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문제 정의
- 이상의 결과로 볼 때 목향은 정상세포에서도 세포독성을 가지고 있지만 백혈병 세포의 말단분화 능력을 가지고 있음을알 수 있다. 따라서 목향은 백혈병 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 하지만, costunolide의 정상백혈구(human normal lymphocyte)에 대한 세포증식 및 독성에 관해 연구가 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 목향추출물과 주요구성성분인 costunolide의 독성을 정상백혈구에서 평가하고 백혈병 세포주인 HL-60 cell의 증식에 미치는 영향을 평가하여 木香이 백혈병을 치료하기 위한 천연물 신약 후보물질로 가능한지를 알아보고자 한다.
- 본 연구에서 목향은 HL-60 세포주에서 실시한 세포생존율 분석과 단세포 전기영동법에서 세포독성이 있음을 확인하였다. 그리고 사람 정상 백혈구에서는 단세포 전기영동법을 통한 세포독성은 확인하였지만, 유전독성은 보이지 않았다.
제안 방법
- 4)로 5분간 3회 중화시켰다. DNA가 슬라이드에 침착될 수 있도록 슬라이드를 에탄올에 적어도 1시간 이상담가 놓았다. 슬라이드를 건조시킨 후 ethidium bromide(20μg/ml) 60μl로 형광염색 하였다.
- HL-60 cell에 costunolide(1μM)와 목향추출물(0.1, 1, 10㎍/㎖)을 처리한 후 원심분리하여 2×105개의 cell을 수거하여 1% nitroblue tetrazolium (NBT)와 200ng/㎖ phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)가 함유된 PBS에 섞은 후 5% CO2가 공급되는 37℃ 항온기에서 30분동안 배양하였다.
- HL-60 cell을 24 well plate에 1×105개씩 분주하고 각각 costunolide(10, 20μM； Tocris, Bristol, UK)와 목향 추출물(5, 10, 15, 20㎍/㎖)을 6, 24, 30, 48시간동안 처리하여 trypan blue 염색법을 통해 세포생존을 관찰하였다.
- 43%이었으며 냉장보관 후 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다. 목향 추출물내의 costunolide 함량 분석은 AcQUITY UPLCTM System (Waters, UK)으로 분석하였다.
- 1, 1, 10㎍/㎖)을 처리한 후 원심분리하여 2×105개의 cell을 수거하여 1% nitroblue tetrazolium (NBT)와 200ng/㎖ phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)가 함유된 PBS에 섞은 후 5% CO2가 공급되는 37℃ 항온기에서 30분동안 배양하였다. 배양한 세포는 cytospin slide에 떨어뜨린 후 2000rpm에서 5분간 원심분리하여 현미경으로 관찰하였다.
- 슬라이드를 건조시킨 후 ethidium bromide(20μg/ml) 60μl로 형광염색 하였다.
- 유전독성평가에 널리 사용되는 소핵분석을 통해, 목향추출물과 costunolide의 염색체 손상을 살펴보았다. 소핵분석 결과에서 목향추출물과 costunolide는 HL-60 cell과 사람 정상 백혈구에서 소핵형성을 유발시키지 않았다.
- 작성된 표본은 공기 건조시킨 후 5% giemsa 용액에 10분간 염색하여 소핵의 빈도를 측정하였고 한 농도 당 간기 세포 1000개를 무작위로 관찰하였다. 소핵 분석 방법은 Fenech (2000)의 기준에 준하여 측정하였고 모든 slide는 이중맹검법을 사용하여 측정되었다14).
- 즉 1.5mL tube 에 혈액과 HL-60 cell이 포함된 배지를 넣고 costunolide(1μM)와 목향추출물(0.1, 1, 10㎍/㎖)을 처리한 후 3시간 동안 5% CO2가 공급되는 37℃ 항온기에서 배양하였다.
