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문제 정의
- Y-미로 실험은 定志丸이 실험동물의 공간지각능력 및 단기 기억능력의 회복에 도움을 주는지를 알아보기 위한 실험이다. Y미로 실험에 이용되는 기구는 Y자 모양의 120° 각도를 이루는 세 개의 가지(arm, 길이 : 28 cm, 넓이 : 6 cm, 높이 : 18 cm)로 구성되어있으며, 흰색의 무광 아크릴 판으로 제작되었다.
- 定志丸이 인지 및 기억력 향상 효능을 나타내는 작용기전을 규명하기 위하여 산화적 손상 및 생체내 항산화 방어 기작을 검토하는 일련의 실험을 수행하였다. 최근 활성산소종이 다양한 종류의 퇴행성 뇌질환과 관련되어 있음이 밝혀짐에 따라 활성산소의 생체 내 발생 및 생성억제에 관한 연구가 활발히 수행되고 있다.
- 기억력 장애는 치매 환자에서 가장 빈번하게 나타나는 주요 증상이며 치매 환자의 사화생활에 큰 장애를 초래하여 이에 대한 적절한 치료가 치매 환자의 삶의 질은 물론 병증의 개선에 중요한 요소라는 점에 착안하여, 본 연구는 한의학에서 기억력 장애와 관련된 健忘의 치료법에서 그 대책을 찾아보고자 시도하였다.
- 따라서 본 연구에서는 定志丸의 인지능, 기억력 향상 및 항건망 효과를 실험적으로 규명하기 위하여, C57BL/6 마우스에 스코폴라민(scopolamine)으로 기억력 손상을 유도하고 定志丸의 기억력 손상 보호효과를 관찰하였다.
- 치매의 발병, 병인, 병리에는 단일 경로가 아니라 산화적 손상, 신경전달물질 이상, 신경영양인자 결핍 등 다양한 요소들이 복합적으로 작용하므로 예방 및 치료제 개발에도 이러한 측면이 고려되어져야 한다. 따라서 본 연구에서는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 길항제로 알려진 스코폴라민으로 유도된 건망증 병태 모델에서 定志丸의 인지 및 기억력 향상을 통한 항치매 효능을 다양한 행동실험을 이용하여 검토하고 작용기전을 다각적 지표를 사용하여 규명하고자 하였다.
- 뇌조직은 산소 소모량이 높고 산화되기 쉬운 불포화지방의 함량이 높은 반면 catalase 및 글루타치온(glutathione, GSH) 등 세포내 항산화 기전들의 활성이 다른 조직에 비해 낮아 상대적으로 산화적 손상을 받기 쉬운 특성을 지닌다. 본 연구에서 산화적 손상에 대한 定志丸의 효능을 평가하기 위하여, 마우스에 스코폴라민 및 定志丸을 투여하고 세포내 GSH량 및 지질과산화를 측정하였다. 스코폴라민을 마우스에 단독으로 투여한 결과(SCO) 세포내 GSH 합성이 83.
- DCF-DA는 세포내로 들어가 세포내 생성된 활성산소에 의해 탈아세틸화 되면 형광을 내는 물질인 DCF로 전환된다. 본 연구에서는 활성산소종 생성에 대한 定志丸의 효과를 측정하기 위하여 마우스에 定志丸을 100 mg/kg 및 200 mg/kg의 용량으로 경구 투여 한 후 대뇌 피질과 해마를 분리하였다. 정상군(SHAM)의 경우를 기준으로 定志丸을 100 mg/kg 및 200 mg/kg의 용량으로 투여한 군(JJH)에서는 활성산소종의 생성이 각각 25% 및 15%로 감소되었다.
제안 방법
- BCA시약으로 단백질 함량을 정량 한 뒤, 30 μg을 12.5% SDS-PAGE에서 전기영동 하였다.
- 생성된 cDNA는 다음과 같은 합성 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다(Table 3). PCR에 의해 증폭된 DNA들은 ethidium bromide로 염색된 1.5% 아가로즈 젤에서 전기영동 한 뒤 UV를 조사하여 gel documentation system (TCP-20.M, Vilber Lourmat, France)으로 관찰하였다. glyceraldehydes-3-phpsphate dehydrogenase (GAPDH)는 동일한 실험 조건 확인을 위한 대조 지표로 사용하였다.
