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문제 정의
- 본 연구에서는 다낭성난소증후군에 수반되는 고콜레스테롤 혈증을 실험적으로 유발한 다음, 肉桂가 이러한 고콜레스테롤 혈증 조절을 통하여 궁극적으로 다낭성난소증후군의 치료에 도움을 줄 수 있다는 가설을 세우고 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- ß-Estradiol 17-valerate (EV, Sigma, USA) 1회 근육 주사법9)을 이용하여 다낭성난소증후군에 수반되는 고콜레스테롤 혈증을 유발하였다.
- 2주간의 구강 투여가 끝난 후, 백서로부터 심장 채혈의 방법으로 혈액을 얻었다. 얻어진 혈액은 원심분리기(Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여, 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 버리고 상층액을 취하였다.
- 5주 간의 약물투여가 끝난 후, 12시간 이상 식이를 중지한 다음 혈당측정기 (Roche, Germany)를 이용하여 공복 시 혈당(Fasting Blood Glucose, FBG)을 측정하였다. 공복 시 혈당을 측정 후, 모든 흰쥐에게 50% 농도의 D(+)-Glucose (Sigma, USA)를 1 g/㎏의 용량으로 경구 투여한 다음 30, 60, 90, 120분 째의 혈당변화를 관찰하였다10).
- 정상군(Normal group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증을 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 대조군(Control group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다. CC 투여군(CC group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증 유발시킨 후, CC 추출물을 2.5 g/kg으로 고형사료에 섞어 투여하였다. 자세한 고형 사료의 조성은 Table 1과 같다.
- 5주 간의 약물투여가 끝난 후, 12시간 이상 식이를 중지한 다음 혈당측정기 (Roche, Germany)를 이용하여 공복 시 혈당(Fasting Blood Glucose, FBG)을 측정하였다. 공복 시 혈당을 측정 후, 모든 흰쥐에게 50% 농도의 D(+)-Glucose (Sigma, USA)를 1 g/㎏의 용량으로 경구 투여한 다음 30, 60, 90, 120분 째의 혈당변화를 관찰하였다10).
- 이렇게 하여 얻어진 EV용액을 20 ㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 Sesame oil을 근육 주사하였다. 근육주사 후 2일간 관찰한 다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 정상군 (Normal group)은 EV를 녹이지 않은 Sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군 (Control group)과 실험군 (CC group)은 EV를 Sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다. 정상군(Normal group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증을 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 대조군(Control group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다.
- 본 연구에서는 다낭성난소증후군을 유발하는 물질인 Estradiol valerate를 이용하여 다낭성난소증후군에 흔히 수반되는 고콜레스테롤 혈증을 유발한 후, 5주간 肉桂를 투여하고 체중 변화에 미치는 영향을 관찰 한 다음, 공복시 혈당 (fasting blood glucose, FBG) 검사와 경구당부하 검사 (Oral glucose tolerance test, OGTT)를 시행한 후, 흰쥐의 심장에서 채취한 혈액으부터 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량 변화를 관찰하였다.
- 실험시작일 (day 1) 측정한 체중을 기준으로 5주간 매주 체중 변화를 관찰하였다. 체중의 측정은 매일 오후 2시에 전자저울(Hansung, 서울, 한국)을 이용하여 실시하였다.
- 얻어진 혈액은 원심분리기(Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 이용하여, 3000 rpm에서 15분간 원심분리하여 찌꺼기를 버리고 상층액을 취하였다. 얻어진 혈청에서 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride 함량 측정은 전용 Kit (아산제약, 서울, 한국)를 이용하여 측정하였다.
- 구입, 정선한 肉桂 100 g을 증류수 1,000 ㎖과 함께 전기약탕기 (대웅, 한국)을 이용하여 3시간 동안 전탕한 후, 거즈로 걸러 전탕액을 얻었다. 위의 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 동결건조기 (Labconco, Missouri, USA)를 이용하여 CC를 5.0 g을 얻었으며 수율은 5%였다.
- 45 mm Syringe Filter (Whatman, Springfield, UK)로 걸러 줌으로써 멸균을 대신하였다. 이렇게 하여 얻어진 EV용액을 20 ㎎/㎏의 분량으로 1회 근육 주사하였고, 정상군은 동일한 양의 Sesame oil을 근육 주사하였다. 근육주사 후 2일간 관찰한 다음, 5주간 약물을 투여하였다.
- 대조군 (Control group)과 실험군 (CC group)은 EV를 Sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다. 정상군(Normal group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증을 유발하지 않고, 5주간 정상식이를 투여하였고, 대조군(Control group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증 유발시킨 후, 5주간 정상 식이를 투여하였다. CC 투여군(CC group, n=8)은 고콜레스테롤 혈증 유발시킨 후, CC 추출물을 2.
- 실험시작일 (day 1) 측정한 체중을 기준으로 5주간 매주 체중 변화를 관찰하였다. 체중의 측정은 매일 오후 2시에 전자저울(Hansung, 서울, 한국)을 이용하여 실시하였다.