- 슬라이드를 건조시킨 후 ethidium bromide(20μg/ml) 60μl로 형광염색 하였다. 형광현미경을 이용하여 515-560nm 의 excitation filter와 590nm의 barrier filter에서 400배율로 관찰하였다. 무작위로 선택된 한 농도 당 세포 60개는 이미지 분석 프로그램(Image-Pro Plus 4.
대상 데이터
- 목향(Saussureae radix, 옴니허브, 영천)은 파쇄한 후 에탄올을 사용하여 추출하였다. 추출 방법을 간략히 설명하면 다음과 같다.
- 그 다음으로 55±2℃에서 회전 감압농축기(EYELA, Tokyo, Japan)로 감압농축하고 초저온냉동고(Nihon freezer, Japan)에서 동결한 후 동결건조기(Labconco, USA)에서 건조하였다. 목향의 최종 수율은 8.43%이었으며 냉장보관 후 DMSO에 녹여 실험에 사용하였다. 목향 추출물내의 costunolide 함량 분석은 AcQUITY UPLCTM System (Waters, UK)으로 분석하였다.
데이터처리
- 0을 사용하여 세포생존율의 경우 반복측정 분산분석(repeated measured ANOVA test)을 실시하였으며, 유의한 결과가 나온 경우 Turkey post hoc test를 시행하여 비교분석하였다. 단세포 전기영동 분석은 Kruskal-Wallis test를 시행하여 유의성을 검정하였으며, 유의한 결과가 나온 경우 Mann-Whitney test를 시행하여 군간 차이를 평가하였다. 백혈구 분화능 평가는 일원배치 분산분석(Oneway ANOVA test)을 실시하였고, Turkey post hoc test를 시행하여 군간 차이를 비교하였다.
- 형광현미경을 이용하여 515-560nm 의 excitation filter와 590nm의 barrier filter에서 400배율로 관찰하였다. 무작위로 선택된 한 농도 당 세포 60개는 이미지 분석 프로그램(Image-Pro Plus 4.0)을 통해 DNA의 손상 정도를 head를 포함한 Olive Tail Momentum을 분석하였다.
- 단세포 전기영동 분석은 Kruskal-Wallis test를 시행하여 유의성을 검정하였으며, 유의한 결과가 나온 경우 Mann-Whitney test를 시행하여 군간 차이를 평가하였다. 백혈구 분화능 평가는 일원배치 분산분석(Oneway ANOVA test)을 실시하였고, Turkey post hoc test를 시행하여 군간 차이를 비교하였다. 유의수준은 5%로 설정하여 미만인 경우 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
- 윈도우용 PASW 18.0을 사용하여 세포생존율의 경우 반복측정 분산분석(repeated measured ANOVA test)을 실시하였으며, 유의한 결과가 나온 경우 Turkey post hoc test를 시행하여 비교분석하였다. 단세포 전기영동 분석은 Kruskal-Wallis test를 시행하여 유의성을 검정하였으며, 유의한 결과가 나온 경우 Mann-Whitney test를 시행하여 군간 차이를 평가하였다.
이론/모형
- Effects of Saussurea lappa and costunolide on HL-60 cell differentiation. Cell differentiation was assessed by the NBT reduction assay. Each bar represents the mean±S.
- 단세포 전기영동법은 Singh의 방법(1994)에 준하여 시행 하였다11). 즉 1.
- 배양 후에는 DNA 회복을 차단하기 위해 4℃를 유지하면서 전혈의 경우 M'Bemba-Meka et al (2000) 방법12)에 따라 ficoll로 림프구를 분리하였고, HL-60 cell은 원심분리하여 상등액을 제거한 후 세포를 분리하였다.
- 백혈구 분화능에 대한 측정은 Collins 등 (1979)의 방법에 준하여 시행하였다15). HL-60 cell에 costunolide(1μM)와 목향추출물(0.
- 작성된 표본은 공기 건조시킨 후 5% giemsa 용액에 10분간 염색하여 소핵의 빈도를 측정하였고 한 농도 당 간기 세포 1000개를 무작위로 관찰하였다. 소핵 분석 방법은 Fenech (2000)의 기준에 준하여 측정하였고 모든 slide는 이중맹검법을 사용하여 측정되었다14).
