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문제 정의
- 예로부터 동의보감에서 신장의 기를 보하고 두풍을 낫게 한다고 알려졌으며 두통, 이명 고열증상을 개선하는데 탁월한 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 scopolamine으로 치매 유발한 ICR-mouse에 미치는 산수유 열수 추출물의 효과에 대해 살펴보고 그 결과를 보고하는 바이다.
- 산수유가 항치매 효과 및 기전에 미치는 영향을 살펴보고자 본 연구를 진행하였다. 동물 실험은 ICR-mouse에 산수유 열수 추출물의 4주간의 투여(p.
제안 방법
- 위와 같은 방법으로 실험동물이 우측 방으로 120초 동안 이동하지 않을 때까지 반복하였다. 1차 측정 24시간 후 문이 열려도 밝은 방에 머무는 시간, 즉 쇼크실 도달시간(stepthrough latency time: 머무름 시간)을 최대 300초 (cut-off time)까지 측정하였다.
- CREB은 cAMP response element-binding transcription factor로써,22)BDNF와 tyrosine hydroxylase에 의해 조절되고 장기 기억력 형성에 관여 하는 인자로 알려져 있다.23) 본 실험은 산수유 추출물을 4주 투여하였을 때, 뇌 조직의 BDNF와 pCREB(ser133) 단백질 발현에 미치는 영향을 Western blot 및 면역화학염색(IHC stainning)을 통해 확인하였다.
- BDNF 항체(Santa cruz, USA)와 p-CREB(ser133) 항체(Santa cruz, USA)를 4ºC에서 하루 밤 반응시킨 후 PBS로 5분씩 3회 수세하고, peroxidase가 결합되어 있는 anti-IgG로 반응시킨 후 다시 수세과정을 거쳐 3.3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)로 발색시켰다.
- Immunohistochemistry staining − 적출한 뇌 조직의 주변의 조직들을 깨끗이 제거한 후 Bouin 용액에 고정하고 순차적 농도의 에탄올을 이용하여 탈수시킨 후, 투명과정을 거쳐 파라핀을 침투시켰다.
- 1×PBST buffer로 10 min, 3회 washing 후, Primary antibody인 BDNF(Santa cruz, USA), p-CREB(Ser133), total-CREB(Santa cruz, USA) 처리한 후 4ºC overnight 반응시켜, 1× PBST buffer로 10 min, 3회 washing 한다. Western Blot detection kit(Biorad, hercules, USA)을 이용하여 membrane과 반응시킨 후 Chemi-Doc 장비를 이용하여 발현 정도를 관찰하였으며, GAPDH, total-CREB으로 보정하여 비교하였다.
- 간 효소치(혈청 생화학 검사)에 미치는 영향 − 시료투여 4주째 모든 ICR-mouse를 CO2가스 마취 하에서 개복한 후에 복부 대동맥에서 혈액을 채취하였으며, 간 독성 지표로 알려진 alanine transferase(ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 측정을 통해 간 내 독성 평가 결과를 Table IV에 나타내었다.
- 단백질 분해효소에 의한 항원성의 부활과 열처리에 의한 항원성의 회복 방법을 이용하여 항원성을 충분히 부활시킨 후, 메탄올에 3% 농도가 되게 과산화수소를 넣은 혼합용액을 만들어 절편에 처리함으로써 내인성 효소활성을 제거하였다. 그 다음 2% goat serum을 30분간 처리하여 Ig G의 비 특이적 결합을 차단시켰다. BDNF 항체(Santa cruz, USA)와 p-CREB(ser133) 항체(Santa cruz, USA)를 4ºC에서 하루 밤 반응시킨 후 PBS로 5분씩 3회 수세하고, peroxidase가 결합되어 있는 anti-IgG로 반응시킨 후 다시 수세과정을 거쳐 3.
- 저자등은 우선 1965년부터 2015년 05월 검색한 시점까지의 치매 치료용 본초 생약 연구 분야에서 방제만을 대상으로 연구한 논문을 대상으로 한의약학계의 한약을 활용한 치매 연구를 조사하였다. 그중에서 OASIS(Oriental Medicine Advanced Searching Integrated System)를 통해 살펴본 치매 관련 방제 8건(반하백출천마탕, 사물탕, 육미지황탕, 천왕보심단, 황련해독탕, 생맥산, 삼령백출산, 팔미지황탕)과 이들의 구성본초 중 가장 많이 쓰이는 진피, 백작약, 당귀, 숙지황, 오미자, 산조인, 인삼을 선정하여 Pubmed에서 연구논문의 동향을 분석하였다.
