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문제 정의
- 단회투여독성 시험은 장기투여 독성 시험과 생식ㆍ발생독성시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자료를 제공하고, 안전성을 확보하고자 하였다. 한국식품의약품안전청 고시 [2009-116]에 따라 EPP 2,000, 1,000 및 500 mg/kg의 농도로 단회 경구 투여한 다음 14일간 체중 및 임상증상을 관찰하였으며, 14일 후 최종 부검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기 중량, 육안 부검 및 조직병리학적 관찰을 실시한 결과, 단회투여 독성 시험에서 설치류 최대 한계투여 용량인 2,000 mg/kg까지 EPP 투여와 관련된 사망례가 인정되지 않았으며, EPP 투여와 관련된 장기중량 및 육안 부검소견 역시 인정되지 않았고, 3 용량의 모든 수컷 투여군에 국한된 일시적인 軟便 소견을 제외하고, EPP 투여와 관련된 임상증상 역시 인정되지 않았다.
- 이에 저자는 자극성과 부작용이 없고, 滋養强壯의 효능이 강한 九蒸黃精을 이용한 건강보조식품 개발 가능성에 관심을 두고, 단회 투여 독성실험을 실시하였으며 본 실험에서는 九蒸黃精의 안전성에 대한 객관적 근거를 확보하기 위해 일반 독성시험 중현재 한국식품의약품안전청 고시 제 2009-116호 의약품 등의 독성시험기준9)에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성시험을 실시하고자 하였다.
제안 방법
- EPP 투여와 관련 있는 사망례는 실험 전 기간동안 관찰되지 않아, 모든 실험동물 (5/5; 100%)을 최종부검을 실시하였다 (Table 1).
- 이에 저자는 마우스 단일투여 독성 실험을 시행하였다. EPP의 일반적인 독성시험 중 현재 한국 식품의약품안전청 고시 의약품 등의 독성시험기준에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성 시험을 실시하였다.
- 各等分), 二味相和, 搗作餅子, 焙乾為末, 煉蜜為丸, 梧桐子大, 每服五十九, 空心溫酒送下'라 하여 腎虛精滑한 증상에 應用하였고,《古今醫統大全：螽斯廣育》15)에서는 '還真二七丹壯顏容, 健筋骨, 添精補隨, 烏鬚黑髮, 久服通仙. 何首烏 (忌鐵器), 黑椹子, 生地黃, 旱蓮草 (以上四味俱用鮮者, 以石臼內搗, 各取汁半斤), 鹿角膠, 生薑汁, 白蜜 (半斤), 黃精 (九蒸九晒), 人參, 白茯苓, 小茴香, 枸杞子, 鹿角霜 (各四兩), 秦椒 (一兩. 共為末用), 上除蜜另煉外, 以諸汁熬將成膏, 方入蜜攪勻, 然後下人參等六味末藥, 又和勻以新瓷瓶收貯, 隨時以溫熱酒調下二三匙, 夏月以白湯調.'라 하여 筋骨을 튼튼히하고, 精髓를 補養시키고, 모발과 수염을 검게하는 효능으로 임상에 다용되 었다.
- 甘州枸杞子, 黃精 (九蒸九晒. 各等分), 二味相和, 搗作餅子, 焙乾為末, 煉蜜為丸, 梧桐子大, 每服五十九, 空心溫酒送下'라 하여 腎虛精滑한 증상에 應用하였고,《古今醫統大全：螽斯廣育》15)에서는 '還真二七丹壯顏容, 健筋骨, 添精補隨, 烏鬚黑髮, 久服通仙.
- 를 기초하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일반증상을 관찰, 기록하였으며, 투여일 이후에도 하루에 최소한 2번씩 모든 실험동물의 임상증상을 관찰, 기록하였다. 또한 모든 실험동물의 체중을 투여 전 1일, 투여직전, 투여 후 1, 2, 7, 13 및 14일 (최종 희생일)에 각각 측정하였으며, 실험 시작 시 개체 차이에 따른 체중의 변화를 최소화하기 위하여, 투여일～투여 후 7일, 투여 후 7일～13일 및 투여일～투여 후 14일간의 체중 증가 량인 증체량을 각각의 체중을 이용하여 산출하였다.