- 소핵분석은 Fenech and Morley (1985)의 방법에 준하여 시행하였다13). 혈액과 HL-60 cell에 costunolide(1μM)와 목향추출물(0.
성능/효과
- 1. 목향추출물과 costunolide는 백혈병 세포인 HL-60 cell 과 사람의 정상 백혈구에서 세포자기사멸 양상의 세포독성을 가지고 있는 것으로 조사되었으나 유전독성은 유발시키지 않는 것으로 나타났다.
- 2. 목향추출물은 대조물질인 costunolide보다 상대적으로 약하지만 백혈병 세포에 대해서 말단분화를 유도하는 것이 확인되었다.
- 본 연구에서 목향은 HL-60 세포주에서 실시한 세포생존율 분석과 단세포 전기영동법에서 세포독성이 있음을 확인하였다. 그리고 사람 정상 백혈구에서는 단세포 전기영동법을 통한 세포독성은 확인하였지만, 유전독성은 보이지 않았다. 또한 비교물질로 사용된 costunolide에 비해 목향은 상대적으로 백혈병 세포의 말단 분화를 적게 유도하는 것으로 관찰되었다.
- 그리고 사람 정상 백혈구에서는 단세포 전기영동법을 통한 세포독성은 확인하였지만, 유전독성은 보이지 않았다. 또한 비교물질로 사용된 costunolide에 비해 목향은 상대적으로 백혈병 세포의 말단 분화를 적게 유도하는 것으로 관찰되었다.
- 목향추출물과 costunolide가 HL-60 cell의 생존에 미치는 영향을 살펴본 결과 대조군인 DMSO 10㎕ 처리군에 비해 24시간 때부터 세포사멸을 유발시키는 것으로 관찰되었으며, 세포사멸의 정도는 목향추출물보다 costunolide의 영향이 더 크게 나타나는 것으로 조사되었다(Fig. 1). 이 세포생존율의 결과를 근거로 HL-60 cell의 성장억제농도(Growth Inhibition 50； GI50)를 산출한 결과 목향 4.
- 목향추출물과 costunolide의 DNA 손상 유발여부를 알아보기 위해 단세포 전기영동법을 시행한 결과 HL-60 cell에서 costunolide는 대조군에 비해 통계적으로 유의하게 높은 DNA 손상을 유발시키는 것으로 나타났으며, 목향추출물은 0.1과 1μM 농도에서는 DNA 손상이 관찰되지 않았으나 반수치사농도를 넘는 10μM의 농도에서는 costunolide보다 더 많은 DNA 손상이 관찰되었다(Fig. 2A).
- 백혈구의 말단분화 능력을 파악하기 위해 NBT reduction assay를 시행한 결과 costunolide는 통계적으로 유의하게 백혈구의 말단 분화를 유발시키는 것으로 관찰되었고, 목향추출물의 경우는 1㎍/㎖의 농도에서 대조군에 비해 백혈구 분화를 증가시켰지만 다른 농도에서는 백혈구 분화가 관찰되지 않았다(Fig. 3).
- 단세포 전기영동법을 통한 apoptosis의 경우 크고 둥근 꼬리부분과 hedgehog이라 불리는 작은 머리부분의 양상으로 관찰되는 반면에 necrosis의 경우는 큰 머리부분과 좁고 다양한 길이의 꼬리부분으로 관찰된다29). 본 연구결과에서 목향추출물과 costunolide 모두 HL-60 cell과 정상 사람 백혈구에서 SSB를 유발시키는 것이 확인되었다. Costunolide는 HL-60 cell에서 활성산소종(Reactive oxygen species； ROS)을 유발시킴으로 해서 mitochondria membrane의 permeability 를 증가시키고, 그 결과 mitochondria내의 cytochrome C를 세포질로 분비시킴으로써 apoptosis를 유발한다는 연구결과가 보고되었다24).