- 뇌 균질액 50 μL를 1% hydroxylamine 50 μL를 첨가하여 혼합한 후 FeCl3(10% in 0.1N HCl) 500μL를 첨가한 다음 490 nm에서 측정하여 아세틸콜린 함량을 측정하였다.
- 로 마취시켜 개복한 후 1 mL 주사기를 이용하여 복부대정맥에서 채혈하였다. 뇌는 장기를 적출하여 생리식염수에 세척한 후 여지로 수분을 제거하고 무게를 측정하였다.
- 뇌조직의 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)활성저해효과 측정 − 효소활성저해효과는 acetylcholine iodide를 기질로 사용하는 방법13)을 변형하여 분석하였다.
- 각 개체의 조직마다 임의로 슬라이드 선택하여 xylene으로 탈 파라핀한 후, 다시 함수 과정을 거쳤다. 단백질 분해효소에 의한 항원성의 부활과 열처리에 의한 항원성의 회복 방법을 이용하여 항원성을 충분히 부활시킨 후, 메탄올에 3% 농도가 되게 과산화수소를 넣은 혼합용액을 만들어 절편에 처리함으로써 내인성 효소활성을 제거하였다. 그 다음 2% goat serum을 30분간 처리하여 Ig G의 비 특이적 결합을 차단시켰다.
- 산수유가 항치매 효과 및 기전에 미치는 영향을 살펴보고자 본 연구를 진행하였다. 동물 실험은 ICR-mouse에 산수유 열수 추출물의 4주간의 투여(p.o.) 하였으며, Normal군(정상군)을 제외한 모든군에 scopolamine 복강주사에 의해 치매를 유도한 후, 기억 및 학습에 미치는 효과(행동실험), 뇌 조직의 아세틸콜린 관련 효소계에 미치는 영향과 기억 관련 인자인 BDNF, pCREB 단백질 발현을 western blot 및 면역화학염색(IHC staining)을 통해 살펴보았다. 산수유 추출물의 4주간 투여로 체중에는 크게 영향을 미치지 않았으며, 간 내 독성 지표로 알려진 AST, ALT 에서도 정상범위인 것을 확인할 수 있었다.
- 동물 처치 및 뇌 무게 측정 − 사육기간이 종료된 실험동물은 12시간 절식시킨 후, CO2로 마취시켜 개복한 후 1 mL 주사기를 이용하여 복부대정맥에서 채혈하였다.
- 또한 Table I과 같이 각 군당 10마리씩 총 5군으로 나누어 실험하였으며 정상군(0.9% saline)과 control군(치매유도군), positive control군(Tacrin 2 mg/kg), 시료 투여군인 C100군, C200군에는 scopolamine을 5 mg/kg 복강 투여 하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(샘타코 BIOKOREA, 한국)를 사용하였으며 음수는 자유 섭취시켰다.
- 본 연구에서는 치매에 처방되는 8가지 한방처방을 근거로 하여 다시 논문 검색을 통해 치매의 현재 연구현황에 대해 살펴본 뒤, 치매의 메카니즘이 정확히 규명이 되지 않은 방제를 선정하여 동물실험을 통해 치매 메카니즘에 작용하는 유효성을 규명하였다. 산수유 열수 추출물을 4주간 투여한 뒤, scopolamine을 복강 투여한 후 기억·학습 장애를 유발하여 실험동물의 학습수행 개선과 acetylcholine 및 관련 효소의 억제에 미치는 효과를 살펴보았으며 뇌 조직 및 기전에 미치는 영향에 대해 확인하였다.
- 혈청 생화학(간 효소치) 검사 − 채혈된 혈액은 실온에 30분간 응고시킨 후 3,000 rpm, 4ºC에서 15분간 원심분리 한 혈장을 분석시료로 사용하였다. 분리된 혈액 상층액은 혈청 생화학기(Roche Ltd., Basel, Switzerland)로 aspartateaminotransferase(AST), alanine aminotransferase(ALT)를 분석하였다.