- 모든 실험동물은 육안부검 소견을 관찰 기록한 후 하기의 장기에 대한 절대 중량을 각각 측정하였으며, 체중의 변화에 수반된 이차적 변화를 최소화하기 위해 체중에 대한 각각의 장기 절대중량의 비율인 상대 중량을 산출하였다.
- 암수 각 20마리의 ICR 마우스 (6 wk old upon receipt, SLC, Japan)를 10일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화 과정 및 실험 전 기간 동안 온도 (20-25℃)와 습도 (30-35%)가 조절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료 (Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전절식을 실시하였으며 (이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다.
- 모든 실험동물의 임상증상을 투여 전후에 각각 functional observational battery test10,11)를 기초하여 동물의 행동, 자극에 대한 반응성, 각성도 및 경계성, 자세 및 보행 이상 등에 관한 일반증상을 관찰, 기록하였으며, 투여일 이후에도 하루에 최소한 2번씩 모든 실험동물의 임상증상을 관찰, 기록하였다. 또한 모든 실험동물의 체중을 투여 전 1일, 투여직전, 투여 후 1, 2, 7, 13 및 14일 (최종 희생일)에 각각 측정하였으며, 실험 시작 시 개체 차이에 따른 체중의 변화를 최소화하기 위하여, 투여일～투여 후 7일, 투여 후 7일～13일 및 투여일～투여 후 14일간의 체중 증가 량인 증체량을 각각의 체중을 이용하여 산출하였다.
- 또한 암수 각각에 대한 매체 대조군을 추가 하였으며, 실험동물은 암수 각각 군당 5마리씩 실험에 사용 하였다. 모든 투여군에서는 EPP을 멸균 증류수에 용해시켜 20 ml/kg의 용량으로 존데 (zonde)가 부착된 1 ml 주사기를 이용하여, 강제 경구투여하였다. 식이와 음수에 따른 약물의 흡수 변화를 최소화 하기 위해, 투여 후 대략 3시간 동안 사료와 음수 공급을 제한하였다.
- 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U (MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다. 반수치사량 및 95% 신뢰한계 (confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+ (moderate) 및 3+ (severe)로 구분하였다. 통계처리 및 Probit 방법은 SPSS for Windows (Release 14.
- 한국식품의약품 안전청 고시 제 2009-116호에 따르면, 설치류에서 투여한계 농도를 2,000 mg/kg 또는 최대 용해농도로 규정하고 있으며, 투여 용량은 용액의 경우 20 ml/kg, 현탁액인 경우 10 ml/kg을 넘지 못하게 규정하고 있다. 본 실험에서 사용한 EPP은 멸균 증류수에 100 mg/ml까지 비교적 잘 용해되었으며, 현재까지 독성에 대한 자료를 찾아 볼 수 없어, 멸균 증류수에 100 mg/ml의 농도까지 용해시켜 20 ml/kg의 용량 즉, 2,000 mg/kg을 최고 농도로 투여하였다.
- 본 연구는 구증황정을 제조하고 이것에 대한 벤조피렌 함량 분석을 HPLC를 이용하여 측정하였다. 또한 구증황정에 대한 단일투여독성 시험을 시행하였는데, 이는 한국식품의약품안전청 고시 [2009-116, 2009]에 따라 실시한 결과, 제조된 구증황정에는 벤조피렌이 함유되어 있지 않았다.
- 상기의 조직을 10% 중성포르말린에 18시간 이상 고정시킨다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 3 ㎛의 절편을 제작하였다. 이후 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하에서 이상 유무를 관찰, 기록하였다.
- 본 실험에 사용한 黃精 (Polygonatum sibiricum Redoute；Polygonati Rhizoma)은 충북 제천시 수산면 수리에서 김한종 씨가 재배한 7년생 黃精을 2005년 11월에 채취된 것을 구입하였다. 시료 제조를 위하여 生黃精을 옹기 (引月窯業, Korea)로 된 찜솥을 이용하여 2시간 증숙하였고, 증숙 후 꺼내어 12시간 원적외선 건조기(수붕산업, Korea)로 60℃에서 건조하으며, 위 과정을 9회 반복하여 九蒸黃精 (Polygonati Rhizoma Preparata)을 제조하였다.