- TRI reagent (Molecular Research Ceter, OH, USA)로 실험동물의 대뇌 피질 부위로부터 mRNA를 추출하였다. 분리한 mRNA는 M-MLV 역전사 효소(Promega, WI, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 42℃에서 1시간 동안 역전사 시켰다.
- 定志丸의 인지능, 기억력 향상 및 항건망 효과를 실험적으로 규명하기 위하여, 스코폴라민(scopolamine)으로 기억력 손상을 유도하고 定志丸의 효능을 다각적으로 관찰한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 定志丸이 인지 및 기억력 향상효과를 갖는 또 다른 작용 기전으로, 장기기억 형성과 밀접한 관련이 있다고 알려진 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)의 발현 및 상위 조절 단백질의 활성을 검토하는 일련의 실험을 수행하였다. BDNF의 발현은 스코폴라민 투여(SCO)로 인하여 영향을 받지 않았지만, 定志丸을 함께 투여(SCO + JJH)함으로써 현저히 증가됨을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 忽忽喜忘”을 치료한다고 하였으며, 이후 본 처방을 기본으로 하여 여러 서적에서 茯神, 柏子仁, 酸棗仁, 朱砂, 琥珀 등을 加味한 여러 종류의 定志丸을 제시하여 健忘이나 驚悸 등을 치료하였다.
- Y미로 실험에 이용되는 기구는 Y자 모양의 120° 각도를 이루는 세 개의 가지(arm, 길이 : 28 cm, 넓이 : 6 cm, 높이 : 18 cm)로 구성되어있으며, 흰색의 무광 아크릴 판으로 제작되었다. 각 가지를 A, B, C로 정하고 한쪽 가지에 마우스를 놓아주어 8분 동안 자유롭게 움직이도록 한 다음 각 가지에 들어간 횟수와 순서를 천정에 설치된 카메라를 통해 컴퓨터 프로그램(Ethovision 3.1, Noduls, Netherlands)으로 관찰하여 기록하였다. 이 때 각 가지에 들어간 횟수와 순서는 꼬리가 완전히 들어간 경우에 한하며, 반복해서 동일한 가지에 다시 들어간 경우도 기록하였다.
- 기억 및 인지 장애를 유발하는 물질인 스코폴라민을 투여하기 5일전부터 定志丸을 100 또는 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여하였으며, 행동실험 실시기간 동안은 행동실험 개시 1시간 전에 경구 투여하였다. 이후, 행동실험 30분 전 스코폴라민을 1 mg/kg의 용량으로 복강으로 투여하였으며, Y-미로(Y-maze test), 모리스 물-미로(Morris water-maze test), 수동회피(passive avoidance) 및 공포조건화(fear conditioning test) 실험을 실시하였다.
- 수동회피 실험은 동일한 구조의 조명이 있는 방과 조명이 없는 방(가로 25 cm, 세로 20 cm, 높이 20 cm)이 길로틴 문(guillotin door)으로 연결되어 있는 장치에서 수행되었다(Gemini Avoidance System, San Diego, USA). 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 방에 놓고 10초간 탐색시킨 후 문을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하였으며, 이때 어두운 방으로 들어갈 때까지 걸리는 시간을 측정하였다(학습 시험 : acquisition trial). 마우스가 어두운 방으로 들어가면 자동으로 문이 닫히고 0.
- 1)을 이용하여 실험동물의 탈출잠복기를 기록하였다. 물-미로 실험은 실험동물이 수조 주변의 표지물을 기억하여 찾아가기 때문에 주변 환경의 변화가 없도록 표지물의 위치를 실험기간 동안 일정하게 유지하였고, 120초 안에 도피대를 찾지 못할 경우 실험동물을 도피대로 유도하여 10초 동안 머물며 위치를 기억하도록 하였다. 실험 마지막 날에는 도피대를 제거하고, 30초 동안 도피대가 존재한 사분면에 머무는 시간(time spent in platform quadrant)을 측정하는 probe test를 실시하였다.