- 이후 탈지분유를 풀어 platform이 보이지 않도록 하였다. 분면 중 platform이 없는 3개의 사분면에서 출발위치를 매번 변경하며 실험동물을 수조에 넣어 platform을 찾아가도록 하고 그 시간(escape latency)을 video tracking system을 이용하여 측정하였다.
- 산수유 100 g에 D.W 1리터를 가하고 총 6시간(3시간씩, 2회) 동안 100ºC로 가열한 후 여과하여 여액을 분리하였다.
- 산수유 열수 추출물을 4주간 투여한 뒤, scopolamine을 복강 투여한 후 기억·학습 장애를 유발하여 실험동물의 학습수행 개선과 acetylcholine 및 관련 효소의 억제에 미치는 효과를 살펴보았으며 뇌 조직 및 기전에 미치는 영향에 대해 확인하였다.
- 수동회피 실험 − 4주간의 산수유 추출물 섭취로 단기 기억 손상에 미치는 효과를 확인하기 위해 수동회피시험을 실시하였다.
- 수중미로실험 − 4주간의 산수유 추출물 섭취로 장기 기억손상에 미치는 효과를 확인하기 위해 공간학습 능력을 평가하는 Morris water maze test를 시행하였다.
- 수중미로실험 − 수중미로실험은 Morris의 방법11)을 modified 하여 디자인하였다.
- 수중미로측정 장치는 공간학습 및 기억력을 측정하는 장비로서 mouse용 원형 플랫폼 pool size는 (지름: 90 cm, 높이: 40 cm) 안에 물의 온도는 22 ± 1ºC가 되도록 유지하였으며, 원형수조에 가상의 사분면을 만들어 한쪽 사분면 중앙에 escape platform(지름: 8 cm)을 수면 아래 1.5 cm가 되도록 물 높이를 조절하였다.
- 시료 투여 − 산수유 열수 추출물을 in vivo 실험을 진행하고자, ICR-mouse의 체중 당 100, 200 mg/kg(0.9% 생리식염수 10 ml당 각각 100 mg, 200 mg이 포함된 용액)되도록 4주간 경구투여 하였으며, 기억손상을 유발하기 위해 인지시험 24시간 전에 대조군과 시료물질 투여군에 scopolamine hydrobromide(Sigma-Aldrich Co., USA)를 5 mg/kg용량으로 복강 투여하였다.
- 수중미로실험 − 4주간의 산수유 추출물 섭취로 장기 기억손상에 미치는 효과를 확인하기 위해 공간학습 능력을 평가하는 Morris water maze test를 시행하였다. 실험은 하루 1번씩 5일간 수중미로 학습실험을 실시하여 인지 능력 훈련을 실시 한 후, scopolamine 5 mg/kg 을 복강투여 한 뒤 본 실험을 실시하였다(Fig. 2).
- 저자등은 우선 1965년부터 2015년 05월 검색한 시점까지의 치매 치료용 본초 생약 연구 분야에서 방제만을 대상으로 연구한 논문을 대상으로 한의약학계의 한약을 활용한 치매 연구를 조사하였다. 그중에서 OASIS(Oriental Medicine Advanced Searching Integrated System)를 통해 살펴본 치매 관련 방제 8건(반하백출천마탕, 사물탕, 육미지황탕, 천왕보심단, 황련해독탕, 생맥산, 삼령백출산, 팔미지황탕)과 이들의 구성본초 중 가장 많이 쓰이는 진피, 백작약, 당귀, 숙지황, 오미자, 산조인, 인삼을 선정하여 Pubmed에서 연구논문의 동향을 분석하였다.
- 로 설정하여 실시하였다. 전체적인 연구 설계는 Scheme I과 같이 행동실험과 혈액생화학 검사, 뇌조직 검사를 하였다.
- 체중변화에 미치는 영향 − 각 실험군에 산수유 추출물을 4주간 투여한 후, scopolamine으로 치매를 유도한 ICRmouse의 체중 변화를 관찰한 결과를 Fig. 1에 나타내었다.
- 혈청 생화학(간 효소치) 검사 − 채혈된 혈액은 실온에 30분간 응고시킨 후 3,000 rpm, 4ºC에서 15분간 원심분리 한 혈장을 분석시료로 사용하였다.