대상 데이터
- ß-Estradiol 17-valerate (EV, Sigma, USA) 및 Sesame oil 등의 기타 시약은 Sigma (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였다.
- 실험동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험실 환경은 온도 22±2℃를 유지하면서 12시간 단위로 낮과 밤이 계속되는 상황을 실험 종료 시까지 유지하였다.
- 구입, 정선한 肉桂 100 g을 증류수 1,000 ㎖과 함께 전기약탕기 (대웅, 한국)을 이용하여 3시간 동안 전탕한 후, 거즈로 걸러 전탕액을 얻었다. 위의 전탕액을 5,000 g에서 10분간 원심분리하여 찌꺼기는 버리고 상청액을 얻은 다음 동결건조기 (Labconco, Missouri, USA)를 이용하여 CC를 5.
- 본 연구에 사용된 EV는 cholesterol로부터 유리하는 스테로이드로 성호르몬의 일종이며, 실험적으로 다낭성난소증후군 유발에 사용된다15). 많은 다낭성난소증후군 환자에게서 비만, 당뇨병, 고지혈증 등이 발생함이 알려져 있고, 다낭성난소증후군의 치료 목적으로 체중제한 및 고지혈증 치료가 제안되고 있다16).
- 본 연구에 사용된 약재는 肉桂 (Cinnamomun cassia)의 줄기껍질로서 주피를 다소 제거한 것을 화림제약 (부산, 한국)을 통하여 구입, 정선하여 사용하였다.
- 실험동물은 160～180 g의 S/D계 암컷 백서를 샘타코(인천, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 1주일 이상, 고형사료(삼양 배합사료 실험동물용, 한국)와 물을 충분히 공급하면서 실험실 환경에 충분히 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
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3) 실험군의 선정
정상군 (Normal group)은 EV를 녹이지 않은 Sesame oil 200 ㎕를 대퇴부에 근육 주사하였다. 대조군 (Control group)과 실험군 (CC group)은 EV를 Sesame oil에 20 ㎎/㎏의 분량으로 녹여 마리당 200 ㎕씩 대퇴부에 근육 주사하였다.
- 공복 시 및 식이유지 시 혈당측정을 위하여 ACCU-CHEK GO 혈당측정시스템 (Roche, Germany)을 사용하였다. 혈액 내의 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride 함량은 각각의 Detection kit을 아산 제약 (인천, 한국)을 통하여 구입하여 사용하였다. ß-Estradiol 17-valerate (EV, Sigma, USA) 및 Sesame oil 등의 기타 시약은 Sigma (St.
데이터처리
- 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
- 실험 자료에 대한 통계적 분석은 통계 패키지인 Sigma plot(Sigma plot for Windows, ver. 9.0, U.S.A.)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 결과의 차이를 검정할 때에는 Student's t-test로 검정하여 p-값이 0.
이론/모형
- 공복 시 및 식이유지 시 혈당측정을 위하여 ACCU-CHEK GO 혈당측정시스템 (Roche, Germany)을 사용하였다. 혈액 내의 Total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, Triglyceride 함량은 각각의 Detection kit을 아산 제약 (인천, 한국)을 통하여 구입하여 사용하였다.
성능/효과
- 5주간 CC 투여가 끝난 후, 흰쥐의 혈액으로부터 HDL cholesterol 함량 변화를 관찰한 결과 모든 군에서 유의할 만한 변화를 관찰 할 수 없었다(Fig. 3).
- 5주간 CC 투여가 끝난 후, 흰쥐의 혈액으로부터 LDL cholesterol 함량 변화를 관찰한 결과 대조군에 비하여 CC 투여군에서 감소하는 경향을 보였으나 통계적으로 유의하지는 않았다(Fig. 4).
- 5주간의 CC 투여가 끝난 후, 흰쥐의 혈액으로부터 Total cholesterol 함량 변화를 관찰한 결과 대조군에서 95.8±9.6 ㎎/㎗로 나타나 59.1±18.1 ㎎/㎗를 보인 정상군에 비해 유의한 증가를 보였고, CC군에서는 69.3±10.7 ㎎/㎗로 대조군에 비하여 유의한 감소를 보였다(Fig. 2).
- EV 투여 첫 날 체중을 기준으로 하여 5주간의 체중 변화를 측정한 결과 정상군 (Normal)은 유의한 증가세를 보인 반면, 대조군 (Control)은 기준 체중과 유사한 수준의 체중을 유지하였다. CC군은 기준 체중에 비하여 경미하게 증가된 체중을 유지하다가 CC투여 4주 후부터 유의한 수준으로 대조군에서 보이는 체중 증가 억제 현상을 방지하였다(Fig. 1).
- EV 투여 첫 날 체중을 기준으로 하여 5주간의 체중 변화를 측정한 결과 정상군 (Normal)은 유의한 증가세를 보인 반면, 대조군 (Control)은 기준 체중과 유사한 수준의 체중을 유지하였다. CC군은 기준 체중에 비하여 경미하게 증가된 체중을 유지하다가 CC투여 4주 후부터 유의한 수준으로 대조군에서 보이는 체중 증가 억제 현상을 방지하였다(Fig.