- 분리한 mRNA는 M-MLV 역전사 효소(Promega, WI, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 42℃에서 1시간 동안 역전사 시켰다. 생성된 cDNA는 다음과 같은 합성 프라이머를 사용하여 PCR을 실시하였다(Table 3). PCR에 의해 증폭된 DNA들은 ethidium bromide로 염색된 1.
- 이 때 각 가지에 들어간 횟수와 순서는 꼬리가 완전히 들어간 경우에 한하며, 반복해서 동일한 가지에 다시 들어간 경우도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 순차적으로 들어간 경우 즉 ABC, CAB, BCA 등의 순서로 들어간 경우(실제 변경, actual alternation) 1점씩을 부여하였으며, % 변경 행동력(% alternation behavior)은 다음의 수학식에 의해 계산하였다.
- 세포내 축적된 활성산소 중 특히 peroxide류의 생성 측정을 위해 2',7'-dichlorofluorecin diacetate (DCF-DA) 시약을 사용하였다.
- 수동회피 실험은 동일한 구조의 조명이 있는 방과 조명이 없는 방(가로 25 cm, 세로 20 cm, 높이 20 cm)이 길로틴 문(guillotin door)으로 연결되어 있는 장치에서 수행되었다(Gemini Avoidance System, San Diego, USA). 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 방에 놓고 10초간 탐색시킨 후 문을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하였으며, 이때 어두운 방으로 들어갈 때까지 걸리는 시간을 측정하였다(학습 시험 : acquisition trial).
- 스코폴라민으로 유도된 기억력 손상에 대한 定志丸의 개선 효과를 검토하기 위하여, 실험동물의 환경적 맥락 또는 조건자극을 전기쇼크와 연합시켜 학습과 기억을 평가하기위하여 공포조건화 실험(fear conditioning test)을 실시하였다. 이는 다시 맥락 조건화(contextual fear conditioning)와 단서 조건화(cued fear conditioning)로 나눌 수 있다.
- 스코폴라민으로 유도된 기억력 손상에 대한 정저환의 개선 효과를 검토하기 위하여, 동일한 구조의 조명이 있는 방과 조명이 없는 방이 길로틴 문(guillotin door)으로 연결되어 있는 장치를 사용하여 수동회피실험(passive avoidance test)을 실시하였다. 일반적으로 마우스를 조명이 있는 방에 넣으면 어두운 곳으로 가려고 하는 습성이 있으므로, 이를 이용하여 조명이 없는 방에 들어갈 때 바닥에 설치된 철망(stainless grid)을 통해 전기적 쇼크를 주게 된다.
- 물-미로 실험은 실험동물이 수조 주변의 표지물을 기억하여 찾아가기 때문에 주변 환경의 변화가 없도록 표지물의 위치를 실험기간 동안 일정하게 유지하였고, 120초 안에 도피대를 찾지 못할 경우 실험동물을 도피대로 유도하여 10초 동안 머물며 위치를 기억하도록 하였다. 실험 마지막 날에는 도피대를 제거하고, 30초 동안 도피대가 존재한 사분면에 머무는 시간(time spent in platform quadrant)을 측정하는 probe test를 실시하였다.
- 실험군은 정상군(SHAM), 스코폴라민만 단독으로 투여한 대조군(SCO), 스코폴라민과 定志丸을 동시에 투여한 실험군(SCO + JJH, 100 mg/kg, 200 mg/kg), 定志丸만 투여한 군(JJH, 100 mg/kg, 200 mg/kg)의 총 6개 그룹으로 나누고, 그룹 당 7마리의 마우스를 배정하여 실험을 진행하였다(Table 2).
- 실험은 5일 동안 하루에 3번씩 세 곳에서 입수 위치를 달리하여 우연에 의해 도피대를 찾아가는 가능성을 최소화하였다. 실험동물이 도피대를 찾아가 10초 이상 머무르는 경우, 도피대를 찾아갈 때까지 소요되는 시간을 탈출잠복기(escape latency)로 하였으며, 하루 3회 실시하여 나온 평균값을 평균탈출잠복기(mean escape latency)로 하였다. 천정에 카메라를 설치하여 컴퓨터 프로그램(Ethovision 3.