대상 데이터
- 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB)로 발색시켰다. BDNF 항체와 p-CREB(ser133) 항체는 Santa cruz(USA)에서 구입하였으며, 희석 배율은 1:100으로 진행하였고, 현미경으로 100배의 배율로 사진을 촬영하였다.
- 9% saline)과 control군(치매유도군), positive control군(Tacrin 2 mg/kg), 시료 투여군인 C100군, C200군에는 scopolamine을 5 mg/kg 복강 투여 하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(샘타코 BIOKOREA, 한국)를 사용하였으며 음수는 자유 섭취시켰다. 해부 전 24시간 동안에는 물만 주고 절식하였다.
- 시약 및 기구 − 실험에 사용된 기기로는 Glass teflon homogenizer(대한과학, Korea), UV-spectrophotometer(Shimadzu UV-1201, Japan), High centrifuge(Hanil HMR1610V, Korea), Medical freezer(Sanyo, Japan), Passive avoidance test shuttle box(50×15×40 cm, electric grid floor, Ugo, Italy), Micro plate Reader(Bio-TEK, USA), Chemi-Doc(AZURE, Italy)을 사용하였다.
- 실험동물 및 식이 − 본 시험에 사용한 ICR-mouse계, 5주령 모델(수컷)을 샘타코 BIOKOREA(경기도 오산시, 한국)로부터 분양 받아 (주)동남의화학연구원 동물사(동물시설등록증: 제 412호)에서 일주일간 검역과 순화·사육을 거친 건강한 동물로 사육환경을 온도 22 ± 3ºC, 상대습도 50 ± 10%, 조명시간 12시간(07:00∼19:00)로 설정하여 실시하였다.
- 실험재료 및 조제 − 본 실험에 사용한 산수유(Cornusofficinalis S. et Z)는 구례산수유(전남 구례군)로 2015년 8월에 구매하여 경성대학교 약학대학교 손기호교수가 정확하게 감정한 후 음건하여 사용하였다.
- 이중 치매관련 언급은 많이 되었으나, 기전별 효능이 정확하게 연구되지 않은 산수유를 선정하여 연구대상 약물로 하였다.
- 측정기기는 내부가 두 개의 방으로 구성된 아크릴 상자(shuttle box 53 cm W×44 cm H×33 cm D, electric grid floor, Ugo, Italy)를 이용하였으며, 상자는 칸막이 문(connecting guillotine door; 10×10 cm)으로 반이 나누어져 있으며 바닥(grid floor)전체에 전기쇼크(scrambled foot-shock)를 가할 수 있는 장치가 되어 있다.
데이터처리
- 통계처리 −실험결과는 통계 처리하여 평균치와 표준편차를 계산하였으며, 각 군의 유의성 검정은 Statview program에서 Anova t-test를 이용하여 통계분석 하였다.
이론/모형
- Bradford assay16)를 이용하여 단백질을 정량 한 후, 단백질의 SDS-PAGE(Poly acrylamide Gel Electrophoresis)를 이용하여 size 별로 분리하였다. Semi-dry transfer system(Bio-Rad, USA)를 이용하여 NC(nitro cellulose) membrane에이동시킨 후 5% skim milk를 함유한 Blocking buffer(0.
- 뇌조직의 단백질 정량 − 단백질의 함량은 Lowry 등의 방법15)에 준하여 bovine serum albumin(Sigma Chemical Co., USA)을 기준으로 하여 측정하였다.
- 뇌조직의 아세틸콜린(acetylcholinesterase)함량 측정 −아세틸콜린 함량 측정은 Hestrin의 방법14)에 의하여 alkaline hydroxylamine을 가진 σ-acyl 유도물의 반응을 기초로 측정하였다.
- 수동회피시험 − 수동회피시험은 설치류의 working memoryability를 측정하는 방법12) 에 따라 측정하였다.