- 암수 각 20마리의 ICR 마우스 (6 wk old upon receipt, SLC, Japan)를 10일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화 과정 및 실험 전 기간 동안 온도 (20-25℃)와 습도 (30-35%)가 조절된 사육실에서 마우스용 polycarbonate 사육상자에 5마리씩 수용하여 사육하였고, 명암 주기 (light : dark cycle)는 12시간 주기로 조절하였으며, 사료 (Samyang, Korea)와 음수는 자유롭게 공급하였다. 모든 실험동물은 투여일 및 최종 부검일 18시간 전절식을 실시하였으며 (이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다.
- 九蒸黃精 100 g에 각각 증류수 1,000 ㎖를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하고, 이를 감압 추출장치로 농축하였다. 위 과정을 3회 반복하였고, 3회 농축한 것을 다시 모아서 동결 건조기를 이용하여 완전 건조 (DLH-06001；35.4 g)하여 九蒸黃精抽出物 (extract of Polygonati Rhizoma Preparata ; EPP)을 제조하였고, 대구한의대학교 한의과대학 본초학교실에서 냉동 (-84℃) 보관하였으며, 사용시 적당한 농도로 희석하여 사용하였으며 나머지는 냉동보관 하였다.
- 본 연구에서 EPP에 대한 벤조피렌 함량을 분석한 결과 유의성 있는 결과는 보이지 않았다. 이에 저자는 마우스 단일투여 독성 실험을 시행하였다. EPP의 일반적인 독성시험 중 현재 한국 식품의약품안전청 고시 의약품 등의 독성시험기준에 명시되어 있는 마우스 경구 단회투여독성 시험을 실시하였다.
- 이후 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학현미경 하에서 이상 유무를 관찰, 기록하였다.
- 투여 14일 후 모든 실험동물은 이산화탄소 마취하에 부검을 실시하고, 주요 장기를 위주로 이상 육안소견을 각각 관찰, 기록 하였다.
- 현재까지 黃精 또는 九蒸黃精의 독성에 대한 보고를 찾아볼수 없어, 한국식품의약품안전청 고시 제 2009-116호에 의거하여9), 설치류 최고 한계투여용량인 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 설정하였으며, 공비 2로 1,000 및 500 mg/kg을 중간 및 저용량투여군으로 설정하였다. 또한 암수 각각에 대한 매체 대조군을 추가 하였으며, 실험동물은 암수 각각 군당 5마리씩 실험에 사용 하였다.
대상 데이터
- , 설치류 최고 한계투여용량인 2,000 mg/kg을 최고 용량으로 설정하였으며, 공비 2로 1,000 및 500 mg/kg을 중간 및 저용량투여군으로 설정하였다. 또한 암수 각각에 대한 매체 대조군을 추가 하였으며, 실험동물은 암수 각각 군당 5마리씩 실험에 사용 하였다. 모든 투여군에서는 EPP을 멸균 증류수에 용해시켜 20 ml/kg의 용량으로 존데 (zonde)가 부착된 1 ml 주사기를 이용하여, 강제 경구투여하였다.
- 본 실험에 사용한 黃精 (Polygonatum sibiricum Redoute；Polygonati Rhizoma)은 충북 제천시 수산면 수리에서 김한종 씨가 재배한 7년생 黃精을 2005년 11월에 채취된 것을 구입하였다. 시료 제조를 위하여 生黃精을 옹기 (引月窯業, Korea)로 된 찜솥을 이용하여 2시간 증숙하였고, 증숙 후 꺼내어 12시간 원적외선 건조기(수붕산업, Korea)로 60℃에서 건조하으며, 위 과정을 9회 반복하여 九蒸黃精 (Polygonati Rhizoma Preparata)을 제조하였다.
데이터처리
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다. 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 Scheffe test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U (MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다.
- 모든 수치는 평균 ± 표준편차로 표시하였으며, 다중비교검증을 이용하여 통계처리를 실시하였고, 분산동질성을 Levene test를 실시하여 검증하였다.