- 定志丸 300 g을 증류수 3 L에 넣고 100℃에서 4 시간 동안 전탕한 뒤 여과하였다. 여액을 rotary evaporator (Rotavapor R-220, BUCHI, Switzerland)를 이용하여 감압농축하고, 농축액을 -70℃의 온도에서 동결건조(Freezone 6, Laboconco, Germany)하였다. 定志丸 열수 추출물 33.
- 공포조건화 실험은 환경적 맥락 또는 조건자극을 전기쇼크와 연합시켜 학습과 기억을 평가하는 실험이다. 이 실험은 환경적 맥락 조건화(contextual fear conditioning)와 단서 조건화(cued fear conditioning)로 나눌 수 있으며, 훈련시행은 소리자극 (15초, 68~80db, 30 kHz)과 전기쇼크 (1초, 0.5 mA)를 짝지어 150초 간격을 두고 2회 시행하였다. 마지막 전기쇼크가 주어진 다음 60초 후에 마우스를 조건화 상자에서 꺼내어 24시간 뒤 다음과 같은 검사를 실시하였다.
- 3% fat-free dry milk-PBS에 일차항체를 1:1000의 희석배율로 overnight으로 붙이고, PBST용액으로 10분간 3회 세척한 뒤 이차항체를 3% fat-free dry milk-PBS에 넣어 1시간 동안 붙인 다음 PBST용액으로 다시 10분간 3회 세척하였다. 이후 enhanced chemoluminescence (ECL) 용액과 반응시켜 Amersham Chemiluminescent Immunoblotting Imaging (UVP, CA, USA) 장비를 이용하여 이미지를 촬영하였다.
- 이후 상층액 50 μl에 100 mM 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA, Invitrogen, USA)를 가하여 혼합한 후 실온에서 20분간 방치한 다음 Gemini XS fluorescence reader (Molcular Device, 미국)기를 사용하여 excitation 485 nm 및 emission 585 nm의 파장조건에서 형광강도를 측정하였다.
- 기억 및 인지 장애를 유발하는 물질인 스코폴라민을 투여하기 5일전부터 定志丸을 100 또는 200 mg/kg/day의 용량으로 경구 투여하였으며, 행동실험 실시기간 동안은 행동실험 개시 1시간 전에 경구 투여하였다. 이후, 행동실험 30분 전 스코폴라민을 1 mg/kg의 용량으로 복강으로 투여하였으며, Y-미로(Y-maze test), 모리스 물-미로(Morris water-maze test), 수동회피(passive avoidance) 및 공포조건화(fear conditioning test) 실험을 실시하였다.
- 5 mA의 전기 자극이 5초 동안 바닥의 철망(stainless grid)을 통해 주어졌다. 장기 기억에 미치는 定志丸의 인지기능 회복효과를 확인하고자 24시간 후 다시 마우스를 밝은 쪽 방에 놓아 주고 전기 자극을 받았던 어두운 방으로 들어가는데 걸리는 시간(step-through latency time : 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다(유지 시험 : retention trial).
- 실험동물이 도피대를 찾아가 10초 이상 머무르는 경우, 도피대를 찾아갈 때까지 소요되는 시간을 탈출잠복기(escape latency)로 하였으며, 하루 3회 실시하여 나온 평균값을 평균탈출잠복기(mean escape latency)로 하였다. 천정에 카메라를 설치하여 컴퓨터 프로그램(Ethovision 3.1)을 이용하여 실험동물의 탈출잠복기를 기록하였다. 물-미로 실험은 실험동물이 수조 주변의 표지물을 기억하여 찾아가기 때문에 주변 환경의 변화가 없도록 표지물의 위치를 실험기간 동안 일정하게 유지하였고, 120초 안에 도피대를 찾지 못할 경우 실험동물을 도피대로 유도하여 10초 동안 머물며 위치를 기억하도록 하였다.