성능/효과
- p>전 세계적으로 치매 환자는 2009년 기준으로 3,500만 명으로 추정되고 있으며 2050년에는 1억 1,500만 명으로 예상 된다.1) 우리나라는 2000년도에 65세 이상 노인 인구의 구성비가 7%를 넘어 고령화 사회(Aging society)로 들어섰고 2022년에는 노인 인구가 전체의 14%가 넘는 고령 사회(Aged society)로 진입할 것으로 예측 된다.2)
- 25) 실험 결과 scopolamine에 의해 해마조직에서 BDNF, p-CREB 단백질 발현양이 감소되었으나 산수유 추출물 4주 투여로 tarcin을 투여한 P군과 p<0.05 유의수준으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- Cholinergic system의 장애 및 결손은 인지능력의 저하에 큰 영향을 미치며 AD의 진행과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다.29)본 연구에서는 scopolamine을 투여한 대조군과 산수유 열수 추출물을 4주간 경구 투여한 군을 비교했을 때, 산수유 4주 투여군에서 AchE의 inhibition이 유의적으로 감소하였으며 Ach의 함량이 증가함을 관찰할 수 있었다. 또한 scopolamine에 의해 CA3 hippocampal neuron 및 해마 조직이 손상되었으나, 산수유 4주 투여로 해마손상을 억제된 것을 H&E staining을 통해 확인 할 수 있었다.
- 이러한 방제들은 경험적으로 누적된 임상 자료를 확보할 수 있고 배합 처방의 안전성 및 다양성이 보장된다는 장점이 있으나, 서양의학의 약물에 비해 객관적 실험 모델 확립이 미비하다는 단점이 있다.8) 그러나 한약은 생체 기능의 조정을 기본 원리로 삼고 있으며 방제 안에 본초가 어울러져 복합적인 효능을 나타내고 있다. 최근에는 발병기전이 복합적인 만성질환 분야에 합성의약 개발전략이 대부분 실패하고 있으며 다양한 작용점에 대한 조절작용이 효과적이라고 인정하는 추세인데,9) 방제의 경우 복합물질로 여러 경로에 타깃으로 동시에 작용할 수 있으므로 치매 치료 분야에서 탁월한 가능성을 가지고 있다.
- 8). Control군의 해 부분에 p-CREB ser 133) 단백질 발현이 적은 것을 확인하였으며,25) 산수유 추출물 투여로 인하여 p-CREB 면역 화학염색결과 항체염색 부분이 BDNF 면역화학염색과 같이 해마 조직에서 발현 부위가 증가함을 확인할 수 있었다.
- Scopolamine 투여 후 본 실험에서는 Fig. 2와 같이 Control군 (치매유도군)의 경우 수중미로상의 platform의 위치를 찾아가는 시간이 정상군에 비해서 p<0.05 수준의 유의성으로 탈출시간이 증가하는 것을 확인하였으며, 이는 scopolamine으로 기억 손상을 일으킨 많은 치매 모델 실험결과와 유사한 결과로 장기기억(long-term memory) 손상이 제대로 유도된 것을 확인할 수 있었다.
- Scopolamine 투여 후, 단기 기억력이 손상여부를 확인한 결과 Fig. 3과 같이 3 mM의 전기 쇼크에도 불구하고, Normal군(정상군)과 비교하여 검은 방에 머무는 시간이 통계적으로 유의하게 길었다(p<0.05).
- 5와 같았다. Scopolamine으로 치매를 유도한 Control군의 BDNF 단백질 발현이 Normal군과 비교해 볼 때 약 1.5배 감소하였다. 이에 비해 C100군의 경우 Control 군에 비해 약 2배 BDNF 단백질 발현이 증가되었으며, 이는 p<0.
- 결과를 종합하여 볼 때, 치매를 유도한 ICR-mouse에 산수유 열수 추출물 4주 투여로 단기기억 및 장기기억과 관련된 행동실험 결과 기억 및 학습 증진에 효과적이었으며, 중추신경계의 아세틸콜린 관련 효소 활성에도 영향을 주는 것으로 확인되었다. 또한 기억과 학습을 조절하는 인자인 BDNF, p-CREB(ser133)의 단백질 발현을 직접적으로 조절하는 것으로 미루어 보아 산수유는 인지능력개선에 긍정적인 영향을 줄 것으로 사료된다.
- 얻어진 여액을 모두 합하여 동결건조를 통해 수분을 완전히 제거하여 건조된 추출물을 얻었다. 동결 건조 했을 때 최종적으로 얻은 시료량은 0.98g이었다(수율: 0.98%).