- 등분산일 경우, one way ANOVA test를 실시한 다음 Scheffe test로 사후 검증을 실시하여 군간의 유의성을 측정하였다. 비등분산일 경우에는 비모수 검증인 Kruskal-Wallis H test를 실시하여 유의성이 인정된 경우에는, Mann-Whitney U (MW) test를 실시하여 군간의 유의성을 검증 하였다. 반수치사량 및 95% 신뢰한계 (confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+ (moderate) 및 3+ (severe)로 구분하였다.
- 반수치사량 및 95% 신뢰한계 (confidence limits)를 Probit 방법으로 측정하였으며, 임상 증상, 육안부검 및 조직병리학적 소견은 각각 그 정도에 따라 0 (normal), 1+ (slight), 2+ (moderate) 및 3+ (severe)로 구분하였다. 통계처리 및 Probit 방법은 SPSS for Windows (Release 14.0K, SPSS Inc., USA)를 이용하여 평가하였으며, p-value가 0.05 이하인 경우 통계적 유의성을 인정하였다.
성능/효과
- 8) 또는 간의 국소 괴사 및 염증세포 침윤 (Fig. 9) 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었으며, EPP 암컷 1,000 mg/kg 및 수컷 500 mg/kg 투여군에 국한되어 각각 1례 (1/5; 20%)의 경미한 가슴샘 충혈 (Fig. 5)이 인정된 이외에 의미 있는 조직병리학적 이상 소견은 인정되지 않았다(Table 7, 8).
- 수컷생쥐 투여군에서 인정된 일시적인 軟便 소견을 제외하고, EPP 투여와 관련된 임상증상 역시 인정되지 않았다. EPP의 마우스에 있어서 반수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000 mg/kg 이상으로 관찰되었다. 500 mg/kg이상의 EPP 투여는 軟便과 같은 경미한 위장관 장애를 초래할 수 있을 것으로 판단되나, 그 정도가 경미하고 일시적으로 인정되어 임상사용에는 별 다른 문제를 일으키지는 않을 것으로 판단된다.
- 다양한 정도 [1 ~ 3+]의 폐 충출혈, 가슴샘 위축 (atrophy), 비장 위축, 하악임파절 종대 또는 자궁부종 소견이 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었으며, 암컷 2,000 mg/kg 투여군에 국한되어 경미 [1+]한 간의 비정형성 흰색반점 소견이 1례 (1/5; 20%) 인정된 이외에 의미 있는 육안 부검소견은 인정되지 않았다(Table 5, 6).
- 10029)에 따르면 일반적으로 반수 치사량이 5,000～15,000 mg/kg인 물질을 무독성 물질로, 5,00～5,000 mg/kg을 비교적 저독성 (Class III) 물질로 규정하고 있으나, 한국식품의약품 안전청 고시 제 2009-116호, 설치류에서 투여한계 농도를 2,000 mg/kg으로 제한하고 있다. 따라서 본 실험의 마우스 단회 경구투여 독성실험에서 EPP의 반수치사량 및 개략적 치사량은 각각 2,000 mg/kg 이상으로 관찰되었으며 무독성 물질로 판단된다고 사료된다.
- 따라서 여러 臨床醫書에서 九蒸黃精을 임상에서 활용하였는데,《本草備要》13)에서 '炮製 : 九蒸九晒用 (仙家以爲芝草之類, 服之長生)'라 하여 九蒸九曝한 黃精을 仙家의 靈藥으로 간주하여 복용하면 長生할 수 있다고 하였으며,《本草綱目》14)에서'黃精, 補肝明目, 同蔓荊子九蒸九晒為末, 日服之'라 하여 蔓荊子 와 같이 九蒸九晒하여 가루내어 복용하면 補肝明目 효능이 있다고 하였다.
- 한편 이들 부신 및간 중량을 포함하여, 본 실험에서 모든 실험동물의 체중 및 장기 중량은 동일한 주령의 마우스들의 정상 범주에 포함되어 관찰되 었다23,24). 모든 3 용량의 수컷 투여군에서 1 또는 2 례에 국한되어, 인정된 연변 소견은 출현빈도가 비교적 낮고, 투여 1일 후에 국한되어 일시적으로 인정되어 큰 의미는 없을 것으로 판단되나, 500 mg/kg 이상의 EPP 투여에 의해 연변 등의 경미한 소화기 장애가 초래될 가능성은 배제할 수 없다.