대상 데이터
- Y미로 실험에 이용되는 기구는 Y자 모양의 120° 각도를 이루는 세 개의 가지(arm, 길이 : 28 cm, 넓이 : 6 cm, 높이 : 18 cm)로 구성되어있으며, 흰색의 무광 아크릴 판으로 제작되었다.
- 여액을 rotary evaporator (Rotavapor R-220, BUCHI, Switzerland)를 이용하여 감압농축하고, 농축액을 -70℃의 온도에서 동결건조(Freezone 6, Laboconco, Germany)하였다. 定志丸 열수 추출물 33.1 g (수율 : 11%)을 수득하였으며, 4℃에 보관 후 매 실험 시 증류수에 녹여 사용하였다.
- 定志丸(Jeongjihwan, JJH)의 처방내용과 조성은 『備急千金要方』 9)에 준하였으며 약재는 계림약업사(대구)에서 구입하여 사용하였다(Table 1).
- 기억 및 인지 장애를 유발하기 위하여 스코폴라민(scopolamine, SCO)을 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하여 사용하였다. 定志丸(Jeongjihwan, JJH)의 처방내용과 조성은 『備急千金要方』 9)에 준하였으며 약재는 계림약업사(대구)에서 구입하여 사용하였다(Table 1).
- 효창사이언스(대구)에서 분양 받은 20-25 g 내외의 8주령 수컷 C57BL/6 마우스(C57BL/6 mouse)를 대구한의대학교 상동캠퍼스 사육실에서 3일 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 이때 사육실의 조건은 온도 22-24℃ 및 습도 55-65%, 낮 12시간-밤 12시간 조명주기로 설정하였다.
데이터처리
- 0 프로그램을 사용하여 하였다. 스코폴라민으로 유도된 기억 및 인지능 손상에 대한 定志丸의 효능을 평가하기 위하여 일원배치 분산분석 (one way ANOVA)을 수행하였으며 다중분석을 위하여 Turkey test 사후검정을 실시하였다. 그룹 간 유의성은 통계수치 p값이 0.
- 실험결과는 평균 ± 표준오차 또는 평균 ± 표준편차로 나타내었으며, 통계 처리를 위하여 SPSS Version 16.0 프로그램을 사용하여 하였다.
성능/효과
- 定志丸이 인지 및 기억력 향상효과를 갖는 또 다른 작용 기전으로, 장기기억 형성과 밀접한 관련이 있다고 알려진 신경영양인자(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)의 발현 및 상위 조절 단백질의 활성을 검토하는 일련의 실험을 수행하였다. BDNF의 발현은 스코폴라민 투여(SCO)로 인하여 영향을 받지 않았지만, 定志丸을 함께 투여(SCO + JJH)함으로써 현저히 증가됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 8A). 한편, 이러한 BDNF의 발현 조절에는 다양한 상위 전사인자가 관여하는 것으로 알려져 있으며, 특히 최근 c-AMP-response element-binding protein (CREB)가 주목을 받고 있다.
- 각기 다른 모양의 표지를 파악하여 순차적으로 미로를 들어가는 상대적 빈도를 측정한 변경 행동력 점수(spontaneous alteration, %)에서 정상군(SHAM), 스코폴라민만 단독으로 투여한 대조군(SCO), 스코폴라민과 定志丸을 동시에 투여한 실험군(SCO + JJH), 定志丸만 투여한 군(JJH) 사이에 통계적으로 유의한 차이를 관찰 할 수 있었다. 즉, 스코폴라민(1 mg/kg, i.