- 또한 scopolamine에 의해 CA3 hippocampal neuron 및 해마 조직이 손상되었으나, 산수유 4주 투여로 해마손상을 억제된 것을 H&E staining을 통해 확인 할 수 있었다.
- 또한, 아세틸콜린에스테라제 활성(acetylcholinesterase activity)의 경우, Control군(치매 유도군)에서 10.39±0.07 unit/mg protein으로 아세틸콜린에스테라제 효소 활성이 높았으나, C200군에서는 Control군(치매 유도군)보다 p<0.001 수준으로 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Table V, Fig. 4).
- 가스 마취 하에서 개복한 후에 복부 대동맥에서 혈액을 채취하였으며, 간 독성 지표로 알려진 alanine transferase(ALT)와 aspartate aminotransferase(AST) 측정을 통해 간 내 독성 평가 결과를 Table IV에 나타내었다. 마우스의 AST, ALT 정상범위는 각각 54~298 U/L(AST), 17~97 U/L(ALT)로, scopolamine 및 산수유 추출물은 간 내 독성을 일으키지 않음을 확인할 수 있었다.
- 먼저, 학습수행개선효과를 파악하기 위해 공간지각 및 장기기억을 평가하는 morris water maze test 및 단기기억을 평가하는 수동회피실험(passive avoidance test)을 수행한 결과 단기기억을 평가하는 수동회피능력시험에 비해 장기기억을 평가하는 water maze test에서 p<0.05 유의 수준을 확인할 수 있었다.
- 05수준으로 유의한 값으로 나타났다. 면역화학염색(IHC staining)의 경우도 western blot과 유사한 결과로, 해마조직에서 BDNF발현이 Normal군에서 가장 발현이 많이 된 것을 확인할 수 있었으며, 치매유도군인 Control군의 해마 조직에서 BDNF 단백질이 감소하였으나,24)산수유 추출물의 4주간의 투여로 인해, BDNF 단백질의 발현(화살표 표시)이 해마부분에서 증가함을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 산수유 추출물 4주간 투여는 cholinergic system에도 영향을 주어 뇌 조직의 아세틸콜린 함량은 증가하고, 아세틸콜린에스테라제 활성은 억제하였으며 통계처리 결과 유의적인 결과를 얻었다. 그러나 산수유 추출물의 농도 의존적으로 효소활성에 영향을 주지는 않았다.
- ) 하였으며, Normal군(정상군)을 제외한 모든군에 scopolamine 복강주사에 의해 치매를 유도한 후, 기억 및 학습에 미치는 효과(행동실험), 뇌 조직의 아세틸콜린 관련 효소계에 미치는 영향과 기억 관련 인자인 BDNF, pCREB 단백질 발현을 western blot 및 면역화학염색(IHC staining)을 통해 살펴보았다. 산수유 추출물의 4주간 투여로 체중에는 크게 영향을 미치지 않았으며, 간 내 독성 지표로 알려진 AST, ALT 에서도 정상범위인 것을 확인할 수 있었다.
- 한편, 산수유 추출물을 4주간 투여함으로써 수중미로상의 platform의 위치를 찾아가는 시간이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 수동회피실험 결과, 수중미로실험과 마찬가지로 scopolamine투여로 Control군에서 전기 쇼크에도 불구하고 검은 방에 머무는 시간이 긴 것을 확인되었다. 이는 학습시험 시 전기 충격을 기억하지 못한 것으로 판단되어, 단기기억 손상을 입은 것을 확인할 수 있었다.
- 1에 나타내었다. 실험기간 동안 Normal군(정상군), Control군(치매 유도군) 및 C100, C200군의 평균체중은 꾸준히 증가하는 경향을 보였으며, 치매 유도 약물 및 산수유 추출물 투여로 체중에는 크게 영향을 주지 않는 것으로 확인되었다(Table II).
- 아세틸콜린의함량(acetylcholine concentration)은 Control군은 26.12±1.76 μmol/mg protein(of brain tissue)로 Normal군의 32.65±3.67 μmol/mg protein(of brain tissue)에 비교하여 약 80% 감소하였다.
- 이상과 같은 결과는 산수유 추출물 투여가 장, 단기 기억조절에 영향을 미치며, 뇌 조직의 산화 스트레스에 대한 방어 활성에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 아울러 cholinergic system 기전 및 기억 학습을 매개하는 BDNF, pCREB 단백질을 직접적으로 조절하는 것으로 미루어 보아, 치매 치료제로서 가능성이 있다고 사료된다.