- 또한, 기존의 연구에서 목향의 메탄올 분획법에 따라 추출된 추출물들이 암세포주인 A549, SK-OV-3, SK-MEL-2, XF498과 HCT15 cell line들에게서 세포독성을 가지고 있음이 확인되었다26). 본 연구에서 사용된 목향은 대한약전에서 제시한 방법에 따라 한약재 품질검사를 실시하였으며, UPLC 분석을 통해 목향 추출물 내 costunolide가약 1%가 포함된 것을 확인하였으며, 본 연구결과에서도 기존의 연구결과들과 유사하게 목향추출물과 costunolide 모두 백혈병 세포주인 HL-60 cell line에서 세포의 성장을 억제시키는 효과가 있음을 확인하였다.
- . 본 연구에서는 목향추출물과 costunolide 모두에서 소핵의 형성이 관찰되지 않아 목향추출물이나 costunolide는 유전독성을 유발시키지 않는 것을 확인하였다.
- 유전독성평가에 널리 사용되는 소핵분석을 통해, 목향추출물과 costunolide의 염색체 손상을 살펴보았다. 소핵분석 결과에서 목향추출물과 costunolide는 HL-60 cell과 사람 정상 백혈구에서 소핵형성을 유발시키지 않았다. 이러한 결과는 목향이나 costunolide가 유전독성을 일으키지 않음을 제시하고 있다(Table 1).
- 이 세포생존율의 결과를 근거로 HL-60 cell의 성장억제농도(Growth Inhibition 50； GI50)를 산출한 결과 목향 4.46(95%CI；2.52, 5.95)㎍/㎖, costunolide 3.59(95%CI； 0.03, 6.41) μM로 나타났으며, 이 농도를 기준으로 독성평가 농도를 결정하였다.
- 또한, 목향추출물은 AGS cell에서 p53과 p21을 유도하여 G2기에서 세포의 분열을 정지시키고 apoptosis 를 유발시키는 연구결과가 보고되었다30). 이러한 연구결과는 본 연구결과에서 관찰된 세포손상의 형태는 apoptosis를 일으키는 형태와 일관된 결과를 보여주고 있으며(Fig. 2C, D), 목향추출물의 경우는 정상세포에서도 apoptosis를 유도시키는 것으로 사료된다.
- 또한 다른 연구에서는 costunolide를 HL-60 cell에 처리하였을 때 그 자체만으로는 분화효과가 미약하였지만 1,25(OH)2D3와 all-trans retinoic acid에 의해 유도된 terminal differentiation을 증가시키는 것으로 보고되었다9,10). 이러한 연구결과들과 유사하게 본 연구에서도 costunolide를 처리한 HL-60 cell에서 nitroblue tetrazolium이 감소되는 경향을 보였다. 그러나 목향추출물을 처리한 HL-60 cell에서는 costunolide보다는 상대적으로 약한 분화가 관찰되었다.
- 이상의 결과로 볼 때 목향은 정상세포에서도 세포독성을 가지고 있지만 백혈병 세포의 말단분화 능력을 가지고 있음을알 수 있다. 따라서 목향은 백혈병 치료에 도움을 줄 수 있을 것으로 사료된다.
- 2A). 정상 사람 백혈구에서는 costunolide와 목향추출물 처리군 모두에서 DNA 손상이 관찰되었으며, HL-60 cell의 결과와 유사하게 높은 농도의 목향추출물은 costunolide보다 더 높은 DNA 손상이 관찰되었다(Fig. 2B).
후속연구
- 그러나 목향추출물을 처리한 HL-60 cell에서는 costunolide보다는 상대적으로 약한 분화가 관찰되었다. 이 결과는 목향이 백혈병 치료제로서 개발될 가능성이 있는 것으로 해석되지만 그 효능을 확인하기 위해서 추가 연구가 더 필요할 것으로 사료된다.
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