- 7B) 발현이 증가되는 것으로 보아 GSH 생합성의 증가는 定志丸 투여에 의한 γ-GCL 발현 증가에 의한 것임을 알 수 있었다. 또한 세포내 항산화 방어기작의 하나로 활성산소종의 하나인 superoxide를 산소와 과산화수소로 분해하는 반응을 촉매하는 superoxide dismutase (SOD)의 발현을 검토한 결과, SOD 단백질 발현 또한 定志丸 투여에 의해 증가되는 것을 관찰 할 수 있었다(Fig. 7B). 즉, 定志丸은 항산화 효소인 γ-GCL와 SOD의 발현 및 항산화 물질 GSH 생합성을 증가 시켜 산화적 스트레스로 부터 신경세포를 보호하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 수동회피실험에서 스코폴라민으로 기억력 손상을 유발한 실험동물은 전기적 쇼크를 기억하지 못하여 어두운 쪽 방으로 이동하는데 걸린 시간(step-through latency)이 짧았지만, 定志丸을 경구 섭취시킨 실험동물은 이러한 머무름 시간이 정상군과 유사한 수치로 길어졌다. 마지막으로 공포조건화 실험을 수행한 결과 해마-의존적인 기억력을 측정하는 맥락조건화 실험과 편도체-의존적인 기억력을 측정하는 단서조건화 실험에서 스코폴라민으로 인해 감소한 동결반응(freezing response)이 定志丸을 투여함으로써 현저히 증가되었다. 이전 연구에 따르면 定志丸은 중대뇌동맥 폐색으로 인한 국소 뇌허혈 모델에서 Morris water-maze로 공간 기억력을 측정한 결과 허혈로 인한 인지 및 기억력 손상에 대한 보호 효능을 나타내었다26).
- Y-미로 실험에서 스코폴라민을 복강으로 주입한 경우 기억력이 손상되어 % 변경행동력(% spontaneous alteration)이 감소되었으며, 이는 定志丸을 지속적으로 투여함으로써 정상군과 유사한 수준으로 증가되었다. 물-미로 실험에서 스코폴라민을 투여받은 그룹은 5일간의 훈련기간 동안 숨겨진 도피대를 찾아가는데 걸리는 평균탈출잠복기(mean escape latency)가 현저히 단축되지 못하였으나, 定志丸을 투여한 그룹에서는 훈련일이 증가할수록 기억력이 급격히 향상되어 빠른 시간에 도피대를 찾아 갈 수 있었다. 수동회피실험에서 스코폴라민으로 기억력 손상을 유발한 실험동물은 전기적 쇼크를 기억하지 못하여 어두운 쪽 방으로 이동하는데 걸린 시간(step-through latency)이 짧았지만, 定志丸을 경구 섭취시킨 실험동물은 이러한 머무름 시간이 정상군과 유사한 수치로 길어졌다.
- . 본 연구에서 Y-미로(Y-maze), 모리스 물-미로(Morris water-maze), 수동회피(passive avoidance), 공포조건화(fear conditioning) 등의 다양한 행동실험을 실시한 결과 스코폴라민으로 유도된 인지 및 기억력 손상은 定志丸을 투여함으로써 현저히 회복되었다.
- 그 중 신경세포 성장인자 (brain-derived neurotrophic factor, BDNF)는 neurotrophin family에 속하는 내인성 단백질로 다양한 신경독성 인자로부터 신경세포를 보호하고, 신경발달, 중추 및 말초 신경세포의 유지에 중요한 역할을 한다32). 본 연구에서 定志丸은 이러한 BDNF의 단백질 발현을 증가시키는 효능을 나타내었다. 이전 연구에 따르면 비선택적 무스카린 아세틸콜린 수용체 효능제(agonist)인 필로카르핀(pilocarpine)의 경우 콜린 신경계를 강화하며 해마부위에서 BDNF의 mRNA 발현을 증가시켰으며 해마-의존적 기억력 손상을 억제하였다33).
- 대표적인 항치매 약재로 알려져 많은 연구가 이루어진 원지로부터 분리한 polygalasaponin XXXII 성분 및 중국석송으로부터 분리한 huperzine 성분 또한 ERK1/2 및 CREB를 활성화 시키고, BDNF의 발현을 증가시켜 스코폴라민으로 유도한 해마-의존적 기억력 손상에 대하여 보호효능을 보였다41). 본 연구에서 定志丸은 특히 ERK1/2와 PKB/Akt 활성화를 통하여 CREB를 인산화 시킴으로써 BDNF의 발현을 증가시키는 효능을 나타내었다.