- 장기기억을 확인하는 실험인 수중미로실험 실시 결과,scopolamine투여한 Control군은 수중미로상의 platform의 위치를 찾아가는 시간이 지체됨을 통하여 장기기억 손상을 입은 것을 확인하였다. 한편, 산수유 추출물을 4주간 투여함으로써 수중미로상의 platform의 위치를 찾아가는 시간이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.
- 한편 Positive control군에서는 4주간 Tacrin을 섭취하여 scopolamine에 의한 기억손상이 Control군에 비해 현저하게 정상군의 방향으로 회복한 것을 확인할 수 있었다. 특히, C100군, C200군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있게 기억손상이 회복된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 기억과 학습을 조절하는 인자인 BDNF와 p-CREB(ser133)의 단백질 발현 또한 C100군, C200군(산수유 추출물 200 mg/kg투여군)에서 Control군 대비하여 단백질 발현이 증가하였다. 특히, C100군에서 유의적인 결과를 나타내었으며, 면역화학염색에서도 BDNF와 p-CREB 단백질의 발현이 증가한 경향을 확인 할 수 있었다.
- 한편 C100군, C200 군의 아세틸콜린 함량은 각각 31.97±2.47, 32.92±1.81 μmol/mg protein(of brain tissue)로 Control군과 비교해볼 때, p<0.001수준으로 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있었다.
- 한편 Positive control군에서는 4주간 Tacrin을 섭취하여 scopolamine에 의한 기억손상이 Control군에 비해 현저하게 정상군의 방향으로 회복한 것을 확인할 수 있었다. 특히, C100군, C200군에서는 대조군과 비교하여 유의성 있게 기억손상이 회복된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 한편 산수유 추출물 4주간의 투여는 기억과 학습을 조절하는 인자인 BDNF, p-CREB단백질도 조절하는 것으로 확인되었다. CREB 단백질의 경우, cAMP response elementbinding protein 로 동물이 배우고 기억하는 데 뇌의 특정 신경세포가 활성화되는데 관여하는 인자이다.
- 장기기억을 확인하는 실험인 수중미로실험 실시 결과,scopolamine투여한 Control군은 수중미로상의 platform의 위치를 찾아가는 시간이 지체됨을 통하여 장기기억 손상을 입은 것을 확인하였다. 한편, 산수유 추출물을 4주간 투여함으로써 수중미로상의 platform의 위치를 찾아가는 시간이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다. 수동회피실험 결과, 수중미로실험과 마찬가지로 scopolamine투여로 Control군에서 전기 쇼크에도 불구하고 검은 방에 머무는 시간이 긴 것을 확인되었다.
후속연구
- 결과를 종합하여 볼 때, 치매를 유도한 ICR-mouse에 산수유 열수 추출물 4주 투여로 단기기억 및 장기기억과 관련된 행동실험 결과 기억 및 학습 증진에 효과적이었으며, 중추신경계의 아세틸콜린 관련 효소 활성에도 영향을 주는 것으로 확인되었다. 또한 기억과 학습을 조절하는 인자인 BDNF, p-CREB(ser133)의 단백질 발현을 직접적으로 조절하는 것으로 미루어 보아 산수유는 인지능력개선에 긍정적인 영향을 줄 것으로 사료된다.
- 이상과 같은 결과는 산수유 추출물 투여가 장, 단기 기억조절에 영향을 미치며, 뇌 조직의 산화 스트레스에 대한 방어 활성에 영향을 주는 것을 확인할 수 있었다. 아울러 cholinergic system 기전 및 기억 학습을 매개하는 BDNF, pCREB 단백질을 직접적으로 조절하는 것으로 미루어 보아, 치매 치료제로서 가능성이 있다고 사료된다.
- 즉, 치매에서 아세틸콜린 함량은 감소하며 아세틸콜린에스테라제 활성이 증가한다는 보고를 고려했을 때, 산수유추출물의 4주간 투여로 치매를 유도한 뇌 조직의 아세틸콜린 함량 및 아세틸콜린에스테라제 활성에 유의적인 영향을 미침에 따라, 치매의 예방에 도움이 될 것으로 사료된다.
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