ml에 2×10-4M DPPH 1.
- 이와 같이 희석한 S-180 세포액을 50 μ(2×106 cells)씩 ICR 마우스(♂, 6주령, 28±2g)의 우측 서혜부에 피하 이식한 후 5 Brix로 조제한 시료용액을 자유 급식하였다. 종양세포 이식 23일째 되는 날 치사시켜 생성된 고형암을 적출하고그 무게를 측정한 후 다음 식에 따라 종양성장저지 백분율 (tumor growth inhibition ratio, I.R. ： %)을 계산하였다.
- 표고버섯 균사체 추출물의 항산화성, 가열에 의한 항산화성 변화, 항균성 및 항암성 실험을 실시하였다. 표고버섯 균사체의 항암성을 측정한 결과 생존율은 28%, 종양성장 억제 율은 63%로 높았으며, 종양무게도 1.
- 그 후 3%로 표고버섯균사체 추출물 희석액을 1 ml씩 가하였다. 표고버섯 균사체 희석액을 넣은 tube 를 0, 1, 3, 5 시간 단위로 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그전에 표고버섯 균사체 추출액 및 액체 배지의 흡광도를 측정하여 blank로 사용하였다.
대상 데이터
- 표고버섯 균사체는 OM바이오텍(Gyeongbuk, Korea)에서 구입하여 사용하였으며, 실험에 사용된 시약은 특급시약이고, Trichloroacetic acid(TCA)는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)에서 구입하였고, 2-thiobarbituric acid(TBA)는 Eastern Organic Chemicals(Roochester, NY)에서 구입하였다.
- ICR 마우스(28±2 ｇ, 6주령)는 sarcoma 180의 복수암과 고형암을 유발하기 위한 숙주로 사용하였다.
- ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대 중인 S-180 세포를 멸균된 주사기로 채취하였다. 그 암세포들을 MEME 배지로 희석하여 S-180 세포의 농도가 4×107 cells/㎖되게 하였다.
- Sarcoma 180(S-180) 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받았다. S-180은 8～12주령된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다. 복수암에 걸려서 복부가 팽만한 마우스의 복강 속으로 일회용 1 ml 주사기로 찔러 노란색의 복수액 1 ml를 채취한 후, 그 원액을 0.
- Sarcoma 180(S-180) 세포는 한국세포주은행으로부터 분양받았다. S-180은 8～12주령된 ICR 마우스의 복강에서 계대 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 동물은 4주령의 ICR 마우스를 국립보건원 안전 연구원으로부터 분양받아, 일반 사료로 2주 이상 사육실에서 적응시켰다. ICR 마우스(28±2 ｇ, 6주령)는 sarcoma 180의 복수암과 고형암을 유발하기 위한 숙주로 사용하였다.
- 사육 온도는 2～24℃이었으며 습도는 60～70%였다. 사료는 펠렛형 실험동물 사료(삼양사 (주))였으며 자유 급식시켰다.
- 표고버섯 균사체는 회전식 진공 농축기에서 농축한 후 동결건조한 것을 추출 시료로 사용하였다. 표고버섯 균사체 20 g에 증류수 100 ml을 가하여 85℃에서 3시간 동안 2회 반복 추출하고, Whatman No.
데이터처리
- Means followed by the same superscript in a row are not significantly different at the 5% level by Duncan's multiple range test.
- 통계처리는 각각의 시료에 대해 평균±표준오차로 나타내었으며, 각 군에 따른 유의차 검증은 분산분석을 한 후 α=0.05수준에서 Duncan's multiple test18)에 따라 분석하였다.
이론/모형
- SOD 유사활성 측정은 Marklund와 Marklund의 방법17)에 따라 각 시료 0.2 ml에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer(50 mM tris[hydroxymethyl] aminomethane + 10 mM EDTA) 3 ml와 7.2 mM pyrogallol 0.2 ml를 가하고 25℃에서 10분간 방치한 후 1 N HCl 1 ml로 반응을 정지시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하여 100-[(시료참가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100]으로 나타내었다.