- Estradiol valerate에 의해 유발된 고콜레스테롤 혈증에 肉桂 추출물 (CC)을 경구투여하면서 체중변화를 관찰하고, 실험 마지막 날 공복시 혈당 및 경구 당부하 검사 및 혈액으로부터 total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride 함량을 확인한 결과 대조군에서 나타나는 체중 증가율 감소를 효율적으로 방지하였으며, 혈중 total cholesterol 및 triglyceride 함량을 유의한 수준으로 감소시켰으나, 혈중 HDL cholesterol 및 LDL cholesterol 함량에는 특별한 영향을 미치지 않았다. 또한, 공복시 혈당 수준에는 특별한 영향을 미치지 않았고 경구 당부하 검사 결과 역시 특별한 당부하 감소 소견은 관찰되지 않았다.
- 이러한 결과는 CC가 이상지질혈증을 조절 해줄 수 있는 가능성이 있는 것으로 해석된다. 그러나, 고콜레스테롤 혈증에서 가장 주요한 기준으로 인식되고 있는 LDL cholesterol 함량에 대하여 감소시키는 경향을 보였으나 유의하지 않았고, HDL cholesterol 역시 특별한 변화를 보이지 않았다(Fig. 3, 4). 이러한 결과에 대하여 좀 더 명확한 원인과 기전을 규명하여야 한다고 생각한다.
- 6, 7). 또한, EV 투여에 의하여 체중 증가 억제 현상이 관찰되었다(Fig. 1). 이는 EV의 병리적 특성에 기인하는 것으로 사료된다.
- 본 연구에서는 계피 분말이 아닌 추출물을 사용하였으며 수율은 5%였으므로 본 연구에서 사용한 농도는 상호 비교를 위하여 환산하면, 상기한 논문의 5.0% 첨가군의 자료를 참고할 수 있을 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과를 살펴보면, 5주간의 EV 투여에 의하여 유의한 수준의 체중 증가 억제 현상을 보였으며, CC 투여는 이러한 체중 증가 억제 현상을 방지하는 경향을 보였다(Fig. 1). 일반적으로 다낭성난소증후군에서 체중을 감소시키는 것이 중요한 치료 방법에 속하지만16), 고용량의 EV는 식욕 부진을 일으켜 체중을 감소시킨다는 보고19)와 고용량 스테로이드 투여로 인한 체중감소는 동물 실험에서 부작용으로 취급된다는 것20)을 감안하면, 체중 증가 또는 감소에 대하여 단순한 결론을 내리기는 어려울 것으로 생각된다.
- 따라서, 고콜레스테롤혈증에 대한 관리는 다낭성난소증후군 뿐만 아니라 각종 심혈관계 질환의 예방 및 치료의 주요한 요소라고 할 수 있다3). 본 연구의 결과에서 CC는 EV투여에 의하여 증가된 혈중 콜레스테롤의 함량을 유의한 수준으로 낮추었으며(Fig. 2), 혈중 triglyceride 함량 또한 유의한 수준으로 낮추었다(Fig. 5). 이러한 결과는 CC가 이상지질혈증을 조절 해줄 수 있는 가능성이 있는 것으로 해석된다.
- 또한, 다낭성난소증후군에 종종 수반되는 인슐린 저항성의 측정에도 중요한 요소가 된다22). 본 연구의 결과에서 공복시 혈당 및 경구 당부하 검사 결과 CC 투여군에서 특별한 차이를 발견할 수 없었다(Fig. 6, 7).
- 실험 마지막날 흰쥐의 혈액으로부터 Triglyceride 함량 변화를 관찰한 결과 대조군에서 61.5±12.9 ㎎/㎗로 나타나 37.4±5.4 ㎎/㎗를 보인 정상군에 비해 증가하는 경향을 보였고, CC군에서는 46.9±8.9 ㎎/㎗로 대조군에 비하여 유의한 혈중 Triglyceride 함량의 감소를 관찰 할 수 있었다(Fig. 5).
- 실험 마지막날, 12시간 이상 절식하고 공복시 혈당을 측정한 결과 EV 투여에 의하여 특별한 공복시혈당 변화는 관찰되지 않았으며, CC 투여에 의해서도 특별한 변화는 관찰되지 않았다(Fig. 6).
- 이상의 결과를 정리하면, CC는 다낭성난소증후군에 수반되어 나타나는 혈중 total cholesterol 및 triglyceride의 증가를 효율적으로 방지할 수 있는 것으로 요약할 수 있다.
후속연구
- 이러한 결과들로부터 저자는 肉桂가 다낭성난소증후군에 수반되는 이상지질혈증을 개선해 줄 수 있음을 확인하였으며, 심혈관계 질환에 적용 가능성을 타진하는 연구에도 참고자료로 활용될 수 있으리라 생각한다.
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