- 본 연구에서 스코폴라민을 장기간 투여한 경우 활성산소종의 생성 증가 및 내인성 항산화 물질 GSH 감소, 지질과산화 등의 산화적 손상이 유발되었으며 이는 定志丸을 투여함으로써 효과적으로 억제되었다. GSH는 세 개의 펩타이드로 구성된 대표적인 내인성 항산화 물질로 세포 성장, 사멸억제, 면역조절, 활성 산소 소거, 무독화 과정에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다29).
- 스코폴라민(1 mg/kg) 복강투여에 의해 유도되는 인지 및 기억력 손상은 定志丸(100 mg/kg 및 200 mg/kg) 경구투여에 의해 효과적으로 회복되었으며 이는 기억력을 측정하는 다양한 행동 실험(Y-미로, 모리스 물-미로, 수동회피, 공포조건화 실험)으로 확인하였다.
- 실험동물이 주변의 지표를 기억하여 숨겨진 도피대(platform)를 찾아가는 데까지 걸리는 평균탈출잠복기(mean escape latency)를 측정한 결과, 정상군(SHAM)과 스코폴라민만 투여한 대조군(SCO)의 경우 훈련 셋째, 넷째, 다섯째 날 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 스코폴라민만 단독으로 투여한 대조군(SCO)의 경우 실험실시 기간 동안 평균탈출시간이 느린 속도로 감소하였으며, 반면 스코폴라민과 定志丸을 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)에서는 훈련 진행과정에서 평균탈출잠복기의 감소 정도가 스코폴라민만을 투여한 실험군(SCO)에 비하여 유의성 있게 증가되었다(Fig. 2A). 특히 훈련 5일째 probe test에서 스코폴라민 투여군(SCO)의 경우 다른 군에 비하여 도피대가 있던 영역에 머무르는 시간(time spent in the platform quadrant)이 현저히 감소되었으며, 이에 반해 定志丸을 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)에서는 도피대가 있던 자리를 기억하고 그 주변에 머무르는 시간이 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 따라서, 실험동물이 전기적 쇼크를 받았던 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 수동회피의 학습과 인지능력이 좋음을 나타낸다. 스코폴라민을 단독으로 투여한 대조군(SCO)의 경우 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 다른 군에 비하여 통계적으로 유의하게 감소되었으며, 반면 定志丸을 동시에 투여한 실험군(SCO + JJH)의 경우 현저히 증가됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 3).
- 스코폴라민을 마우스에 단독으로 투여한 결과(SCO) 세포내 GSH 합성이 83.63 ± 9.42%로 저해 되었으며, 반면 定志丸을 100 mg/kg 및 200 mg/kg의 용량으로 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)의 경우 스코폴라민 투여군(SCO)에 비하여 각각 92.19 ± 6.49% 및 107.85 ± 9.52%로 합성이 증가되었다(Fig. 6A).
- 단서 조건화 실험은 편도체-의존적 기억력을 측정하는 실험으로 훈련시행과 동일한 조건의 소리자극을 제시할 때 나타나는 공포로 인한 동결반응을 측정하게 된다. 스코폴라민의 투여로 인지기능이 감소한 실험동물(SCO)에서는 맥락 조건화(Fig. 4A)와 단서 조건화(Fig. 4B)에 대한 동결반응 시간(freezing time)이 다른 군에 비해 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다. 한편, 定志丸을 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)에서는 이러한 동결반응 시간이 현저히 증가되어 해마-의존적(Fig.
- 실험동물이 주변의 지표를 기억하여 숨겨진 도피대(platform)를 찾아가는 데까지 걸리는 평균탈출잠복기(mean escape latency)를 측정한 결과, 정상군(SHAM)과 스코폴라민만 투여한 대조군(SCO)의 경우 훈련 셋째, 넷째, 다섯째 날 통계적으로 유의한 차이를 보였다. 스코폴라민만 단독으로 투여한 대조군(SCO)의 경우 실험실시 기간 동안 평균탈출시간이 느린 속도로 감소하였으며, 반면 스코폴라민과 定志丸을 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)에서는 훈련 진행과정에서 평균탈출잠복기의 감소 정도가 스코폴라민만을 투여한 실험군(SCO)에 비하여 유의성 있게 증가되었다(Fig.