성능/효과
- Table 4는 3% 농도의 표고버섯 균사체 열수추출물의 항균력을 측정한 결과이다. 0, 1, 3, 5시간대별로 그 항균력을 측정한 결과 표고버섯 균사체 열수추출물을 넣고 시간이 경과할수록 그 항균력이 높아짐을 알 수 있었다.
- 5는 물과 ethanol로 추출한 표고버섯 균사체의 DPPH(α, α‘-diphenyl-β-picryhydrazyl)에 대한 전자공여능을 측정한 결과이다. Ethanol 추출물의 전자공여능은 90.85%, 열수추출물의 전자공여능은 82.14%로 두 시료 모두 높은 전자공여능을 나타내었다. 열수추출물보다는 ethanol 추출물의 전자공여능이 우수하게 나타났다.
- 2는 fish oil을 사용하여 지방산패 정도를 측정한 결과이다. Fish oil은 linseed oil보다 이중결합수가 더 많아서 지방산패 정도의 차이를 더욱 확연히 볼 수 있는데, 전반적으로 fish oil을 사용한 지방산패 실험의 결과가 linseed oil을 사용한 실험보다 더 높은 지방산패 정도를 나타내었다. 표고버섯 균사체의 항산화성은 linseed oil에서와 마찬가지로 fish oil에서도 동일한 경향을 나타내었다.
- 4는 지방산패 정도의 차이를 확연히 알 수 있는 fish oil에서 지방산패 촉진인자인 KO2와 강력한 지방산패 촉진인자로 알려진 Fe2+ ion을 혼합하여 실험한 결과이다. Linseed oil의 실험보다 확연히 높은 지방산패 정도를 알 수 있었고, 경향은 동일하였다. 이러한 결과로 보아 표고버섯 균사체 추출물은 지방산패를 억제하는 우수한 항산제임을 확인할 수 있었다.
- 이에 항암소재로서 표고버섯 균사체의 우수성을 확인할 수 있었다. Oil을 달리하여 TBARS를 측정한 결과 지방산패에 대한 표고버섯 균사체 추출물은 우수한 항산화성임을 알 수 있었다. 표고버섯 균사체의 가열 전후 전자공여능과 SOD 유사활성능을 비교한 실험에서는 두 시료간의 차이가 크지 않아 표고버섯 균사체는 가열에 의한 영향을 크게 받지 않음을 알 수 있었다.
- 표고버섯 균사체의 가열은 70℃에서 2시간 동안 가열하였다. 가열 전의 표고버섯 균사체 전자공여능은 82.1%를 나타냈고, 가열 후의 표고버섯 균사체 전자공여능은 80.3%로 가열 전의 표고버섯 균사체의 전자공여능이 다소 높게 나타났으나 그 차이는 크게 나지 않았다. 이러한 결과로 표고버섯 균사체는 열에 의한 영향을 크게 받지 않는 것을 알 수 있다.
- 1은 linseed oil을 사용하여 지방산패 정도를 측정한 결과이다. 대조구보다 표고버섯 균사체 추출물의 값이 낮게 나타났고, 지방산패 촉진인자인 KO2와 반응한 결과도 표고버섯 균사체 추출물이 낮은 결과를 나타내었다. Fig.
- 14%로 두 시료 모두 높은 전자공여능을 나타내었다. 열수추출물보다는 ethanol 추출물의 전자공여능이 우수하게 나타났다. Kang 등25)은 전자공여능이 phenolic acids와 flavonoids 및 기타 phnol성 물질에 대한 항산화작용의 지표라 하였으며, 이러한 물질은 환원력이 큰 것일수록 전자공여능이 높다고 하였다.
- 4%로 가열 전이 다소 높은 SOD 유사활성능을 나타내었다. 이 결과로써 표고버섯 균사체는 열에 의한 영향을 크게 받지 않는 것을 알 수 있었다. 항산화 효소 중의 하나인 superoxide dismutase(SOD)는 세포에 유해한 환원 산소종을 과산화수소로 전환 시키는 반응 (2O2-+ 2H+ → H2O2 + O2)을 촉매하는 효소이며, SOD에 의해 생성된 H2O2는 peroxidase나 catalase에 의하여 무해한 물분자와 산소분자로 전환시켜 산소 상해로부터 생체를 보호하는 기능으로 알려져 있다22,23).