- 본 연구에서 EPP에 대한 벤조피렌 함량을 분석한 결과 유의성 있는 결과는 보이지 않았다. 이에 저자는 마우스 단일투여 독성 실험을 시행하였다.
- 수컷 1,000 mg/kg 투여군과 암컷 1,000 및 500mg/kg 투여 군에 국한되어 인정된 부신 또는 간 중량의 증가는 투여 용량 의존성이 인정되지 않아, EPP 투여와 관련된 변화는 아닌 것으로 판단되며, 부신과 간의 육안부검 및 조직병리학적 검사 결과에서도 의미 있는 이상 소견은 인정되지 않았다. 한편 이들 부신 및간 중량을 포함하여, 본 실험에서 모든 실험동물의 체중 및 장기 중량은 동일한 주령의 마우스들의 정상 범주에 포함되어 관찰되 었다23,24).
- 수컷 1,000 mg/kg 투여군에 국한되어 인정된 유의성 있는 (p<0.05) 부신 절대 및 상대 중량의 증가와 암컷 1,000 및 500 mg/kg 투여군에 국한되어 인정된 간 상대 중량의 유의성 있는 (p<0.05) 증가 이외에, EPP 투여와 관련된 의미 있는 장기중량의 변화는 인정되지 않았다(Table 3, 4).
- 육안 부검시 인정된 폐 충출혈, 가슴샘 및 비장 위축, 하악임 파절 종대 또는 자궁부종 소견과 조직병리학적 검사에서 관찰된폐 충출혈, 가슴샘 피질 임파구 감소, 신장 낭포 및 염증세포 침윤, 비장 임파구 감소 또는 간의 국소 괴사 및 염증세포 침윤 소견들은 암수 매체 대조군을 포함한 모든 실험군에 걸쳐 산발적으로 관찰되었으며, 용량 의존성이 인정되지 않아, EPP 투여와 관련 없는 우발적 병소로 판단되고, 암컷 2,000 mg/kg 투여군에서 육안부검 관찰 시 1례 인정된 간의 비정형성 흰색반점 소견은 조직병리학적 관찰 결과, 간의 표면에 위치한 중등도의 국소 괴사 및 염증세포 침윤소견으로 인정되었으며, 암컷 1,000mg/kg 및 수컷 500 mg/kg 투여군에 국한되어 각각 1례 (1/5; 20%) 인정된 가슴샘 충혈 소견 역시 출현빈도가 낮고, 용량 의존성이 전혀 인정되지 않아, EPP 투여와 관련된 독성 증상으로 간주하기는 어렵다. 한편 이들 병소들은 정상 마우스에서 드물게 인정되는 소견으로 알려져 있고25,26), 자궁은 estrus cycle에 따라 쉽게 변화할 수 있어27,28), 자궁 부종 소견은 estrus cycle에 따른 이차적 변화로 판단된다.
- 단회투여독성 시험은 장기투여 독성 시험과 생식ㆍ발생독성시험을 위시한 특수 독성시험에 대한 기초자료를 제공하고, 안전성을 확보하고자 하였다. 한국식품의약품안전청 고시 [2009-116]에 따라 EPP 2,000, 1,000 및 500 mg/kg의 농도로 단회 경구 투여한 다음 14일간 체중 및 임상증상을 관찰하였으며, 14일 후 최종 부검을 통하여 12개의 주요 장기에 대한 장기 중량, 육안 부검 및 조직병리학적 관찰을 실시한 결과, 단회투여 독성 시험에서 설치류 최대 한계투여 용량인 2,000 mg/kg까지 EPP 투여와 관련된 사망례가 인정되지 않았으며, EPP 투여와 관련된 장기중량 및 육안 부검소견 역시 인정되지 않았고, 3 용량의 모든 수컷 투여군에 국한된 일시적인 軟便 소견을 제외하고, EPP 투여와 관련된 임상증상 역시 인정되지 않았다.
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