- 실험장비는 원형 물탱크(stainless steel pool : 직경 120 cm, 높이 45 cm) 안에 물(수온 22±2℃)을 32 cm 높이로 채우고, 4분면의 한 구획에 도피대(escape platform, 직경 10 cm, 높이 30 cm)를 수면 2 cm 아래 위치하도록 설치하고 흰색의 색소를 풀어 보이지 않게 하였다. 실험은 5일 동안 하루에 3번씩 세 곳에서 입수 위치를 달리하여 우연에 의해 도피대를 찾아가는 가능성을 최소화하였다. 실험동물이 도피대를 찾아가 10초 이상 머무르는 경우, 도피대를 찾아갈 때까지 소요되는 시간을 탈출잠복기(escape latency)로 하였으며, 하루 3회 실시하여 나온 평균값을 평균탈출잠복기(mean escape latency)로 하였다.
- 즉, 定志丸은 항산화 효소인 γ-GCL와 SOD의 발현 및 항산화 물질 GSH 생합성을 증가 시켜 산화적 스트레스로 부터 신경세포를 보호하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 즉, 스코폴라민(1 mg/kg, i.p.)만을 단독으로 투여한 대조군(SCO)의 경우 기억력이 손상되어 변경 행동력 점수가 50.44 ± 1.48 %로 정상군(SHAM), 스코폴라민과 定志丸을 동시에 투여한 실험군(SCO + JJH), 그리고 定志丸만 투여한 군(JJH)과 비교하여 감소되었으며, 이는 定志丸을 투여한 실험군(SCO + JJH)에서 현저히 증가되어 통계적으로 유의한 인지 기억력 향상 효과를 보여 주었다(Fig. 1A).
- 2A). 특히 훈련 5일째 probe test에서 스코폴라민 투여군(SCO)의 경우 다른 군에 비하여 도피대가 있던 영역에 머무르는 시간(time spent in the platform quadrant)이 현저히 감소되었으며, 이에 반해 定志丸을 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)에서는 도피대가 있던 자리를 기억하고 그 주변에 머무르는 시간이 증가함을 확인 할 수 있었다(Fig. 2B). 훈련실시 기간 동안(첫째, 셋째, 다섯째 날) 각 그룹의 대표적인 이동 경로를 Fig.
- 4B)에 대한 동결반응 시간(freezing time)이 다른 군에 비해 현저히 감소하는 것을 볼 수 있었다. 한편, 定志丸을 함께 투여한 실험군(SCO + JJH)에서는 이러한 동결반응 시간이 현저히 증가되어 해마-의존적(Fig. 4A) 및 편도체의존적(Fig. 4B) 기억력이 용량 의존적으로 회복됨을 확인 할 수 있었다. 특히, 定志丸을 단독으로 투여한 그룹의 경우(JJH) 정상군(SHAM)과 비교하여 더 높은 동결반응 수치를 나타내었다.
후속연구
- 본 방에 사용된 人蔘은 元氣를 補하고 開心益智, 安精神定魂魄하며, 茯苓은 益脾寧心의 효능이 있으며, 遠志는 心腎으로 들어가 安神益智하고 豁痰利竅하여 心氣를 開通하고, 石菖蒲는 神明을 통하고 心竅를 막은 痰을 제거함으로써 神氣를 通暢케하여24), 전체적으로 定志丸은 心氣不足하고 痰이 心竅를 막아 나타나는 驚悸不安과 健忘에 효과가 있어 알츠하이머 치매환자의 기억력 장애 개선에도 효과가 있을 것으로 기대된다.
- 이상의 결과는 定志丸이 항산화 기능을 가짐으로 산화적 손상을 억제하고 신경영양인자의 활성화를 유도하여 신경세포 보호함으로써 건망증을 포함한 기억력 손상 관련 질환의 예방 및 치료제 활용될 수 있음을 시사한다.
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