- Linseed oil의 실험보다 확연히 높은 지방산패 정도를 알 수 있었고, 경향은 동일하였다. 이러한 결과로 보아 표고버섯 균사체 추출물은 지방산패를 억제하는 우수한 항산제임을 확인할 수 있었다.
- 표고버섯 균사체의 가열 전후 전자공여능과 SOD 유사활성능을 비교한 실험에서는 두 시료간의 차이가 크지 않아 표고버섯 균사체는 가열에 의한 영향을 크게 받지 않음을 알 수 있었다. 추출용매를 달리한 전자공여능 실험에서는 ethanol추출물 90.85%, 열수추출물 82.14%로 두 시료 모두 높은 전자공여능을 나타내었다. 항균력을 측정한 결과 표고버섯 균사체 추출물 첨가 3시간 경과 후에 39.
- 표고버섯 자실체와 균사체 두 군 모두는 대조군보다 생존 기간과 수명 연장율이 우수하였다. 특히, 표고버섯 균사체의 경우 수명 연장율이 28%로 가장 높게 나타나 우수한 항암성 소재임을 알 수 있었다.
- 표고버섯 균사체의 가열 전과 가열 후에 대한 SOD 유사활성능을 측정한 결과 가열 전 SOD 유사활성은 70.3%였고 가열 후 SOD 유사활성은 69.4%로 가열 전이 다소 높은 SOD 유사활성능을 나타내었다. 이 결과로써 표고버섯 균사체는 열에 의한 영향을 크게 받지 않는 것을 알 수 있었다.
- Oil을 달리하여 TBARS를 측정한 결과 지방산패에 대한 표고버섯 균사체 추출물은 우수한 항산화성임을 알 수 있었다. 표고버섯 균사체의 가열 전후 전자공여능과 SOD 유사활성능을 비교한 실험에서는 두 시료간의 차이가 크지 않아 표고버섯 균사체는 가열에 의한 영향을 크게 받지 않음을 알 수 있었다. 추출용매를 달리한 전자공여능 실험에서는 ethanol추출물 90.
- 표고버섯 균사체의 항암성을 측정한 결과 생존율은 28%, 종양성장 억제 율은 63%로 높았으며, 종양무게도 1.30±0.4 g으로 대조군에 비하여 감소하였다.
- Table 1은 표고버섯 자실체 열수추출물과 표고버섯 균사체 액체배양혼합액을 각각 5 Brix로 조정한 후 암 유발 마우스에 자유 급식한 후 생존기간과 수명 연장율을 측정한 결과이다. 표고버섯 자실체와 균사체 두 군 모두는 대조군보다 생존 기간과 수명 연장율이 우수하였다. 특히, 표고버섯 균사체의 경우 수명 연장율이 28%로 가장 높게 나타나 우수한 항암성 소재임을 알 수 있었다.
- Table 2는 solid form S-180으로 복강암을 유발한 마우스의 종양 성장 억제율에 대한 표고버섯 자실체와 표고버섯 균사체의 효능을 실험하기 위하여 자유 급식한 결과이다. 표고버섯자실체와 표고버섯 균사체를 자유급식한 후 마우스의 종양무게, 종양성장 억제율을 측정한 결과 대조군에 비하여 종양무게와 종양성장 억제율이 높게 나타났다. Table 1과 2의 결과로 표고버섯 균사체의 우수한 항암성을 확인할 수 있었다.
- 14%로 두 시료 모두 높은 전자공여능을 나타내었다. 항균력을 측정한 결과 표고버섯 균사체 추출물 첨가 3시간 경과 후에 39.3%의 항균력을 나타내었다.
후속연구
- 최근에는 담자균류 다당류들이 기존의 면역강화기능 외에도 혈당 및 콜레스테롤 감소기능과 지질과산화억제 및 항산화 효소 활성화와 관련된 다수의 논문들이 보고됨11-14)에 따라 표고버섯 균사체도 생체방어성 식이섬유로서의 새로운 소재로 활용도가 높아질 것으로 기대되어 진다.
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